DE60129239T2 - Kit und verfahren zur bestimmung von protein esm-1 - Google Patents

Kit und verfahren zur bestimmung von protein esm-1 Download PDF

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft einen Kit zum Nachweis des Proteins ESM-1 in einer Probe. Sie betrifft auch ein Verfahren zum Nachweis des Proteins ESM-1 in einer Probe unter Verwendung eines solchen Kits.
  • Der Kit und das Verfahren zum Nachweis des Proteins ESM-1 gemäß der Erfindung sind insbesondere auf die Quantifizierung des Proteins ESM-1 in biologischen Proben, ganz besonders biologischen Proben, die von Patienten stammen, bei denen man eine Veränderung der endothelialen Gefäßwände vermutet, gewerblich anwendbar.
  • Stand der Technik
  • Das Protein ESM-1 (für "Endothelzellen-spezifisches Molekül 1") ist ein Protein, das hauptsächlich durch Endothelzellen und größtenteils durch Gefäßendothelzellen exprimiert wird. Das Protein ESM-1 wurde zum ersten Mal von LASSALLE et al. (1996) beschrieben. Die mRNA von ESM-1 codiert für ein Polypeptid von 184 Aminosäuren, deren Sequenz in 1 des Artikels von LASSALLE et al. (1996) beschrieben ist.
  • Das Protein ESM-1, das man in den Zelllysaten der humanen Endothelzellen findet, besitzt ein scheinbares Molekulargewicht von 20 kDa. Die sezernierte Form des Proteins ESM-1 besitzt ein scheinbares Molekulargewicht von 50 kDa, was darauf hinweist, dass das sezernierte Protein ESM-1 posttranslationalen Modifikationen unterliegt.
  • Die Verwendung von monoklonalen Antikörpern zum Nachweisen des Proteins ESM-1 ist in der unter der Nr. 2.775.691 veröffentlichten französischen Patentanmeldung sowie im Artikel von BECHARD et al. (2000) beschrieben. Diese monoklonalen Antikörper wurden durch Immunisierung von Mäusen mit einem Antigen hergestellt, das aus der Sequenz besteht, die von der Aminosäure auf Position 79 bis zur Aminosäure auf Position 184 des Proteins ESM-1 reicht und die mit dem Protein GST (Glutathion-S-Transferase) fusioniert wurde. Drei Familien von monoklonalen Antikörpern wurden charakterisiert, wobei diese Familien von Antikörpern an die antigenen Determinanten AgD1 79P-99C (Antikörper MEP 01, MