JPH11228445A - エンドトキシンに誘導されるメディエーターによるリポプロテインリパーゼ抑制 - Google Patents

エンドトキシンに誘導されるメディエーターによるリポプロテインリパーゼ抑制

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JPH11228445A
JPH11228445A JP10315197A JP31519798A JPH11228445A JP H11228445 A JPH11228445 A JP H11228445A JP 10315197 A JP10315197 A JP 10315197A JP 31519798 A JP31519798 A JP 31519798A JP H11228445 A JPH11228445 A JP H11228445A
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JP
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mediator
cells
pharmaceutical composition
endotoxin
activity
Prior art date
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JP10315197A
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Anthony Cerami
セラミ，アンソニー
Masanobu Kawakami
カワカミ，マサノブ
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Original Assignee
Rockefeller University
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Publication date
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 哺乳動物におけるメディエーター物質の毒性
レベルを減少させ、哺乳動物におけるショックを治療
し、哺乳動物におけるショックの発生を予防し、そして
/または悪液質を治療するか、または肥満症を治療する
ための手段を提供する。 【解決手段】 メディエーター活性組成物を含む医薬組
成物、またはメディエーター活性組成物に対する抗体を
有する医薬組成物。上記メディエータ活性組成物は、同
化酵素であるリポプロテインリパーゼ、アセチル補酵素
Ａカルボキシラーゼ、および脂肪酸シンセターゼの活性
を抑制する生物学的活性を有し、そして（ａ）哺乳動物
から大食細胞の標本を集め、（ｂ）この大食細胞の一部
を、哺乳動物に対して侵入刺激を引き起こす刺激物質と
共に培養し、そして（ｃ）その大食細胞に該メディエー
ター活性組成物の生成を誘導することにより得られ、上
記メディエーター活性組成物に対する抗体は、上記生物
学的活性を中和可能である抗体である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は動物宿主における侵
入刺激の効果および作用の分析のための方法および関連
物質に関し、特にこのような侵入刺激が宿主中に存在す
る同化酵素の活性に及ぼす効果の機構および大きさに関
する。
【０００２】
【従来の技術】例えば細菌、ウイルス、原生動物の感染
および腫瘍、内毒素等の種々の侵入刺激に対する応答と
して種々の哺乳動物宿主には、いくつかの共通した物理
的および生化学的障害が見られる。例えばこれらの応答
は発熱、白血球症、食欲不振および活力低下、および筋
肉、白血球、肝臓の代謝における異常である。最近、原
形動物寄生虫であるトリパノゾーマ ブルセイに感染し
たウサギにおけるハイパートリグリセリデミアがＭＯ
Ｌ．ＢＩＯＣＨＥＭ．ＰＡＲＡＳＩＴＯＬ誌、第１巻、
３１〜３８ぺージ、１９８０年刊においてシー．エー．
ロウザーおよびエー．セラミにより報告されている。報
告されたハイパートリグリセリデミアは、末梢組織にお
ける酵素リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ）の活性に著
しい低下を伴う。
【０００３】ＬＰＬ活性は他にも観察されており、この
状態は人体がショック状態にある時に存在することが注
目される。参照文献としてはクー．ビー．マンほかによ
る“肝臓病患者における血清および肝臓の脂質”、Ｊ．
ＣＬＩＮ．ＩＮＵＥＳＴ．２４号、６２３ぺージ以下、
１９４５年；ジョン アイ．ガリンほか“感染における
血清脂質”、Ｎ．ＥＮＧＬ．Ｊ．ＭＥＤ．２８１号、１
０８１〜１０８６ぺージ、１９６９年１１月１３日刊；
ディー．ファルスチほか“ウサギの血清脂質に及ぼす三
種の細菌感染の影響”、Ｊ．ＢＡＣＴＥＲＩＯＬ，９５
号、１６１５ぺージ以下、１９６８年；エス．イー．グ
ロスベルグほか“ひなの胚におけるウイルス感染による
過糖脂質血症：新しいシンドローム”、Ｎａｔｕｒｅ
誌、ロンドン、２０８号、９５４ぺージ以下、１９６５
年；ロバート エル．ヒルシュほか、“細菌性エンドト
キシンを静脈内注射したウサギにおける過糖脂質血症、
脂肪過多肝臓およびブロモスルホフタレン停滞”、Ｊ．
ＬＩＰＩＤ．ＲＥＳ．５号、５６３〜５６８ぺージ、１
９６４年、サカグチ オサムほか“エンドトキシン注射
マウスにおける糖脂質新陳代謝の変化”、ＭＩＣＲＯＢ
ＩＤＬ．ＩＭＭＵＮＯＬ．２３（２）号、７１〜８５ぺ
ージ、１９７９年；アール．エフ．カムシュミット、
“エンドトキシン耐性Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスにおける部
分的に純化された白血球性内因的メディエーターの活
性”、Ｊ．ＬＡＢ．ＣＬＩＮ．ＭＥＤ．９５号、６１６
ぺージ以下、１９８０年；およびラルフ エフ．カンフ
シュシット、“白血球性内因的メディエーター”、Ｊ．
ＲＥＴ．ＳＯＣ．２３（４）号、２８７〜２９７ぺー
ジ、１９７８年がある。“メディエーター（ｍｅｄｉａ
ｔｏｒｓ）”の存在は少なくとも疑われていたにせよ、
エネルギー貯蔵細胞の一般的な同化活性に及ぼすその影
響（もしあるとすれば）は知られていなかった。本出願
の出願人はこれらメディエーターがある種の同化酵素の
活性に抑圧的な効果を及ぼすと考えた。それによる活性
の減退が侵入に対する応答として宿主がショック状態に
入った場合に観察された。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本出願人は、“メディ
エーター”現象のより深い検討を可能にするため、また
感染の余病および随伴ショックの治療に有用な実際的診
断ツールを提供するため、方法学の必要、また関連する
診断材料の必要があると考えた。出願人は、本願におけ
る開示はこの必要性に対する指針となると信ずる。
【０００５】
【課題を解決するための手段】従って、本発明において
は、エンドトキシン感受性およびエンドトキシン不感受
性マウスからの、エンドトキシン刺激腹膜マウス滲出細
胞により生産されるメディエーターと、同化酵素活性測
定のための試薬に関する開発との関係；３Ｔ３−Ｌ１
“プレアディポサイト”モデル系と関連するこの系のよ
り深い研究；“メディエーター”に対する抗体を開発す
るための方法および材料、同定のためのスクリーニング
方法；およびこれら“メディエーター”の活性を調整し
得る薬剤の開発；などはすべてその発明範囲に含まれる
ものである。
【０００６】
【発明の実施の形態】本発明の第一の局面によれば、哺
乳動物における同化酵素の状態を検定するために使用す
るメディエーターの調製方法が開示される。この方法
は、哺乳動物が例えばウイルス、細菌、原生動物、腫
瘍、エンドトキセミアその他の侵入刺激を受けている場
合に特に有用である。その最も単純な局面の場合、この
方法は哺乳動物から大食細胞標本を集め、この大食細胞
の一部を、侵入事態と関連する刺激物質と共に保温する
ことを含む。例えば刺激物質は、エンドトキセミア、ト
リパノゾーマの場合、また上述寄生原生動物であるトリ
パノゾーマ ブルセイその他の場合、エンドトキシンで
あってもよい。
【０００７】われわれの本出願および以前の出願におい
て示した腹膜滲出細胞は、大食細胞の入手源を例示して
いるが、このような細胞は腹膜域以外からも入手するこ
とができるのであって、本発明にはこのような変更も含
まれると理解されるべきである。
【０００８】大食細胞および刺激物質は記載するように
保温もしくは培養され、その後この大食細胞は、同化酵
素の活性を抑圧しうるメディエーター物質の生産を誘発
される。メディエーター生産の誘発は、好ましくは、例
えば約２０時間に及ぶ保温時間内に達成されるのがよ
い。生じた培地はメディエーター物質を回収するように
適切に処理される。例えば遠心分離し、メディエーター
物質含有表層物を引き出すか、あるいはメディエーター
を硫酸アンモニウムの４０〜６０％溶液と共に沈澱す
る。
【０００９】先に述べたように、メディエーター物質は
広い範囲の効果を有する。これには、例えばリポプロテ
インリパーゼ（ＬＰＬ）、アセチル補酵素Ａカルボキシ
ラーゼ、脂肪酸シンセターゼなどの同化酵素について観
察される抑制効果を含む。また赤血球形成における抑制
効果も含む。なぜなら後に特定の実施例で説明される例
えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヘキサメチレ
ンビスアセトアミド、ブチル酸、ヒポキサンチン等によ
りメディエーター物質は、赤血球の成長および分化を抑
制することがわかっているからである。
【００１０】本発明の別の態様は、一種又は数種の同化
酵素の活性を抑制する能力をもつゆえに、種々の侵入刺
激を検知する方法にかかわる。この方法においては、複
数の大食細胞標本が調製され、同化酵素に対する効果の
特徴がそれぞれ異なる多数の既知の刺激物質と共に選択
的に保温される。大食細胞標本の一つは感染刺激の想定
位置から得た材料と共に保温し、その後すべての標本を
上述方法に従って保温してもよい。その後、既知刺激物
質から由来するメディエーター物質を含む表層物のそれ
ぞれを試験することによって、存在する侵入刺激の同定
のための比較連続体を提供することができる。この試験
方法は、例えばリポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ）活性
を係数として使用する場合には、３Ｔ３−Ｌ１細胞系を
利用してよい。同様に、赤血球誘発因子が使用される場
合には、フレンドウイルス−変換エリスロロイケミア細
胞が保温され、その後観察される。参考文献として、フ
レンド, シー．, シャー，ダブリュ．ホランド ジェ
ー．ジーおよびサトー；Ｇ．ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣ
ＡＤ．ＳＣＩ．６８号、３７８〜３８２ぺージ；マーク
ス, ピー．エー．，リフキンド，アール．エー．，テラ
ダ，エム．，ルベンアール．シー．，ガジット，ワィ，
およびフィバッハ，イー ＩＣＮ−ＵＣＬＡＳｙｍｐｏ
ｓｉａ ｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌ
ｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｘ巻，“ヘマトポイエティッ
ク細胞分化”、ディー．ダブリュ．ゴルデ, エム．ジェ
ー．クライン，ディー．メトカルフおよびシー．エフ．
フォックス編集（Ａｃａｄｅｍｉａ Ｐｒｅｓｓ社、ニ
ューヨーク）、２５〜３５ぺージ、１９７８年；があ
る。当然のことであるが、特定の活性を適切に観察した
い場合には、他の細胞系も利用でき、本発明はこれに記
載される特定の細胞系にのみ限定されるものではない。
【００１１】本発明は、哺乳動物中におけるメディエー
ター物質活性を測定することにより哺乳動物中における
種々侵入刺激の存在を検知する方法にもかかわる。
【００１２】すなわち、多数のメディエーター物質を既
知刺激物質から調製し、これを夫々のメディエーター物
質の存在を検知し得る抗体を増殖させるために使用する
ことができる。これら抗体は公知のハイブリドーマ法に
よって調製できる。
【００１３】このハイブリドーマは、“Ｎａｔｕｒｅ，
Ｖｏ１．２５６（１９７５年８月７日号）”の第４９５
〜４９７頁に記載される如く、ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓ
ｔｅｉｎにより最初に調整されて以来、“ＴＨＥ ＪＯ
ＵＲＮＡＬ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．１２３
（１９７９年１０月４日号）”の第１５４８〜１５５０
頁に限らず、その他に“ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴ
ＩＢＯＤＩＥＳ（Ｒ．Ｈ．Ｋｅｎｎｅｔｔ，Ｔ．Ｊ．Ｍ
ｃＫｅａｒｎおよびＫ．Ｂ．Ｂｅｃｈｔｏｌ編集，１９
８０年Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ出版）”の特に１３７
〜１５２頁、や“Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏl．２７７（１９
７９年１月１１日号）”の第１３１〜１３３頁、や“Ｎ
ａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．２８５（１９８０年５月２２日
号）”の第２３８〜２４０頁および２５９〜２６１頁な
どにも、例えば融合マウス脾臓リンパ球と骨髄腫が掲載
され、この融合マウス脾臓リンパ球と骨髄腫か、あるい
はウサギ、ヤギその他の哺乳動物中につくることによっ
て調製できることが、１９８１年までに十分に確立され
ていた。
【００１４】上記公知のメディエーターおよびその抗体
は、適当にラベルして例えば血清中のメディエーター物
質の存在を試験するのに使用し、感性の程度を判断し、
その中のメディエーター物質の活性を観察することによ
り感染が増大しているか減少しているかを決定すること
ができる。
【００１５】本発明のこの局面により、種々の公知免疫
法を利用することができる。例えば、公知メディエータ
ー物質あるいはそれらと関連する抗体に対して検知可能
なラベルをすることによる単独あるいは二重抗体法があ
る。
【００１６】なお、このハイブリドーマは、例えばＪａ
ｍｅｓ Ｗ．Ｇｏｄｉｎｇの“Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒ
ｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ”につ
いての論文、“ＴＨＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＩＭＭＵＮＯ
ＬＯＧＹ Ｍｅｔｈｏｄｓ３９（１９８０年）”の第２
８５頁〜第３０８頁、や”ＬｙｍｐｈｏｃｙｔｅＨｙｂ
ｒｉｄｏｍａｓ（１９７９年）”中のＰｒｅｆａｃｅの
第ＸＶ頁に記載される如く、たとえ免疫化させる抗原
（ｉｍｍｕｎｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｇｅｎ）が純粋なか
たちでなくても免疫化のために使用される混合物中に含
有されていれば、抗原に対する特異的な抗体を調製でき
る。
【００１７】本発明の更に別の実施態様は、哺乳動物に
おけるショック発生防止方法に関し、この方法は、哺乳
動物におけるメディエーター物質のショック促進活性の
存在を検知し、その後哺乳動物におけるショックの進行
を防止するのに十分な量の、メディエーター物質の抗体
を投与する段階を含む。
【００１８】また、検定系が開示され、これはメディエ
ーター物質の合成あるいは活性を抑制しうる薬剤のスク
リーニング（ふるいわけ）のために準備される。前者の
場合、刺激大食細胞によるメディエーターの生産に及ぼ
す試験薬剤の効果が決定される。後者の場合、例えば３
Ｔ３−Ｌ１細胞のような細胞試験系に特定のメディエー
ターを導入し、次に得られた細胞培養体に対して試験薬
剤を導入し、その後、メディエーター活性の変化につい
て、薬剤単独の添加によるものか、あるいは既知メディ
エーター物質の添加量による効果に基づくものかを検査
する。
【００１９】多くの物質、化合物、試剤についてメディ
エーター物質の生産および活性に影響を与えるか否か決
定するための試験が既に行われた。後に詳細に説明され
るように、ステロイドであるデキサメタゾンのみが抑制
効果を有し、この効果はメディエーター物質の製造にの
み限定されているように見えた。しかしながら、このほ
かの薬剤、試剤などについてもデキサメタゾンについて
採用され記載されているように試験することもできる。
【００２０】メディエーター物質の調製およびその活性
の重要度の決定は、診断上又治療上の適用について種々
のルートの開発を生みだした。以上の説明および以后の
説明から、直接的にあるいは免疫診断上有用な抗体の開
発を通じてメディエーター物質の同定により侵入刺激の
検知がなされることは明らかである。更にこれら同じ抗
体が哺乳動物におけるショックの進展を避けるために、
メディエーター活性のコントロールによる直接的な治療
のために利用できるのである。一方メディエーター物質
は、メディエーター物質の有害効果を中和できる薬剤、
試剤その他の物質の同定のための検定系におけるスクリ
ーニング剤として使用し、それにより感染の有害な続発
症の治療が可能となる。
【００２１】従って本発明の主たる目的は、哺乳動物に
おけるメディエーター物質の有害な影響を緩和するか又
は避けるために有効な抗体を含む医薬組成物を提供する
ことである。
【００２２】更に詳しくは、メディエーター物質活性を
制御することにより、哺乳動物におけるショックの治
療、哺乳動物におけるショックの発生防止、および／又
は悪液質病の治療を行うための医薬組成物を提供するこ
とである。
【００２３】本発明のその他の目的および利点について
は、例示的な図面と関連する以下の説明から当業者には
明かであろう。
【００２４】詳細な説明 上述の如く、われわれは本願において「メディエーター
物質」と呼ぶ物質を発見した。これは本願において「刺
激物質」と呼ぶ物質による刺激に応答して哺乳動物細胞
中に生ずるものである。刺激物質は、侵入的な刺激、例
えば細菌、ウイルス、ある種の腫瘍、原生物質、その他
例えばエンドトキセミア等の毒素を伴うことを特徴とす
る。われわれはメディエーター物質が哺乳動物のある細
胞の新陳代謝を同化作用から異化作用に変える作用をも
つことを観察した。特にメディエーター物質はリポプロ
テインリパーゼ（ＬＰＬ）、その他の酵素および先に述
べた誘導剤等の同化酵素の活性を抑制するように考えら
れる。これらメディエーター物質は理論的には哺乳動物
における免疫系とエネルギー貯蔵組織の間の連絡系の一
部である。従って先述したような哺乳動物における種々
の侵入刺激に応答してこれらメディエーター物質は、脂
肪性組織、例えば筋肉、肝臓等が侵入に対して斗うため
にエネルギーが必要な場合にエネルギー貯蔵組織に対し
て影響を及ぼすために生みだされると理論づけられる。
更に詳しくいうとこれらメディエーター物質はエネルギ
ー貯蔵組織に対して同化作用状態から異化作用状態に変
える作用をなし、それによりこれらエネルギーの供給が
容易であるようにする。侵入が短期間である場合には、
哺乳動物は急速に回復しそのエネルギー貯蔵を補充す
る。しかしながら侵入が慢性的なものである場合、完全
なエネルギーの枯渇、悪液質および死亡が生じうる。
【００２５】上述の考察をする初期研究の間に、メディ
エーターを調製する方法が開発された。その説明は先ず
実施例ＩのパラグラフＤに述べられており、これによれ
ば腹膜滲出細胞が適当に培養され、その後、既知刺激物
質エンドトキシンの存在下に保温された。保温後、大食
細胞はメディエーター物質を生ずるように誘発される。
ある面においてはこのような誘導は長い保温期間にわた
って生ずることもあり、またこの期間は変化するもので
あるから、本発明は特定の期間に限定されるものではな
い。
【００２６】その後、メディエーター物質を細胞培養基
から回収し、本明細書に開示されている一種あるいは二
種の方法で、将来使用するために保存する。回収は遠心
分離および沈澱を含む種々の公知技術のいずれかによっ
て行われる。例えば実施例ＩのパラグラフＤに記載され
る培養を遠心分離し、表面に浮かぶものをその後とり出
した。あるいはメディエーターを硫酸アンモニウムの４
０〜６０％溶液で沈澱させるかあるいはＤＥＡＥセルロ
ースあるいは同様の交換樹脂で吸着させてもよい。メデ
ィエーター物質回収のための特定の方法の選択は当業者
によっては自明である。
【００２７】本発明はまた、メディエーター物質の存在
および活性を測定することにより哺乳動物宿主における
侵入刺激の存在を検知する方法に関する。既に述べたよ
うに、メディエーター物質は例えば融合したマウス脾臓
リンパ球および骨髄腫細胞を用いるハイブリドーマ法を
含む種々の公知方法により、ウサギ、ヤギ、ヒツジその
他の哺乳動物に抗体を生じさせるために使用できる。抗
体は標準的な方法により分離でき、疑わしい哺乳動物宿
主におけるメディエーター物質の存在試験に利用でき
る。
【００２８】更に、抗体は更に抗体を作るためさながら
抗原のように他の種類に利用できる。抗体は哺乳類、特
にヒトの血清におけるメディエーター物質の存在を決定
するために使用でき、それにより例えばバクテリア、ウ
イルスあるいは原虫類の感染などの侵入刺激の存在、あ
るいはある種の腫瘍の存在を決定するために使用するこ
とができる。以下の説明のため、メディエーター活性に
対する抗体をＡｂ１と呼び、別の種類におけるメディエ
ーター活性をＡｂ２と呼ぶ。
【００２９】患者の血清中に毒素レベルまでメディエー
ター物質の存在することが疑われている患者には、その
存在は、そのような決定に適用可能な通常の免疫学的な
手法により確かめられる。多くの有用な手法が知られて
いる。特に有用な手法の三つは、検知可能なラベルをラ
ベルしたメディエーター、検知可能なラベルをラベルし
た抗体Ａｂ１、検知可能なラベルをラベルした抗体Ａｂ
２を利用するものである。これらの方法は以下の式に要
約でき、式中＊印は分子がラベルされていること、また
“Ｍｅｄ”はメディエーター物質を示す。
【００３０】 Ａ． Ｍｅｄ＊＋Ａｂ１＝Ｍｅｄ＊Ａｂ１ Ｂ． Ｍｅｄ＊＋Ａｂ１＊＝ＭｅｄＡｂ１＊ Ｃ． Ｍｅｄ＋Ａｂ１＋Ａｂ２＊＝ＭｅｄＡｂ１Ａｂ２＊ これらの方法および適用は当業者にはよく知られてお
り、従って本発明の範囲内で交換可能に利用できるもの
である。“競合的”方法、即ち方法Ａは米国特許第３，
６５４，０９０号および３，８５０，７５２号に記載さ
れている。方法Ｃ、”サンドイッチ方法”は米国特許第
ＲＥ３１，００６号および第４，０１６，０４３号に記
載されている。このほかの方法も知られており、二重抗
体法あるいは“ＤＡＳＰ”法などがある。
【００３１】いずれの場合にもメディエーター物質は抗
体と共に複合体を作り、これら複合体を構成する分子の
一つは検知可能ラベルでラベルされている。複合体が形
成されていること、および所望する場合その量は、ラベ
ルの検知に適用できる公知方法により決定できる。
【００３２】上述の説明からＡｂ２の特性は、これがＡ
ｂ１と反応するものであることがわかるであろう。これ
は、一つの哺乳動物種における抗体Ａｂ１が他の種にお
いて抗体Ａｂ２を作るための抗原として使用できた、と
いうことによる。例えばＡｂ１は、Ａｂ１を抗原として
ヤギ中に作ることができる。Ａｂ２は、従ってヤギに作
られるウサギ耐性抗体でありうる。本明細書および請求
の範囲において、Ａｂ１はメディエーター活性抗体と呼
ばれ、またＡｂ２はメディエーター活性抗体に反応する
抗体あるいは”抗−抗体”と呼ばれる。
【００３３】これらの研究に最もよく使用されるラベル
は放射性元素、酵素、紫外線に曝されると蛍光を発する
化学物質、その他である。
【００３４】多数の蛍光性物質が知られており、ラベル
として使用できる。これらには例えばフルオレセイン、
ローダミンおよびオーラミンが含まれる。好ましい検知
物質は、イソチオシアネートを通じてフルオレセインと
結合しヤギ中に調製されるウサギ抗性抗体である。
【００３５】メディエーター組成物はまた放射性素子あ
るいは酵素をラベルすることができる。放射性ラベルは
現在適用可能なカウンティング方法のいずれかにより検
知できる。好ましい同位元素は14Ｃ，131Ｉ，3Ｈ，125
Ｉおよび35Ｓである。酵率ラベルは今日適用可能な比色
法、スペクトル分析、蛍光スペクトル分析、ガスクロマ
トグラフィのいずれかの方法で検知可能である。酵素は
カルボジイミド、ジイソシアネート、グルタールアルデ
ヒド等の架橋分子との反応により、選ばれた粒子と結合
している。これらの方法に使用できる酵素は多く知られ
ており、利用できる。好ましいものはペルオキシダー
ゼ、β−グルクロニダーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、
β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオ
キシダーゼ＋ペルオキシダーゼ、ガラクトースオキシダ
ーゼ＋ペルオキシダーゼおよび酸ホスファターゼであ
る。米国特許第３，６５４，０９０号；３，８５０，７
５２号；４，０１６，０４３号は、ラベル物質の開示の
例として挙げられるものである。
【００３６】哺乳動物体におけるメディエーター活性の
高レベルのものは哺乳動物体に有毒であり、不可逆的な
ショックの原因となることがある。メディエーターに特
有の抗体は、この代謝異常のある宿主を治療するのに有
用である。患者にはメディエーターの少くとも一部を中
和するため例えば抗体のショック緩和可能な有効量を非
経口的に投与して治療をすることができる。投与量はも
とよりよく知られており医者には理解されているファク
ターに応じて変更され、これらは患者の年令、体重、一
般的な健康およびメディエーターの濃度である。
【００３７】本発明の更に別の実施態様においては、医
療専門家により使用に適した商業的な試験キットを調製
し、それにより疑いのある宿主にメディエーター物質が
存在するか否かを決定するようにできる。上述の試験方
法によれば、このようなキットの一つの種数では、少く
ともラベルしたメディエーターあるいはこれに結合した
物質、およびこれに特有の抗体を含む。別のキットはラ
ベルしたＡｂ２と共に少くともＡｂ１を含む。更に別の
キットは少なくともＡｂ１と、選ばれた方法、例えば
“競合的”、“サンドイッチ”、“ＤＡＳＰ”等の方法
にもとより依存する指令を含む。キットは更に緩衝剤、
安定剤等の周辺反応剤も含む。
【００３８】従って試験キットは血清あるいは水性媒体
中のメディエーター物質を検知するための種々の素子と
共に調製できる。第一キットは： （イ） メディエーター物質あるいはその特有の結合パ
ートナーと直接あるいは間接に結合することにより得ら
れる少くとも一つのラベルした免疫−化学的反応成分の
所定量； （口） その他の反応剤；および （ハ） 前記キットの使用のための指令；を含むように
して調製される。
【００３９】更に特定すると、侵入刺激に対する哺乳動
物反応の実証のための診断試験キッ．トは： （イ） 一般的に固体相で免疫ソルベントに結合されて
いるかあるいは適当なタグ、あるいは二種のメディエー
ター（あるいはその結合パートナー）の一つに結合され
ている上述の一種のメディエーター物質（あるいはその
結合パートナー）の公知量； （口） 必要な場合、他の反応剤；および、 （ハ） 前記試験キット使用のための指令；を含むよう
にして調製される。
【００４０】補足的なキットは種々の現存する免疫学的
プロトコルおよび方法を利用して構成することができ、
そのような変更は発明の範囲内であることが理解されよ
う。
【００４１】本発明の更に別の局面においては、上述メ
ディエーターに特有の抗体に対しては、ウイルス、細
菌、原虫類等により発生するショックに応答する薬学組
成物を投与するようにしてもよい。これら薬学的組成物
は： （イ） 薬学的に有効量の抗体；および（口） 薬学的
に受けいれられる担体、からなる。
【００４２】適当な流体の助けにより抗体は溶液の形で
注射用製剤として使用できる。これら組成物は侵入／シ
ョックの効果を、かりに克服できないにせよ消散するた
め、上述の態様でショックを緩和量投与することができ
る。
【００４３】抗体の成長と上述方法によるその使用の手
助けとして、本発明は例えばショックなど哺乳類宿主に
おける好ましくない程度に高レベルのメディエーター物
質活性の結果として考えられる種々の条件下の治療方法
にもかかわる。この場合本発明方法は、特定のメディエ
ーター物質の存在および活性の検知、次に好ましくはメ
ディエーター物質の活性を中和するため有効量の適当な
抗体を宿主に投与することを含む。
【００４４】逆に哺乳動物におけるある種の不利な条
件、例えば肥満が、過度の抗体活性から生ずることがあ
る。例えば肥満は、同化酵素であるリポプロテインリパ
ーゼ、アセチル補酵素Ａカルボキシラーゼおよび脂肪酸
シンセターゼの活性が好ましくない程度に高レベルであ
ることから生ずる。従って本発明は、肥満の治療方法で
あって、受けいれられる形態であって適当な体重に復活
するために有効な量のメディエーター物質の投与を含む
方法にもかかわる。このような治療のための投与は、し
かしながら、医者の厳重な監視下に行われなければなら
ず、またメディエーターの投与量、態様、頻度は注意深
く決定され不断に監視されていなければならない。
【００４５】特定のメディエーター物質により生ずる抗
体による治療に加え、本発明は、特定のメディエーター
物質の合成あるいは活性を抑制するための例えば薬剤、
製剤などの物質の測定系に関する。既に述べたように、
例えば３Ｔ３−Ｌ１およびフレンドウイルス変換エリス
ロロイケミア細胞のような適当な細胞培養体に対して適
当なメディエーターにより一次処理を行って特定の同化
酵素の活動を抑制し、その後適当な薬剤を添加し、得ら
れた細胞培養体を観察して、同化酵素の活性の変化が生
じたか否かを決定する。以上の記載はある測定のための
特定の細胞培養体に関するものではあるけれども、本発
明がそれに限定されるものでないことは理解されるべき
である。
【００４６】メディエーターの生産および／もしくはメ
ディエーターの効果を抑制するか否かを決定するため、
ある化合物は既に検討されている。試験された化合物お
よびそれら試験の結果を以下の表１に示す。
【００４７】
【表１】 表１からわかるように、デキサメタゾンのみが効果を有
するようである。このデキサメタゾンすらもメディエー
ター生産に効力があるだけであって、初期にのみ効力が
ある。メディエーターが生産された後では、このデキサ
メタゾンはもはやそれ以上のインパクトを与えないよう
に見える。
【００４８】以下の実施例はある同化酵素等と関連しつ
つメディエーター物質の分離、およびその活動に関わ
る。これらを検討することによって本発明の起原および
可能性についてより深い理解が得られるであろう。しか
しながら当然特定の物質および方法は既に述べたように
変動するものであるから、以下は説明的なものであり、
本発明を限定するものではない。
【００４９】
【実施例】実施例Ｉ メディエーター活性組成物の分離 Ａ．試験に使用したマウス：雄のＣ３Ｈ／ＨｅＮエンド
トキシン感受性マウス（７〜１０週：１８〜２５ｇ）
を、チャールズ リバー ブリーディング研究所（マサ
チューセッツ州、ウィルミントン）から入手した。雄の
Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ、エンドトキシン耐性マウス（７〜１０
週：１８〜２５ｇ）をザ ジャクソン研究所（メイン
州、バー ハーバー）から入手した。マウスは使用でき
るまでローデントラボラトリー チャウ（ミズーリ州セ
ントルイス、ラルストン ピュリナカンパニー）で任意
量の給餌を与えた。チャウの給餌は夫々の実験２４時間
前に除去し、水に２５％サクロースの溶液と代えた。こ
れらのマウスは一旦注射后は水にのみ近づきうるように
した。３匹〜１０匹のＣ３Ｈ／ＨｅＮあるいはＣ３Ｈ／
ＨｅＪマウスを夫々の実験群として採用した。
【００５０】種々の実験を行うにあたり、夫々のマウス
は次のいずれかを腹腔内で注射した：（ｉ）０．０４〜
１００μｇのエンドトキシン；（ｉｉ）エンドトキシン
あるいは食塩水で処理したＣ３Ｈ／ＨｅＮマウスから得
られた血清 ０．５ｍｌ；（ｉｉｉ）エンドトキシンの
存在あるいは存在しない状態で保温したマウス腹膜滲出
細胞の培養体からの血清１ｍｌ。マウスは首を切ること
により死んだ。
【００５１】Ｂ．血清トリグリセリド濃度の検定および
組織リポプロテインリパーゼ活性 トリグリセライド濃度は酵素検定により測定した（トリ
グリセリド試験セット９６１号、テキサス州ヒュースト
ン、ハイセル インコーポレィテッド）。リポプロテイ
ンリパーゼ活性はパイカリストほか（ＰＲＯＣ．ＳＯ
Ｃ．ＥＸＰ．ＢＩＯＬ．ＭＥＤ．，１４８号，２９７ぺ
ージ，１９７５年刊）；およびタスキンほか（ＤＩＡＢ
ＥＴＯＬＯＧＩＡ １７号，３５１ぺージ，１９７９年
刊）による方法に若干の変更を加えることにより検定し
た。副睾丸脂肪褥は、夫々のマウスの首を切った後直ち
に実施した。組織を、２％ウシ血清アルブミン（フラク
ションＶ、アリゾナ州フェニックスのレハイス ケミカ
ル カンパニー）を含有する殺菌したダルベコ改変イー
グル培地（ＤＭＥ）でゆすぎ、殺菌したフィルター紙に
吸わせた。この組織をはさみで刻み、あらかじめ重量を
測った殺菌ポリプロピレン培養管（１７×１００mm、メ
リーランド州 コッキスビル、ディッキンソンアンド
カンパニー、ファルコンディビジョン オブ ベクト
ン）に入れた。この培養管は２％ウシ血清アルブミンを
補足した１ｍｌのＤＭＥ培地、およびＬＰＬ（Ｌｉｐ−
Ｈｅｐｉｎ，カリフォルニア州ノースリッジ，リカーラ
ボラトリーズ インコーポレーテッド）を解放するため
ヘパリン２Ｕを含んでいた。この組織を封入した管を５
％ＣＯ2、残りを空気で密閉し室温にて常時ゆるやかな
振動を与えつつ放置した。組織重量は、組織を添加前と
添加后との重量差で決定した。ほぼ１００〜３００ｍｇ
の組織がとりだされ、組織から解放されたリポプロテイ
ンリパーゼの活性が測定された。
【００５２】酵素検定はニルソン−エールおよびショッ
ツ、Ｊ．ＬＩＰＩＤ．ＲＥＳ．１７号、５３６ぺージ、
１９７６年の方法に僅かの変更を加えて実施された。こ
の標本を３７℃で９０分間培養した。夫々の標本は二重
に検定した。酵素活性の１ミリユニットは１分あたり解
放された遊離酸の１ナノモルと定義された。湿った組織
１グラムから解放される酵素活性をそれぞれの研究にお
ける実験群と比較群との間で比較した。なぜならＬＰＬ
活性には日毎に相当の変動があるからである。実験相互
のデータを比較するため、データ値を比較群の平均活性
の百分比として表示した。Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウスで観察
された範囲は脂肪性組織について３２〜５９ｍＵ／ｇで
あった。Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスにおいて脂肪性組織の３
１〜１７２ｍＵ／ｇの値が観察された。
【００５３】Ｃ．エンドトキシン処理マウス血清の採取 ０．１ｍの食塩水中にエンドトキシン（２〜１００μｇ
／マウス）を溶かしたものあるいは食塩水のみを注射し
た２時間後、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウスの補助小窩から殺菌
条件下で血液を得た。血清は出液后１時間以内に調製
し、直ちに使用するか使用するまで−８０℃で保存し
た。
【００５４】Ｄ．エンドトキシン処理腹膜滲出細胞の調
製 腹膜滲出細胞はＣ３Ｈ／ＨｅＮマウス（２５〜３３ｇ）
から発熱質のない食塩水（イリノイ州ノースシカゴ、ア
ボット ラボラトリーズ）で腹膜洗浄することにより得
た。これらマウスは、細胞生産を増大させるために洗浄
する６日前に、３ｍｌのブレワー社製チオグリコレート
媒液（ディフコ ラボラトリーズ、ミシガン州デトロイ
ト）を注射した。このようにして得られた腹膜滲出細胞
はほぼ６０％の大食細胞、２０％の小さいリンパ球、１
５％の大きいリンパ球および５％のエオシノフィルから
なり立っている。
【００５５】この滲出細胞（２×１０６細胞／ウエル）
を、３７℃で５％ＣＯ2中に４．５cm2ウエルを含有する
培養皿中で血清を含まないＲＰＭＩ−１６４０培地（ニ
ューヨーク州グランドアイランド、ギブコ社）中で保温
した。３時間後この培養体をこの培液で３回洗い、非付
着細胞を除去した。皿に付着した細胞は主として大食細
胞であった。種々の試験方法において、細胞はエンドト
キシン（１０μｇ／ｍｌ）の存在下にあるいは存在する
ことなく血清のないＲＰＭＩ−１６４０培地中で保温し
た。この培養液は２６時間の保温で除去し、４℃で５分
間１０００ｇで遠心分離した。この浮上物を直ちに試験
に使用するか、あるいは試験のために使用するまで−８
０℃で保存した。このような条件下で１ヵ月保存して後
も活性には相違がなかった。
【００５６】種々の研究および分離方法を以下に説明す
る。
【００５７】Ｅ．マウス中に生じたメディエーター活性 死亡１６時間前に食塩（比較例あるいは１００μｇのエ
ンドトキシン）を注射したエンドトキシン感受性マウス
の脂肪性組織および血清トリグリセライド濃度のＬＰＬ
活性を観察した。エンドトキシンのこの量はこの系統の
マウスの半数が注射后３日間で死ぬ量に対応する。エン
ドトキシン処理マウスにおける脂肪性組織のＬＰＬ活性
は比較例値の４．５％に低下し、一方エンドトキシン処
理マウス血清のトリグリセリド濃度は、比較例における
マウスの値の２．６倍に上昇した。
【００５８】ＬＰＬ活性の低下が、エンドトキシンによ
る刺激の結果として生ずるメディエーター活性に起因す
るものであってエンドトキシンそれ自体に起因するもの
でないという事実は、出血前２時間前に１００μｇのエ
ンドトキシンで処理したエンドトキシン感受性マウスの
血清を他の群のエンドトキシン感受性マウスに注射する
時に生ずる結果により支持される。この試験のため、比
較群は、発熱質のない食塩水を注射したエンドトキシン
感受性マウスの別の群から得られた血清を注射された。
副睾丸肥大パッドのＬＰＬ活性を１６時間后に測定し
た。
【００５９】図１（Ａ）で図示したように、エンドトキ
シン処理マウスからの血清は、比較群の活性に比し、こ
れら処理マウスのＬＰＬ活性を著しく抑圧した。エンド
トキシンの９０％以上が１５分以内に循環からはずれる
ことが知られているから、ＬＰＬ活性に及ぼす影響は、
注射２時間後に血清中に存在するエンドトキシンの直接
的な影響でないことは明らかである。これは、エンドト
キシン注射の結果として生ずる体液性因子あるいはメデ
ィエーターによって生ずるに違いないと思われる。
【００６０】直接的なエンドトキシン効果を更に除去す
るために、少量（２μｇ）のエンドトキシンを注射して
２時間后のマウスのエンドトキシン感受性Ｃ３Ｈ／Ｈｅ
Ｎ種から得られた血清をエンドトキシン耐性Ｃ３Ｈ／Ｈ
ｅＪマウスに注射した。脂肪組織のＬＰＬ活性は、直接
的なエンドトキシン効果の可能性を最少限にするために
１６時間后に測定し、図１（Ｂ）に示す如くＬＰＬ活性
が５５％減少していることがわかった。耐性動物はこの
少量のエンドトキシンに応答しないから、この結果は、
耐性マウスが応答しうる体液メディエーターが含まれて
いることを再び確証するものである。
【００６１】Ｆ．マウスの腹膜滲出細胞でつくられるメ
ディエーターの活性 滲出細胞が刺激されてメディエーターを生産し、それに
よりエンドトキシンが脂肪組織のＬＰＬ活性を抑圧する
ことを示す実験を行った。滲出細胞は、エンドトキシン
感受性（Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ）マウスの腹膜洗浄により得
た。これら細胞はエンドトキシンの１０μｇ／ｍｌの存
在あるいは不存在下に試験管中で保温した。これら細胞
培養体からの培地１ｍｌをＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスのエン
ドトキシン耐性種に注射した。図２に示すように、エン
ドトキシンで培養した滲出細胞培地を注射した動物の脂
肪組織における平均ＬＰＬ活性は、エンドトキシン添加
なしの細胞培養体からの培地、もしくはエンドトキシン
を含有する培地（但し無細胞）のいずれかを受けたマウ
スにおけるＬＰＬ活性の３２％であった。エンドトキシ
ン処理細胞培養体からの培地で処理した動物と、食塩水
のみで処理した動物との酵素活性における相違は、他の
比較例との差よりもはるかに大きく、このことは、少量
メディエーターがエンドトキシンの不存在下における滲
出細胞により解放されたこと、また細胞のない培地中に
おける少量のエンドトキシンがＬＰＬ活性を部分的に低
下させるのに十分であることを示している。
【００６２】上記からエンドトキシンの投与が、エンド
トキシンショックおよび死亡に敏感なマウス種における
脂肪組織ＬＰＬを著しく抑圧することは明らかである。
この作用は、エンドトキシンショックに対して敏感であ
るマウスのみならず敏感なマウスにおける脂肪組織ＬＰ
Ｌを抑圧することのできる体液ファクターがメディエー
ターとなりうる。エンドトキシンに対して敏感な腹膜滲
出細胞はまたこの体液メディエーターを生産する能力を
もつ。
【００６３】Ｇ．マウスの腹膜滲出細胞からのメディエ
ータ活性組成物の分離 培養基は、２４〜３６時間エンドトキシン１０μｇ／ｍ
ｌに曝されたＲＰＭＩ−１６４０成長培地中で培養され
たマウス腹膜滲出細胞を４℃で１０分間５００ｒｐｍで
遠心分離することにより得た。この表層物、１０，００
０ダルトンカットオフのアミコンＰＭ−１０膜で限外濾
過をした。これを濾過により濃縮して約７ｍｌとし、セ
ファクリル３００カラム（１．６９５cm）上に載置し、
４ｍｌ／時間、４℃でリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）
（ＰＨ７．４）で溶出させた。夫々のフラクション（留
分）の容量は３．６ｍｌであった。このフラクションの
ＬＰＬ活性を分析した。１０８〜１１５ｍｌおよび１３
３〜１４０ｍｌで溶出したフラクションがＬＰＬ検定の
ために活性であることがわかった。これらフラクション
におけるメディエーター活性組成物の分子量はそれぞれ
約３００，０００および７０，０００ダルトンであっ
た。
【００６４】限界濾過から得た凍結乾燥したろ液を蒸留
水の最少量に溶解し、セファデックスＧ５０カラム
（１．６×９５ｍｌ）でクロマトグラフ処理し、６ｍｌ
／時間の流速で、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）により溶出化し
た。３ｍｌのフラクションが集められ、ＬＰＬ活性を分
析された。活性は１７０〜１７９ｍｌで溶出するフラク
ションに位置し、これは分子量約４００〜１，０００ダ
ルトンに相当するものである。
【００６５】平均的な分子量は、既知分子量のタンパク
質との比較による標準的な方法により決定された。標準
タンパク質はフェリチン、分子量４４０，０００ダルト
ン；ウシ血清アルブミン、分子量６８，０００；カルボ
ニック アンヒドラーゼ、分子量３０，０００；および
リボヌクレアーゼ、分子量１７，０００；すべて単位は
ダルトンである。当業者にはよく知られているように、
この方法で決定される分子量は正確には約２０％であ
る。
【００６６】メディエーター活性組成物は、以下の手順
によってミレックス膜（ミリボアコーポレーション、マ
サチューセッツ州ベッドフォード）を用いて真空透析に
よりマウスの腹膜滲出細胞から分離することもできる。
【００６７】真空透析は分子量カットオフが１３，００
０〜１４，０００ダルトンである透析管中で実施され
る。エンドトキシン処理滲出細胞培養体から得られる条
件つき培地標本を真空下に６時間、容積を４０％減じて
４℃で放置した。バッグの内側および外側からの部分標
本をメディエーター活性のため検定した。
【００６８】活性のすべては１２，０００ダルトン孔カ
ットオフを有する膜で真空透析の間、保持されることが
わかった。従ってこの方法により分離されるメディエー
ター組成物は、１２，０００ダルトン以上の分子量を有
する。この組成物は、既に述べた二つの高い分子量組成
物を含有する。最も分子量の低い組成物が得られない理
由は明らかではない。おそらくミレックス膜中に吸収さ
れるかあるいはアミコン（Ａｍｉｃｏｎ）フィルターを
用いた方法の方がより迅速であるからであろう。
【００６９】熱に対する種々メディエーター組成物の安
定性は、１００℃で１５分間加熱することにより検定さ
れた。リポプロテインリパーゼに対するメディエーター
の抑制効果はこの処理により完全に阻止された。
【００７０】メディエーターが非処理細胞の細胞内成分
であるか否かを決定するために、滲出細胞を超音波処理
し、抽出物をそのメディエーター活性について検定し
た。これら抽出物は測定可能なメディエーターを有して
いなかった。従ってこのメディエーターは滲出細胞の通
常の細胞内物質ではなく、エンドトキシンによる刺激に
続き細胞内で合成あるいは生成されたものである。
【００７１】メディエーター活性組成物が腹膜滲出細胞
の組織培養体の組織培養液中にあるという事実から、こ
れらが水溶性であることが明かである。
【００７２】従ってこのメディエーターは哺乳動物体に
おけるＬＰＬ活性を減少させることができ、標準的な方
法で分離することができる。
【００７３】Ｈ．３Ｔ３−Ｌ１プレアディポサイトの研
究 メディエーター組成物の性質は、本発明者および共同研
究者であるピー．ペカラおよびエム．ディー．レーンに
よりよく知られた３Ｔ３−Ｌ１“プレアディポサイト
（ｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅ）”モデル系を用いて更に
研究された。３Ｔ３−Ｌ１プレアディポサイトはもとも
とマウス胚フイブロブラストからクローン化されたもの
で、これはアディポサイトの生物学的および形態学的特
徴を有する細胞内の単層培養体から分化したものであ
る。アディポサイト変換の間、３Ｔ３−Ｌ１細胞は、デ
ノボ脂肪酸合成およびトリアシルグリセロール合成の酵
素中で等位上昇を示した。同様に、脂質代謝の別のキー
酵素であるリポプロテインリパーゼの活性はアディポー
ゼ変換の間に８０〜１８０倍上昇した。この酵素の活性
は、培地中のインシュリンの存在によって高められ、脂
肪組織のリポプロテインリパーゼと同様であるように見
えた。
【００７４】３Ｔ３−Ｌ１プレアディポサイト細胞系統
の細胞を使用することにより、上述エンドトキシンに曝
されたマウス腹膜滲出細胞に由来するメディエーター組
成物の添加が、リポプロテインリパーゼの活性を抑圧す
ることがわかった。
【００７５】３Ｔ３−Ｌ１細胞培養研究に使用されるエ
ンドトキシンは上述のようにして得られた。細胞培地お
よびウシ胎児血清は、ギブコラボラトリーズ（ニューヨ
ーク州ロングアイランド）から得られた。３−イソブエ
ル−１−メチルキサンチンはオルドリッチケミカル（ウ
イスコンシン州ミルウォーキー）から得られ、デキサメ
タゾンはシグマケミカルカンパニー（ミズーリ州セント
ルイス）から、またインシュリンはイーライリリーコー
ポレーション（イリノイ州アーリントンハイツ）から得
られた。トリオラインはヌチェック プレプ インコー
ポレーテッド（ミネソタ州エリシアン）から得られた。
結晶ウシ血清アルブミンはカルビオケミーべーリング
コーポレーション（カリフォルニア州ラヨラ）から得ら
れた。
【００７６】Ｉ．３Ｔ３−Ｌ１細胞培養体 ３Ｔ３−Ｌ１プレアディポサイトは既に開示されている
ように（マッカルほか、Ｊ．ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ．２５
１号、６４６２ぺージ、１９７６年刊；コー．ケー．ス
チューデントほか、Ｊ．ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ．，２５５
号，４７４５〜４７５０ぺージ、１９８０年）、１０％
ウシ胎児血清を含有するダルベユの修正イーグルズ培地
（ＤＭＥ培地）中で培養した。アディポサイト フェノ
タイプに至る分化は、スチューデントほか、ルビンほか
（Ｊ．ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ．２５３号，７５７０〜７５
７８ぺージ，１９７８年）の方法の修正方法により誘導
された。交会２日後、培地は１ｍｌあたり０．５ｍＭの
イソブチル−メチルキサンチン、１μＭデキサメタゾン
および１０μｇのインシュリンが補充された。４８時間
后、イソブチル−メチルキサンチン、デキサメタゾンお
よびインシュリンを含有する培地はインシュリンを１ｍ
ｌあたり５０ｎｇの低下した濃度を有する培地と交換さ
れた。
【００７７】Ｊ．３Ｔ３−Ｌ１細胞に及ぼすメディエー
ター組成物の効果 培地がインシュリン濃度の低下した培地と交換されて一
時間后、エンドトキシン添加あるいは添加しない培養滲
出細胞からの条件つき培地を３Ｔ３−Ｌ１細胞培養体に
添加した。条件つき培地と共に細胞を２０時間まで保温
した。リポプロテインリパーゼ活性の量は所定回数以下
の三つの区について測定した：（１）培地の活性；
（２）ヘパリンとの保温に続き細胞から解放された活性
（この活性は細胞膜の外表面と関連する酵素を表す）；
および（３）細胞内活性。
【００７８】培地を除いて後、皿を新鮮な培地で一度洗
浄し、細胞膜と関連するリポプロテインリパーゼを、ヘ
パリン（１０Ｕ／ｍｌ）およびインシュリン（５０ｎｇ
／ｍｌ）を補充したＤＭＥ培地中で１時間保温すること
により解放した。この培地を移動して後、皿をＰＢＳで
洗い、細胞をヘパリン３Ｕ／ｍｌ含有するｐＨ８．１で
５０ｍＭのＮＨ３／ＮＨ４Ｃｌの１ｍｌ中に掻き入れ
た。
【００７９】懸濁液は（氷上で）１５秒間超音波処理
し、５分間５００×ｇで遠心分離した。浮上物をリポプ
ロテインリパーゼについて検定した。
【００８０】リポプロテインリパーゼ検定は、ニルセン
−エーレおよびショッツによる方法（Ｊ．ＬＩＰＩＤ．
ＲＥＳ．１７号，５３６×５４１ぺージ，１９７６年）
を僅かに修正して、二重に標本を調製後３０分以内に実
施した。簡単にいうと、７５μｌの酵素を、２２．７ｍ
Ｍ〔3Ｈ〕−トリオライン（１モルあたり１．４ｕＣ
ｉ，１ｍｌあたり２．５のレシチン、１ｍｌあたり４０
ｍｇのウシ血清アルブミン、３３％（Ｖ／Ｖヒト血清お
よび０．２７Ｍのトリス−ＨＣｌ、ＰＨ．８．１中にお
ける３３％（Ｖ／Ｖグリセロール）を含有する基質２５
μｌと混合し、３７℃で９０分間保温した。１ミリユニ
ットの酵素活性は１分間あたり１ナノモルの脂肪酸の解
放として定義された。三つの区すべてにおけるリパーゼ
活性は、１ＭのＮａＣｌの添加により＞９０％に抑制さ
れ、酵素活性に必要なアポリポプロテインＣ−II源であ
る血清を落すことにより＞８０％に抑制された。
【００８１】３Ｔ３−Ｌ１細胞のリポプロテインリパー
ゼ活性に及ぼすメディエーターの効果を試験するため、
エンドトキシンの存在あるいは不存在のもとで培養され
たマウス腹膜滲出細胞から得られる条件つき培地を、単
層培養体中の３Ｔ３−Ｌ１細胞に添加した。３７℃で２
０時間保温后、リポプロテインリパーゼ活性は３つの区
で評価された：（１）培地；（２）細胞表面（ヘパリン
解放可能リパーゼ活性）および；（３）細胞内フラクシ
ョン。
【００８２】図３の欄ＡおよびＣに示されているよう
に、エンドトキシン刺激滲出細胞からのメディエーター
物質を含有する培地の添加は、三つのすべての区でリポ
プロテインリパーゼ活性を著しく抑圧する。培地、細胞
表面上（ヘパリン解放可能）、および細胞内室における
酵素活性は、同量の新鮮なＲＰＭＩ−１６４０培地で保
温した比較細胞のそれぞれ０．１％、６％、１８％であ
った。アディポサイトの形態あるいは範囲における差異
は、実験群細胞を比較群細胞の間にはみられなかった。
研究初期において、ほぼ２０％の細胞が細胞質における
トリグリセリド集積を示した。２０時間后、実験群およ
び比較群細胞の両方のほぼ５０％がトリグリセライドを
集積した。
【００８３】エンドトキシンで処理されていない滲出細
胞の培養体からの培地は、３Ｔ３−Ｌ１細胞のリポプロ
テインリパーゼ活性に殆んど影響を与えかなった。未処
理滲出細胞からの培地は図３Ｂ欄に示す研究でいくらか
の抑制を誘発したが、別の同様の研究においては、同様
に調製された培地は抑制効果を示さなかった。エンドト
キシン自体も、エンドトキシン処理滲出細胞からの条件
つき培地に残るかもしれぬ量に等しい量を添加した時に
は、リポプロテインリパーゼ活性に無視できる程度の抑
制効果しか示さなかった。１９％、９％、および０％の
減少が培地、ヘパリン離脱可能区および細胞内区に観察
された。この減少率は、図３Ｄに示すように大量（４．
５培）のエンドトキシンが使用された時にはより大きい
ものであった（培地で４５％、ヘパリン離脱可能で１７
％、細胞中で１１％）。
【００８４】上述したリポプロテインリパーゼの減少し
た活性の説明としては、酵素に及ぼすメディエーターの
直接的な抑制効果を挙げることができる。これは、エン
ドトキシン処理滲出細胞培養体からの条件つき培地と共
にリポプロテインリパーゼを含有する３Ｔ３−Ｌ１細胞
培養体からの培地を保温することにより検査された。酵
素活性は混合時にメディエーター組成物により抑制され
ること、酵素活性の減衰速度は実験群と比較群とも同じ
であることがわかった。エンドトキシンもまたリポプロ
テインリパーゼの活性に影響をもたなかった。この結果
はメディエーター組成物が、酵素の細胞内合成あるいは
生産を抑制することにより３Ｔ３−Ｌ１におけるリポプ
ロテインリパーゼ活性を抑圧することを意味している。
【００８５】メディエーター組成物の量と３Ｔ３−Ｌ１
細胞のリポプロテインリパーゼ活性との関係は、エンド
トキシン処理滲出細胞からの条件つき培地の増大量と共
に細胞を２０時間３７℃で保温することにより検査され
た。培地１．５ｍｌに添加した１０μｌの条件つき培地
は、リポプロテインリパーゼ活性を実質的に減少させる
のに十分であった。即ち培地において５７％の減少、ヘ
パリン解放可能区において４０％の減少および細胞内で
８％の減少があった。酵素活性は、メディエーター含有
培地の量を増大させることにより更に抑圧された。２５
０μｌが添加された時、三つのすべての区で９５％以上
の減少が観察された。条件つき培地に存在するメディエ
ーターの量は、調製毎に若干バラつきがあった。
【００８６】メディエーター添加后リポプロテインリパ
ーゼ活性が低下する速度もまた検査された。メディエー
ター含有条件つき培地が選ばれた間隔毎に添加され、そ
してリポプロテインリパーゼ活性が測定された。リパー
ゼ活性の減少は、３Ｔ３−Ｌ１細胞の添加后僅かに３０
分で明らかとなった。細胞内酵素活性のほぼ半分が２．
５時間后に失われた。メディエーターと共に保温５時間
后、最大効果が観察された。培地中および細胞表面上の
酵素活性の量もまた、同様の時間で（データは示されて
いない）減少することが観察された。
【００８７】リポプロテインリパーゼ活性の急速な減少
は、インシュリンとの競合も考えられる。なぜならイン
シュリンの除去は、３Ｔ３−Ｌ１細胞のリポプロテイン
リパーゼ活性の迅速な低下を招くことが示されているか
らである。しかしながら、培地中のインシュリン濃度を
増大させることによるメディエーターの抑制効果を逆転
させようとする試みは成功しなかった。この研究のた
め、種々の濃度（５０ｎｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌ）の
インシュリン含有培地と共に３Ｔ３−Ｌ１細胞の保温効
果が、リポプロテインリパーゼ活性について検定され
た。酵素活性に及ぼすメディエーターの抑制効果は、イ
ンシュリン濃度を増大することによって変化することは
ない。標準条件（５０ｎｇ／ｍｌ）のそれよりも１００
０倍大きいインシュリン濃度であっても、抑制効果は逆
転することはない。
【００８８】実施例II ３Ｔ３−Ｌ１細胞の他の同化活性がメディエーターで抑
制されるであろうことを推論して、われわれは二つのキ
ー酵素：（１）アセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ；お
よび（２）脂肪酸シンセターゼ；をデノボ脂肪酸バイオ
合成について研究した。本発明者および共同研究者であ
るピー．ペカラ，エム．ディーレーン，およびシー．ダ
ブリュ．アンガスにより準備された原稿に基づく以下の
実施例は、これら酵素の合成は大食細胞メディエーター
の添加によっても抑制される証拠を呈示している。この
結果はメディエーターの大きな役割を示しており、また
免疫細胞と哺乳動物のエネルギー貯蔵細胞との間の連絡
系の存在を指摘するものである。おそらく侵入の間免疫
細胞は内分泌系の後を果たすことができ、侵入を撃退す
るためにエネルギーを選択的に動員するものであろう。
【００８９】Ａ．材料 先述ウエストファルの方法により分離したＥ．ｃｏｌｉ
０１２７：Ｂ８からのエンドトキシン（リポポリサッ
カライド）をディフコラボラトリーズ（ミシガン州デト
ロイト）から購入した。細胞培地およびウシ胎児血清は
ギブコラポラトリーズ（ニューヨーク州グランドアイラ
ンド）から入手した。３−イソブチル−１−メチルキサ
ンチンはオルドリッチチケミカル（ウイスコンシン州ミ
ルウォーキー）から；デキサメタゾンはイーライリリー
（インディアナ州インディアナポリス）から；ＩｇＧ−
ＳＯＲＢはエンジムセンター インコーポレーテッド
（マサチューセッツ州ボストン）から；Ｌ−〔35Ｓ〕メ
チオニン（８００〜１４４０Ｃｉ／ｍモル）はアマシャ
ムから；Ｅｎ３Ｈａｎｃｅはエヌイーエヌ，（マサチュ
ーセッツ州ボストン）から；脂肪酸シンセターゼに対す
る抗血清はパパニコラウ キャンサー リサーチインス
ティチュート（フロリダ州マイアミ）のファザルアシマ
ッド博士から提供された。
【００９０】Ｂ．３Ｔ３−Ｌ１細胞培養体 ３Ｔ３−Ｌ１プレアディポサイトは１０％ウシ胎児血清
を含むダルベコ改変イーグル培地（ＤＭＥ培地）中で既
に述べたような方法（マッカルほか、Ｊ．ＢＩＯＬ．Ｃ
ＨＥＭ．２５１号，６４６２ぺージ，１９７６年）で培
養した。アディポサイトフェノタイプに至る分化は、ル
ビンほかの方法（Ｊ．ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ．２５３号，
７５７０ぺージ，１９７８年）の修正方法（エー．ケ
ー．スチューデントほか、Ｊ．ＢＩＯ．ＣＨＥＭ．２５
５号，４７４５〜４７５０ぺージ，１９８０年）により
誘発された。交会２日後、培地に０．５ｍＭイソブチル
−メチルキサンチン、１μＭデキサメタゾンおよび１ｍ
ｌあたり１０μｇのインシュリンを補充した。４８時間
後、イソブチル−メチルキサンチン、デキサメタゾン、
およびインシュリンを含有する培地をとり除き、１ｍｌ
あたり５０ｎｇの減少濃度のインシュリンを含有する培
地と取り換えた。
【００９１】Ｃ．腹膜滲出細胞およびメディエーター物
質の調製 腹膜滲出細胞は死亡６日前に殺菌したブレワーのチオグ
リコレート培地（ディフコラボラトリーズ、ミシガン州
デトロイト；マウス１匹あたり３ｍｌ）を腹膜内注射し
たＣ３Ｈ／ＨｅＮマウス（２５〜３３ｇ；チャールズブ
リーディングラボラトリーズ、マサチューセッツ州ウイ
ルミントン）を腹膜洗浄することにより得た。この方法
を使用することにより得た滲出細胞は、いくらか不純な
ライモフオサイトを含む主として大食細胞である。
【００９２】この細胞（４×１０５細胞／cm２ｄ）は３
時間血清のないＲＰＭＩ−１６４０培地中で保温し、そ
の後非粘着細胞を培地で３回洗浄することにより除去し
た。皿に粘着する細胞は主として大食細胞であった。こ
れら細胞は１０μｇ／ｍｌのエンドトキシンの存在下に
あるいは不存在下に血清のないＲＰＭＩ−１６４０培地
中で更に保温した。２４時間後、培地を除去し４℃で５
分間１０００×ｇで遠心分離した。エンドトキシンに曝
された細胞から得られた条件つき培地の浮上物を検定
し、３Ｔ３−Ｌ１細胞のＬＰｂを低下させるメディエー
ター物質を含有することがわかった。条件つき培地を１
ヵ月間−８０℃で保存した後、活性に差が見られた。
【００９３】Ｄ．３Ｔ３−Ｌ１細胞に及ぼすメディエー
ターの効果 培地を、少ない濃度のインシュリンを含有する培地でと
り代えた１時間後、添加したエンドトキシンと共にある
いはエンドトキシンなしに培養した滲出細胞から得た条
件つき培地を３Ｔ３−Ｌ１細胞培養体に添加した。条件
つき培地と共に細胞を２０時間に至るまで保温した。
【００９４】Ｅ．細胞質タンパク質のラベリング 誘発３Ｔ３−Ｌ１細胞を含有する６cmプレートを、５ｍ
ｌのメチオニンのない培地で２度洗浄し、０．５ｍＣｉ
のＬ−〔35Ｓ〕−メチオニンを含有する同じ培地２ｍｌ
を１時間保温した。その間、細胞質タンパク質中への〔
35Ｓ〕−メチオニンの結合速度は直線的であった。培地
を除去し、細胞単層をｐＨ７．４のリン酸塩緩衝食塩水
で二度洗浄し、可溶性細胞質タンパク質を、既に述べた
マカールほかのディジトニン法により解放した。膜フラ
クションを含有する細胞単層の残りを次に、０．５％の
非イオン性浄化剤ＮＰ−４０および１ｍＭのフェニルメ
チルスルホニル−フルオライドを含有するｐＨ７．５の
１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝剤２．０ｍｌ中に掻き入れ
た。パスツールピペット中に滴定后、この懸濁液を４℃
で１０分間１０，０００×ｇで遠心分離し、浮上物を除
いた。
【００９５】〔35Ｓ〕−メチオニンの不溶性材料中への
結合は、２０μｌのディジトニンあるいはＮＰ−４０解
放材料を、担体として添加された２５μｌの０．５％ウ
シ血清アルブミンと共に０．５ｍｌの氷冷２０％ＴＣＡ
に添加することにより行った。４℃で１時間坐らせた
後、この混合物を５分間２，０００×ｇで遠心分離し
た。このペレットを３７℃で３０分間、０．５ｍｌの１
ＭのＮＨ４ＯＨ中で保温した。このタンパク質を氷冷１
０％ＴＣＡの５．０ｍｌ添加により再沈澱させワットマ
ンＧＦ／Ｃフィルターで濾過した。この濾過物をジエチ
ルエーテルで抽出し、放射性ラベルの量を決定した。
【００９６】Ｆ．免疫吸収電気泳動 細胞単層の可溶（ディジトニン解放）フラクションから
の可溶〔35Ｓ〕−メチオニン−ラベルタンパク質の部分
標本を作りＰＭＳＦ１ｍＭ、ＮＰ−４０洗浄剤０．５％
を、アセチルＣｏ（補酵素）Ａカルボキシラーゼあるい
は脂肪酸シンセターゼに特有のアンチロラに添加した。
２５℃で２時間后、１００μｌの１０％ＩｇＧ−ＳＯＲ
Ｂを添加し、ラベル酵素を既に述べたスチューデントほ
かの方法によりこの混合物から分離した。ポリアクリル
アミド−ＳＤＳゲルをラエムリ法により作り、製造者の
指示によりＥｎ３ハンスの方法に基づいて間接撮影法が
行われるようにした。
【００９７】Ｇ．結果−アセチル補酵素Ａカルボキシラ
ーゼおよび脂肪酸シンセターゼに及ぼすメディエーター
の効果 アセチル補酵素Ａカルボキシラーゼおよび脂肪酸シンセ
ターゼ酵素の活性に及ぼすメディエーター物質の効果を
検査するために、エンドトキシンの存在下で培養したマ
ウスの腹膜滲出細胞から得た条件つき培地に３Ｔ３−Ｌ
１細胞を曝した。この３Ｔ３−Ｌ１細胞をメディエータ
ーと共に３、６および２０時間保温した後、細胞のディ
ジトニン解放細胞質フラクション上でアセチル補酵素Ａ
カルボキシラーゼおよび脂肪酸シンセターゼ活性を決定
した（図４）。両酵素の活性は２０時間后、最初の値の
ほぼ２５％に低下した。
【００９８】両酵素の活性損失がタンパク質合成の直接
的な効果の結果であるかどうかを決定するため、３Ｔ３
−Ｌ１細胞を３、６および２０時間、エンドトキシン処
理滲出細胞の培養体から得た条件つき培地と共に保温し
た。保温の最后の時間の間、細胞を35Ｓ−メチオニンの
パルスに曝した。このパルスに続き、35Ｓ−メチオニン
をラベルしたアセチル補酵素Ａカルボキシラーゼおよび
脂肪酸シンセターゼを免疫吸着によりディジトニン解放
可能細胞質フラクションから分離した。同定はＳＤＳ−
ポリアクリル−アミドゲル電気泳動および間接撮影法
（図５Ａおよび図６Ａ）により行われた。免疫吸着可能
アセチル補酵素Ａカルボキシラーゼおよび脂肪酸シンセ
ターゼヘの35Ｓ−メチオニンの減少した結合、およびそ
れにつづくメディエーターへの露出時間は容易に観察さ
れた。放射能写真（図５（Ｂ）および図６（Ｂ））の密
度計測的スキャニングの結果は、メディエーターに２０
時間曝した後、脂肪酸シンセターゼおよびアセチル補酵
素Ａカルボキシラーゼ中に結合する35Ｓ−メチオニンの
量がそれぞれ８０％および９５％減少したことを示して
いた。これらの結果は、メディエーターが酵素の合成に
干渉することによりアセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ
および脂肪酸シンセターゼの活性を抑圧するという考え
と両立するものである。
【００９９】Ｈ．タンパク質合成一般に及ぼすメディエ
ーターの効果 アセチル補酵素Ａカルボキシラーゼおよび脂肪酸シンセ
ターゼに及ぼす観察された効果は、メディエーターによ
るタンパク質合成の一般的な抑制により説明することが
できよう。この可能性を検討するために、タンパク質中
へのアミノ酸結合に及ぼすメディエーターの効果を調べ
た。３Ｔ３−Ｌ１細胞を種々の時間にわたり、エンドト
キシンの存在下に培養したマウス腹膜滲出細胞から得た
条件つき培地で保温した。可溶性であり膜と結合するタ
ンパク質中への35Ｓ−メチオニン結合を、細胞１、３お
よび６時間他のファクターに曝した後決定した。３Ｔ３
−Ｌ１細胞がエンドトキシン不存在下で培養したマウス
腹膜滲出細胞から得た条件つき培地に曝した時には、酸
不溶性タンパク質中への35Ｓ−メチオニン結合にはなん
の効果も観察されなかった。しかしながら、図７からわ
かるように、可溶性フラクション（ディジトニン解放可
能タンパク質）中のＴＣＡ沈澱可能材料中へ 35Ｓ−メチ
オニン結合することによって最初の３時間でほぼ１０％
増加したが、そのほかの変化は観察されなかった。一方
膜フラクション（ＮＰ−４０溶出タンパク質）中の酸不
溶材料にラベル結合する場合には５０％の減少が観察さ
れた。メディエーターに曝した後35Ｓ−メチオニンをラ
ベルしたタンパク質の分析はＳＤＳ−ゲル電気泳動を利
用して行われた。ディジトニン処理により得られた可溶
タンパク質および３Ｔ３−Ｌ１細胞のＮＰ−４０により
溶出したタンパク質の放射能写真のパターンは、図８お
よび図９に示されている。図８を詳細に検討すると、分
子量２２０，０００ダルトンのタンパク質帯域のメディ
エーター添加に続いて時間の経過と共に漸次消失してゆ
くことが観察され、一方他の帯域では分子量がほぼ１
８，０００で現われる。これらの主要な変化に加え、別
の新しいタンパク質はほぼ８０，０００で現われ、第二
のタンパク質は５０，０００で消失する。
【０１００】ＮＰ−４０溶出タンパク質の分析は同様の
結果を示している（図９）。分子量が約８０，０００お
よび３０，０００ダルトンのタンパク質帯域が現われる
一方、約２２０−および５０，０００の帯域は消失し
た。
【０１０１】ディジトニン解放可能タンパク質における
分子量２２０，０００のタンパク質帯域の損失は、免疫
吸着可能アセチル補酵素Ａカルボキシラーゼおよび脂肪
酸シンセターゼの損失と矛盾しない。酵素は同様な分子
量を有し、この電気泳動条件下で同じＲｍと共に移動す
る。現在のところ公知酵素あるいはタンパク質と共に他
のタンパク質帯域を同定することは可能ではない。
【０１０２】Ｉ．分析 メディエーターは酵素の合成を抑圧することにより酵素
活性を減少させるように見える。タンパク質合成に及ぼ
す効果は極めて特徴的である。なぜなら放射能写真に観
察されるタンパク質パターンの大きな動揺がないからで
ある（図８および図９）。メディエーターに対する応答
においていくつかのタンパク質の合成が抑制されるか誘
発される。合成がメディエーターにより抑制される二つ
のタンパク質として、免疫沈澱により脂肪酸シンセター
ゼおよびアセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ（分子量２
２０，０００）を同定することが可能であった。メディ
エーターにより調節される他のタンパク質の同定は現在
可能ではない。もっともリポプロテインリパーゼは、５
０，０００ダルトンタンパク質として可能性のある候補
者である。メディエーターに対する応答として誘発され
るタンパク質の性質および特定のタンパク質合成の調製
メカニズムは、より深い研究に十分に値いする。
【０１０３】アセチル補酵素Ａカルボキシラーゼおよび
脂肪酸シンセターゼの合成を調整することができるメデ
ィエーターが、リポプロテインリパーゼの活性を抑制す
るメディエーターと同じであるかどうかは現在知られて
いない。筋肉から肝臓ヘアミノ酸を新陳代謝させるとい
われている白血球ファクターに対するこれらメディエー
ターの関係はかなり興味をひく。なぜならこのファクタ
ーもまた組織に異化状態付与するからである。
【０１０４】実施例III 本発明者と共同研究者であるササシゲルにより準備され
た未刊行原稿により具体化されたこの一連の研究におい
て、われわれは実施例ＩおよびIIで観察された大食細胞
メディエーターが赤血球合成にいずれかの影響を及ぼす
ものか否かを決定することを試みた。貧血は慢性の感染
症に悩む哺乳類に一般的にみられ、赤血球の再生はエネ
ルギーおよびアミノ酸の消耗をもたらすものであるか
ら、猛烈な侵入に対して動物体はその応答として、アデ
ィポサイトに影響を及ぼすリポプロテインリパーゼ、ア
セチル補酵素Ａカルボキシラーゼおよび脂肪酸シンセタ
ーゼなどの同化酵素についてみられるのと同じ態様、か
つおそらく同じ機構で赤血球の生産が阻害されることに
なると我々は考えた。
【０１０５】この仮説を検討するため、われわれはマウ
ス大食細胞から得られるエンドトキシン誘発因子が、モ
デル赤血球生産細胞−フレンドウイルス変換エリスロロ
イケミア細胞（フレンド、シーほかおよびマークス，ピ
ー．エーほか、既述、参照）の細胞増殖および分化に及
ぼす影響を検査した。このモデル系において多数の誘発
体、例えばジメチルスルホキシド（フレンド，シー．ほ
か、既述）、ヘキサメチレンビスアセトアミド（ロイバ
ン，アール．シーほか、ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡ
Ｄ．ＳＣＩ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，７３号，８６２〜８６６
ぺージ）、ブチル酸（レダー，エーほか，１９７５年，
細胞５号，３１９〜３２２ぺージ）およびヒポキサンチ
ン（グゼラ，ジェー．エフ．，１９７６年，細胞８号，
２６３〜２６９ぺージ）に対する応答として細胞を分化
させヘモグロビンを生成することを誘発させることがで
きる。この実施例は、大食細胞が赤血球放出細胞の成長
および分化を抑制することができるが、非放出幹細胞に
はあまり影響がなく、十分に分化した赤血球細胞には実
際上影響がないことの証拠を呈示するものである。
【０１０６】Ａ．材料 ウェストファル（既述）の方法により分離されたＥ．コ
リ０１２７：Ｂ８から得られるエンドトキシン（リポポ
リサッカライド）をディフコ（ミシガン州デトロイト）
から購入した。修正Ｆ１２培地を我々の実験室で調製し
た（サッサ，エスほかＪ．ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ．２５２
号，２４２８〜２４３６ぺージ，１９７７年）。ウシ胎
児血清をギブコ（ニューヨーク州グランドアイランド）
から購入した。ジメチルスルホキシド（Ｍｅ2ＳＯ）は
イーストマン オーガニック ケミカルズ（ニューヨー
ク州ロチェスター）の製品であった。ブチル酸およびヒ
ポキサンチンはシグマケミカル カンパニー（ミズー州
セントルイス）から得た。ヘキサメチレンビスアセトア
ミド（ＨＭＢＡ）はメルク シャープ アンド ドーム
リサーチ ラボラトリーズ（ニュージャージー州ローウ
ェイ）のアール．シー．ルベン博士から提供された。
【０１０７】Ｂ．細胞培養 マウスのフレンド−ウイルス変換エリスロロイケミア細
胞（クローンＤＳ−１９）が既に開示された（サッサ，
エス．グラニック；ジェー．エル．，アイゼン，エイ
チ、およびオステルターク，ダブリュ．１９７８年、エ
リスロポイエシスの試験管内の様相、マーフィー，エ
ム．ジー．ジュニアにより編集；スプリンガーフェルラ
ーク社、ニューヨーク、２６８〜２７０ぺージ）ように
して、１０％熱不活性ウシ胎児血清を補給した修正Ｆ１
２培地で培養した。
【０１０８】Ｃ．マウスの滲出細胞培養体から得たエン
ドトキシン刺激をうけた条件つき培地の調製 ＮＣＳマウス（ロックフェラーユニバーシティ ブリー
ディング コロニーから得た体重２５〜３３ｇのもの）
から得た腹膜滲出細胞の分離、およびエンドトキシン刺
激をうけた条件つき培地の試験管内調製は、既に述べた
ようにして（実施例Ｉ）実施された。簡単には、腹膜滲
出細胞は、ディフコラボラトリーズ（ミシガン州デトロ
イト）から得た殺菌したブレワーのチオグリコレート培
地で処理したマウスから、死亡前６日目に１マウスあた
り３ｍｌの量で分離して得た。この細胞を血清のないＲ
ＰＭＩ−１６４０培地中で３時間保温し、次に非粘着細
胞を培地で３回洗浄することによりゆすぎ落した。皿に
粘着する細胞は主として大食細胞であった（カワカミほ
か、ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．，ＵＳ
Ａ，７９号，９１２〜９１６ぺージ；エーゲルソン，ピ
ー．エス．ほか、Ｊ．ＥＸＰ．ＭＥＤ．，１４２号，１
１５０〜１１６４ぺージ，１９７５年）。
【０１０９】これら細胞を更にエンドトキシンの存在下
に（５μｇ／ｍｌ）血清のない培地中で２４時間保温し
た。保温後、培地を除去し１０００×ｇで５分間４℃で
遠心分離した。この条件つき培地の表層物はエンドトキ
シン誘発メディエーターを含有しており、これは３Ｔ３
−Ｌ１細胞（実施例Ｉ中に記載）中のリポプロテインリ
パーゼの活性を減少させ、更に処理を加えることなく使
用された。
【０１１０】Ｄ．赤血球分化の誘発 フレンド細胞の赤血球分化を検定するため、二種の保温
成績表が使用された。図１０〜１３に示す実験におい
て、細胞（５×１０４細胞／ｍｌ）は３７℃、湿潤空気
で５％ＣＯ2下で１８時間保温した。誘発化学剤、即ち
Ｍｅ2ＳＯ、ＨＭＢＡ、ブチル酸、ヒポキサンチンある
いはヘミンが大食細胞メディエーターと共にあるいはメ
ディエーターなしに添加し、培養体を成育培地に変化を
加えることなく９６時間保温した。他の実験、例えば図
１４に示す結果を表わすような実験では、細胞（１０５
細胞／ｍｌ）を１８時間保温し、次にＭｅ2ＳＯと大食
細胞メディエーターを上述の如く添加した。この培養体
は、化学誘発剤および大食細胞メディエーターあるいは
化学誘発剤のみを含む新鮮な培地で細胞懸濁液を毎日稀
釈することにより、２×１０５細胞／ｍｌに保持した。
この手順は、最初の実験手順よりも多い大食細胞メディ
エーターを必要としたが、細胞が対数的に一定速度で成
長している間、細胞の成長速度に及ぼすメディエーター
の効果を検査することが可能であった（チャン，シー．
エス．ほか、Ｊ．ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ．２５７号，３６
５０〜３６５４ぺージ，１９８２年）。
【０１１１】Ｅ．ヘム含量の決定およびヘムバイオ合成
経路における酵素活性の検定 細胞中のヘム濃度は、鉄分の除去の後ポルフィリン誘導
体の蛍光測定検定により決定された（サッサ，エス．，
グラニスエス．，チャン，シー．およびカパス，エ
ー．；ジェー．ダブリュ．フィッシャーおよびエフ．タ
カク編集“赤血球造血において”、東京大学出版、東
京、１９７５年、３８３〜３９６ぺージ）。ヘモグロビ
ンを含有する細胞はベンジディンで汚しシトグラフモデ
ル６３００Ａ（サッサ，エス．，グラニック，ジェー．
エル．，アイゼン，エイチ．，およびオステルターク．
ダブリュ．，既述）を用いてカウントした。アミノレブ
リニック酸（ＡＬＡ）デハイドラターゼおよびポルホビ
リノーゲン（ＰＢＧ）デアミナーゼの検定を先述方法
（サッサ，エス．，グラニック，ジェー．エル．，アイ
ゼン，エイチ．，およびオステルターク，ダブリュ．，
既述）により実施した。
【０１１２】Ｆ．非誘発フレンド細胞の成長および分化
に及ぼす大食細胞メディエーターの効果 エンドトキシンと共にあるいはエンドトキシンを加えず
に保温した大食細胞培養体から得た条件つき培地は、未
処理フレンド細胞の成長を約３５％（図１０、パート
Ａ）抑制した。これら細胞を１．５％Ｍｅ2ＳＯと共に
保温したところ、エンドトキシンに曝されない比較例の
条件つき培地は細胞成長を４２％抑制し、一方エンドト
キシン刺激条件つき培地は成長を６０％まで抑制した
（図１０、パートＢ）。
【０１１３】エンドトキシン刺激を受けたかもしくは刺
激を受けない培地で処理したこれら細胞中のヘム含量
は、未処理細胞中のヘム含量とあまり相違がなく、この
ことは、条件つき培地それ自体はフレンド細胞の赤血球
分化に影響を及ぼすものでないことを示している（図１
０、パートＢ）。これと対照的に、Ｍｅ2ＳＯおよびエ
ンドトキシン刺激培地と共に細胞を保温すると、細胞中
のヘム含量が著しく減少（〜４０％）する（図１０、パ
ートＢ）。
【０１１４】Ｇ．大食細胞メディエーターによる細胞成
長および分化の、投与量に依存する抑制 フレンド細胞が、１．５％Ｍｅ2ＳＯおよびエンドトキ
シン刺激大食細胞メディエーターと同時に保温された時
には、細胞成長の速度は、培養体に増大量のメディエー
ターが添加された時には漸進的に抑制された（図１１、
パートＡ）。細胞成長に及ぼすメディエーターの抑制
は、検査された最も低い濃度で検知された（１．１２容
量％が成長培地に添加された）。最も高い濃度（８容量
％）では、メディエーターは、比較例のＭｅ2ＳＯ処理
培地のそれに較べ細胞成長を〜６０％抑制した（図１
１、パートＡ）。細胞数の減少は細胞の死滅によるもの
ではない。なぜならトリパンブルー排除試験（パウル
ジェー．“細胞培養”）により検定したところ死滅細胞
数は未処理比較例と、刺激条件つき培地で処理した培養
体とで同じ（〜８％）であった。エンドトキシンそれ自
体（１５μｇ／ｍｌまで）は、Ｍｅ2ＳＯの存在下でも
不存在下でもフレンド細胞の成長に抑制的な効果を与え
なかった（データは示されていない）。これらの事実
は、エンドトキシン刺激大食細胞メディエーターが未処
理細胞よりもＭｅ2ＳＯ処理細胞の成長により大きく干
渉すること、また赤血球に方向付けられた（ｃｏｍｍｉ
ｔｔｅｄ）細胞は刺激を受けた大食細胞メディエーター
に対し方向付けられていない幹細胞よりも感受性が高い
ことを示している。
【０１１５】エンドトキシン刺激大食細胞で細胞を処理
することによりＭｅ2ＳＯメディエーター赤血球分化を
抑制し、その結果、メディエーターの量が増加するにつ
れ処理細胞中のポルフィリンおよびヘム含量の漸進的減
少が生じた（図１１、パートＢ）。ＡＬＡデハイドラタ
ーゼおよびＰＢＧデアミナーゼの酵素活性もまたメディ
エーター処理により減少した（図１１、パートＢ）。酵
素検定混合物に直接大食細胞メディエーターを添加する
ことにより、ＡＬＡデハイドラターゼあるいはＰＢＧデ
アミナーゼの活性を抑制するようなことはなく（データ
は示されていない）、これは酵素活性への直接的な抑制
効果を除外するものである。
【０１１６】Ｈ．赤血球分化に及ぼすエンドトキシン刺
激大食細胞メディエーターの遅延した添加の効果 エンドトキシン刺激条件つき培地を種々回数Ｍｅ2ＳＯ
処理培養体に添加した時には、細胞成長に及ぼす大食細
胞の影響は徐々に失われた（図１２）。
【０１１７】赤血球分化に及ぼす大食細胞メディエータ
ーの影響は、細胞成長に及ぼす影響よりも迅速に減少し
た。例えばエンドトキシン刺激大食細胞メディエーター
の添加はヘムおよびプロトポルフィリン組成を保温の初
期に〜４０％抑制し、２４時間後には〜２５％、また４
８時間後あるいはそれ以后では影響がなかった。大食細
胞メディエーター処理によるＡＬＡデハイドラターゼお
よびＰＢＧデアミナーゼ活性の抑制は、メディエーター
を保温中、後になって添加した場合にも漸進的に減少し
た（図１２）。
【０１１８】これらの事実は、赤血球に方向付けられた
細胞に観察されるような大食細胞に依存した細胞成長お
よび分化の抑制型とは対照的に、ＡＬＡデハイドラター
ゼおよびＰＢＧデアミナーゼ活性あるいはプロトポルフ
ィリンおよびヘム含量の最大増加を抑制するような赤血
球特性で表わされる細胞は、大食細胞メディエーターの
抑制効果に対して感受性の程度が著しく小さいことを示
している。
【０１１９】Ｉ．ＨＭＢＡ、ブチル酸、ヒポキサンチン
あるいはヘミンにより誘発されるフレンド細胞の赤血球
分化に及ぼすエンドトキシン刺激大食細胞メディエータ
ーの効果 赤血球に方向付けられた細胞に及ぼすエンドトキシン刺
激大食細胞メディエーターの抑制効果がＭｅ2ＳＯ誘発
分化に特有のものであるか否かを検査するため、我々
は、ＨＭＢＡ、ブチル酸、ヒポキサンチンあるいはヘミ
ンのいずれかと保温した細胞に及ぼす大食細胞メディエ
ーターの効果を検査した。われわれはエンドトキシン刺
激大食細胞メディエーターが、ＨＭＢＡ、ブチル酸ある
いはヒポキサンチンと保温した細胞の成長を著しく抑制
するが、ヘミン処理細胞の成長については抑制効果がな
いことを見出した（図１３、パートＢ）。
【０１２０】この事実は、エンドトキシン刺激大食細胞
メディエーターの抑制作用が赤血球に方向付けられた細
胞の成長に及ぼす効果と、Ｍｅ2ＳＯ、ＨＭＢＡ、ブチ
ル酸あるいはヒポキサンチンにより表される大抵の化学
剤により誘発される赤血球分化に及ぼす効果とは同じで
あるが、しかしヘミン処理により誘発される赤血球分化
は性質に特異性があり、大食細胞メディエーターの効果
に対して感受性を持たないことを示唆している。実際、
大食細胞メディエーターのみ（３５％、図１０）により
生ずるＭｅ2ＳＯ処理細胞の成長抑制は、ヘミン処理
（図１３）により完全に凌駕される。
【０１２１】Ｊ．フレンド細胞の一定速度の成長および
分化に及ぼすエンドトキシン感受性大食細胞メディエー
ターの効果 フレンド細胞が一定速度で成長している間にその成長に
及ぼす大食細胞メディエーターの効果を調べるため、メ
ディエーターを含むあるいは含まない新鮮な培地で細胞
を２４時間毎に稀釈し、細胞濃度を２×１０５細胞／ｍ
ｌに減ずるようにした。
【０１２２】このような培養条件のもとでは、細胞は一
定速度で連続的な対数成長率を保持する（チャン，シ
ー．エス．ほか、既述）。もとの未処理比較例培養体か
ら生成された細胞の全数は保温９６時間後８２×１６６
細胞／ｍｌであった（図１４）。大食細胞メディエータ
ーの添加は細胞成長を著しく抑制した（〜７０％）。培
養体にＭｅ2ＳＯを添加することにより４２×１０６細
胞／ｍｌとなった。この減少はおそらくこれら細胞の末
端赤血球分化と関連する成長停止を反映したものであろ
う（チェン シー．エス．既述；ロ，エス．シー．，ア
フト，アール，およびミューラ，ジー．シー．，Ｃａｎ
ｃｅｒ Ｒｅｓ．４１号，８６４〜８７０ぺージ，１９
８１年）。Ｍｅ2ＳＯと大食細胞メディエーターを共に
添加することにより、これらの細胞に対し最も大きな成
長抑制効果（〜９０％）を生じた。メディエーターのみ
で処理した細胞におけるヘム含量は大した影響を受けな
かったが、メディエーターとＭｅ2ＳＯの両方で処理し
た場合には、〜４０％のヘム生成抑制効果があった。
【０１２３】Ｋ．分析 研究対象であるメディエーター物質はマウスのフレンド
−ウイルス変換細胞の成長および赤血球分化を強く抑制
するように見える。エンドトキシンに曝されない培養体
からの条件つき培地はいくらかの抑制効果をもってい
た。しかしエンドトキシン刺激条件つき培地のフレンド
細胞成長および分化抑制に及ぼす効果は著しく大きいも
のである。エンドトキシンそれ自体は細胞成長にも分化
にも何ら影響をもたない。
【０１２４】更にメディエーターの効果は赤血球前駆細
胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）細胞のある段階に特有のも
のであるように見える。即ち大食細胞メディエーター
は、Ｍｅ2ＳＯ、ＨＭＢＡ、ブチル酸あるいはヒポキサ
ンチン処理により誘発された赤血球に方向付けられた細
胞の場合よりも方向付けられていない幹細胞の成長およ
び赤血球分化に大きな抑制効果を及ぼしていた。細胞成
長に及ぼす大食細胞メディエーターの抑制効果は、一定
速度で対数的な成長曲線を示す細胞に対しての場合によ
り著しいものであった。フレンド細胞のヘミン処理は、
ヘモグロビン化細胞の発現に導く赤血球細胞成熟を引き
起こすことが知られているが、この場合未分化幹細胞の
赤血球前駆細胞への変化を伴うものではない（グゼラ，
ジェー．エフ．，ヴァイル，エス．シー．，チフトグロ
ン，エー．エス．，ボロッホ，ヴィ．，ノイマン，ジェ
ー．アール．およびホウスマン，ディー．１９７６年，
Ｂｌｏｏｄ，５６号，４８１〜４８７ぺージ）。興味深
いことは、エンドトキシン刺激大食細胞もまた、ヘミン
の存在下にフレンド細胞の成長および分化に殆ど効果を
もたないことである。
【０１２５】これらの結果は、エンドトキシン刺激大食
細胞メディエーターが、赤血球分化を行うことを含む赤
血球前駆細胞の成長および分化に抑制効果を及ぼすこと
を示している。一方、ＡＬＡデハイドラターゼおよびＰ
ＢＧデアミナーゼの増大した活性、およびプロトポルフ
ィリンとヘムの増大した含量のような赤血球細胞のもつ
特性を十分に示す細胞は、条件つき培地の抑制効果にも
はや感受性を示さない。従って、エンドトキシン刺激条
件つき培地の作用は、赤血球前駆細胞のある初期段階で
はある程度特異性を示すが、十分に分化した赤血球細胞
に対してはもはや影響を及ぼさなくなる。
【０１２６】我々はまたエンドトキシン刺激大食細胞条
件つき培地からメディエーターを純化すること試みた。
そして、高度に純化されたメディエーターが、３Ｔ３細
胞におけるリポプロテインリパーゼ活性およびフレンド
細胞の成長および分化の両方に及ぼす抑制効果を保持し
ていることを知った。
【０１２７】この例で記載した大食細胞ファクターは、
エンドトキセミアや、細網内皮組織の活性が刺激される
ようなガンリウマトイド関節炎などの慢性病的状態と関
連する貧血の病理論に、ある役割を果すと考えられる。
ここに記載したフレンド細胞系は、このような生体内メ
ディエーターの検知、およびメディエーターの細胞内効
果の生化学的基礎を説明するために有用である。この検
定系もまたこのファクターの分離、および侵入に対する
応答として生産される他の免疫細胞ファクターとその関
係との同定に役立つものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】（Ａ）は、エンドトキシンで処理したエンドト
キシン感受性マウスから得た血清が、エンドトキシン感
受性マウスにおける脂肪性組織ＬＰＬ活性に及ぼす影響
を示す。メディエーター活性の観察および結論は実施例
Ｉ、パラグラフＥに示されている。データは各群の６体
のマウスの平均（±ＳＥＭ）として表わされている。
（Ｂ）は、エンドトキシンで処理したエンドトキシン感
受性マウスから得た血清が、エンドトキシン耐性マウス
における脂肪性組織ＬＰＬ活性に及ぼす影響を示す。デ
ータは各群の３体のマウスの平均（±ＳＥＭ）として表
わされている。
【図２】エンドトキシン耐性マウスにおける脂肪性組織
に及ぼす滲出細胞培養体から得た培地の効果を示す。デ
ータは４体あるいは５体の平均値（±ＳＥＭ）として表
示されている。
【図３】３Ｔ３−Ｌ１細胞のリポプロテインリパーゼ活
性に及ぼす、エンドトキシン処理マウス腹膜滲出細胞か
ら得た条件つき培地の効果を示す。データは４体の平均
値（±ＳＥＭ）として表示されている。
【図４】３Ｔ３−Ｌ１細胞におけるアセチル補酵素Ａカ
ルボキシラーゼおよび脂肪酸シンセターゼの活性に及ぼ
す、エンドトキシン処理マウス腹膜滲出細胞から得た条
件つき培地の効果を示す。条件つき培地の３００μｌ
が、３．５ｍｌのＤＭＥ培地と１０％ウシ胎児血清を含
有する６cm皿の３Ｔ３−Ｌ１細胞（４．２×１０６細胞
／皿）の培養体に添加された。表示された保温時間の
後、アセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ（記号“・”で
表示）および脂肪酸シンセターゼ（信号“。”で表示）
の酵素的活性が、細胞のディジトニン解放可能細胞質フ
ラクションに及ぼす影響を検定した。
【図５】アセチル補酵素Ａカルボキシラーゼの合成を抑
圧するメディエーターの効果を示す。メディエーター
（条件つき培地の３００μｌ）に対して３Ｔ３−Ｌ１細
胞を表示された時間曝した後、細胞に０．５ｍＣｉの35
Ｓ−メチオニンで１時間パルスラベル処理を施した。単
層のディジトニン処理により細胞質フラクションを得
た。細胞質フラクション（すべての決定値について２×
１０５ｃｐｍ）の部分標本を、実施例IIに記載されてい
るように分離され特徴ずけられている抗アセチル補酵素
Ａカルボキシラーゼおよび免疫沈澱可能材料と共に保温
した。図５Ａ：免疫吸収可能タンパク質の７．５％−ア
クリルアミド０．１％ＳＤＳゲル分析の放射能写真（Ｘ
線写真）である。レーン１はメディエーターに曝さない
場合の比較例；レーン２、３および４はメディエーター
に細胞をそれぞれ３、６、および２０時間曝した例であ
る。図５Ｂ：放射能写真の濃度測定走査結果にあって、
メディエーターに曝した後の、比較例に対する免疫吸収
可能材料の残留％を示す。
【図６】脂肪酸シンセターゼの合成を抑圧するメディエ
ーターの効果を示す。実験的な構成は図５の説明と同じ
である。図６Ａ：免疫吸収可能脂肪酸シンセターゼの
７．５％−アクリルアミド−ＳＤＳゲル分析の放射能写
真（Ｘ線写真）であって、レーン１はメディエーターに
曝さない場合の比較例；レーン２、３および４はメディ
エーターに細胞をそれぞれ３、６、および２０時間曝し
た例である。図６Ｂ：放射能写真の濃度測定走査結果で
あって、メディエーターに曝した後の、比較例に対する
免疫吸収可能材料の残留％を示す。
【図７】タンパク質中への35Ｓ−メチオニン結合に及ぼ
すメディエーターの効果を示す。３Ｔ３−Ｌ１細胞が、
エンドトキシン処理マウス腹膜滲出細胞から得た３００
μｌの条件つき培地と共に所定時間保温され、また０．
５ｍＣｉの35Ｓ−メチオニンで１時間タンパク質パルス
ラベリングをした。溶解性タンパク質が細胞のディジニ
トロン処理により得られ、単層残留分はＮＰ−４０で抽
出し、膜タンパク質フラクションが得られた。酸沈澱可
能材料中への35Ｓ−メチオニンの結合は、実施例IIに記
載されているようにして実施された。メディエーターに
細胞を曝した後、可溶タンパク質（・）あるいは膜タン
パク質（。）への放射能の放出は所定時間行われた。
【図８】細胞の細胞質フラクションにおけるタンパク質
合成に及ぼすメディエーターの効果を示す。メディエー
ターに細胞を曝した後、35Ｓ−メチオニンをラベルした
細胞質タンパク質の７．５％−アクリルアミド−０．１
％ＳＤＳゲル分析の放射能写真（Ｘ線写真）が示され
る。３Ｔ３−Ｌ１細胞がパルスラベルされ、可溶タンパ
ク質が実施例IIに記載するようにディジトニンにより得
られた。各時点における細胞質フラクションの部分標本
（２×１０５ｃｐｍ）がゲルに適用され電気泳動処理を
施された。レーン１および２はメディエーターに曝さな
い比較例；レーン３および４はメディエーターに１時間
曝したもの；レーン５および６は３時間曝したもの；レ
ーン７および８は６時間曝したもの；レーン９および１
０は、エンドトキシンに曝さないマウス腹膜滲出細胞か
ら得られた条件つき培地に対して２０時間曝したもの；
レーン１１および１２はメディエーターに細胞を２０時
間曝したものである。
【図９】細胞の膜フラクションにおけるタンパク質合成
に及ぼすメディエーターの効果を示す。メディエーター
に細胞を曝した後、35Ｓ−メチオニンをラベルした膜タ
ンパク質の７．５％−アクリルアミド−０．１％ＳＤＳ
ゲル分析の放射能写真（Ｘ線写真）が示される。実験的
構成は図８と関連する説明と同じである。膜タンパク質
は実施例IIに記載されるようにＮＰ−４０抽出により得
られる。レーン１および２はメディエーターに曝されな
い比較例；レーン３および４はメディエーターに１時間
曝した例；レーン５および６は３時間曝した例；レーン
７および８は６時間曝した例；レーン９および１０は、
エンドトキシンに曝さないマウス腹膜滲出細胞から得ら
れた条件つき培地に細胞を２０時間曝したもの；レーン
１１および１２はメディエーターに２０時間曝した例で
ある。
【図１０】フレンド細胞における細胞成長およびヘム含
量に及ぼす、マウス大食細胞培養体から得られた条件つ
き培地の効果を示す。フレンド細胞（クローンＤＳ−１
９）を９６時間、Ｍｅ2ＳＯ（１．５容積％）の存在し
ない状態でもしくは存在下に培養した。エンドトキシン
（５μｇ／ｍｌ）で刺激されるかあるいは刺激されない
マウスの腹膜大食細胞培養からの条件づき培地（成長培
地の８０μｌ／ｍｌ）を培養初期に添加した。細胞数が
チトグラフモデル６３００で数えられ、比較細胞のパー
セント抑制として表わされた。夫処理比較培地における
細胞数は３×１０６細胞／ｍｌであった。ヘム含量は既
に開示されているような（サッサ，エス．グラニック；
エス．チャン，シーおよびカッパス．エー．著、１９７
５年“赤血球造血において”、ケイ．ナカノ，ジェー．
ダブリュ．フィッシャーおよびエフ．タカク編集、東京
大学出版、東京、３８３〜３９６ぺージ）蛍光測定法に
より決定された。データは二重決定値の平均値である。
チトグラフ法により数えられたトリパンブルー陽性細胞
の数は全培養基の８〜１０％であった。
【図１１】Ｍｅ2ＳＯ処理を施したフレンド細胞の細胞
成長および赤血球分化に及ぼすエンドトキシン刺激大食
細胞メディエーターの投与依存効果を示す。細胞は９６
時間、大食細胞メディエーターの増大する濃度と共に
１．５％Ｍｅ2ＳＯの存在下に培養された。酵素および
中間物の測定は実施例III以下に記載されるようにして
行われた。データは二重決定値の平均値である。
【図１２】細胞成長および赤血球分化に及ぼすエンドト
キシン刺激大食細胞メディエーターの遅れた添加の影響
を示す。フレンド細胞は培地を変えずに９６時間培養さ
れた。Ｍｅ2ＳＯは０から最終濃度である１．５容積％
までに添加されたが、エンドトキシンに刺激された大食
細胞メディエーターは横座標（成長培地ｍｌあたり８０
μｌの条件つき培地）に示す時に添加した。細胞数、Ａ
ＬＡデハイドラターゼおよびＰＢＧデアミナーゼの活
性、ヘムおよびプロトポルフィルン含量は実施例III以
下に記載されるように培養終期に測定された。データは
二重測定値の平均値である。Ｍｅ2ＳＯのみで処理され
た比較培養基の値は次の通りである。 細胞数 ３．０（×１０−６／ｍｌ） ＡＬＡデハイドラターゼ ３．００（ｎモルＰＢＧ／１０６細胞，ｈ） ＰＢＧデアミナーゼ １２０（ｐモル ウロポルフィリノーゲン／ １０６細胞，ｈ） プロトポルフィリン ０．５７（ｐモル／１０６細胞） ヘム ５２０（ｐモル／１０６細胞）
【図１３】ＨＭＢＡ、ブチル酸、ヒポキサンチンあるい
はヘミンで処理されたフレンド細胞における細胞成長お
よびヘム含量に及ぼすエンドトキシン刺激大食細胞メデ
ィエーターの影響を示す。細胞は培地を変えることなく
９６時間培養された。化学物質およびエンドトキシン刺
激大食細胞メディエーター（成長培地ｍｌあたり８０μ
ｌ添加）の導入時間は、化学物質が０から最終濃度まで
の間にＨＭＢＡの場合ｍＭ、ブチル酸は１．３ｍＭ、ヒ
ポキサンチンの場合ｂｍＭ、ヘミンの場合０．１ｍＭで
あった。測定は実施例III以下のようにして実施され
た。データは二重決定値の平均値である。
【図１４】一定速度で成長するフレンド細胞の成長およ
び分化に及ぼすエンドトキシン刺激大食細胞メディエー
ターの影響を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 38/55 Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/02 Ａ６１Ｋ 37/64 // Ａ６１Ｋ 38/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02

Claims (17)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 哺乳動物におけるメディエーター物質の
    毒性レベルを減少させるため、哺乳動物におけるショッ
    クを治療するため、哺乳動物におけるショックの発生を
    予防するため、および/または悪液質を治療するため
    の、メディエーター活性組成物に対する抗体を含む医薬
    組成物か、または肥満症を治療するための、メディエー
    ター活性組成物を含む医薬組成物であって、該メディエ
    ーター活性組成物が下記の特性、すなわち： （イ）生物学的活性にして、 （ａ）同化酵素であるリポプロテインリパーゼ、アセチ
    ル補酵素Ａカルボキシラーゼ、および脂肪酸シンセター
    ゼの活性を抑制すること、および（ロ）哺乳動物大食細
    胞から下記の手順、すなわち（ａ）哺乳動物から大食細
    胞の標本を集め、（ｂ）該大食細胞の一部を、哺乳動物
    において侵入刺激を引き起こし得る刺激物質と共に培養
    し、そして（ｃ）該大食細胞に該メディエーター活性組
    成物の生成を誘導することにより得られること；ここ
    で、該抗体は該生物学的活性（イ）を中和可能である；
    を有する医薬組成物。
  2. 【請求項２】 前記メディエーター活性組成物の分子量
    が１２,０００より大きい、請求項１に記載の医薬組成
    物。
  3. 【請求項３】 前記メディエーター活性組成物の分子量
    が約７０,０００あるいは約３００,０００である、請求
    項２に記載の医薬組成物。
  4. 【請求項４】 前記メディエーター活性組成物の分子量
    が約４００〜１,０００である、請求項１に記載の医薬
    組成物。
  5. 【請求項５】 前記抗メディエーター活性組成物が熱に
    不安定である、請求項１〜４のいずれかに記載の医薬組
    成物。
  6. 【請求項６】 前記メディエーター活性組成物が水性媒
    体に溶解し得る、請求項１〜５のいずれかに記載の医薬
    組成物。
  7. 【請求項７】 前記メディエーター活性組成物が高濃度
    のインシュリン存在下で活性を保持する、請求項１〜６
    のいずれかに記載の医薬組成物。
  8. 【請求項８】 前記メディエーター活性組成物がヒトの
    メディエーター活性組成物である、請求項１〜７のいず
    れかに記載の医薬組成物。
  9. 【請求項９】 前記メディエーター活性組成物がマウス
    のメディエーター活性組成物である、請求項１〜７のい
    ずれかに記載の医薬組成物。
  10. 【請求項１０】 前記刺激物質が、腫瘍細胞、毒素、も
    しくは感染、殊に細菌、ウイルスあるいは原虫感染と関
    係する、請求項１〜９のいずれかに記載の医薬組成物。
  11. 【請求項１１】 前記刺激物質がエンドトキシンであ
    る、請求項１〜１０のいずれかに記載の医薬組成物。
  12. 【請求項１２】 前記刺激物質がリポポリサッカライド
    である、請求項１〜１１のいずれかに記載の医薬組成
    物。
  13. 【請求項１３】 前記抗体がポリクローナル抗体であ
    る、請求項１〜１２のいずれかに記載の医薬組成物。
  14. 【請求項１４】 前記ポリクローナル抗体が、ウサギ、
    ヤギ、ヒツジ、その他の哺乳動物、あるいはニワトリか
    ら得られる、請求項１３に記載の医薬組成物。
  15. 【請求項１５】 前記抗体がモノクローナル抗体であ
    る、請求項１〜１２のいずれかに記載の医薬組成物。
  16. 【請求項１６】 前記モノクローナル抗体がハイブリド
    ーマ細胞から得られる、請求項１５に記載の医薬組成
    物。
  17. 【請求項１７】 前記ハイブリドーマ細胞が、マウス脾
    臓リンパ球と骨髄腫細胞の融合産物である、請求項１６
    に記載の医薬組成物。
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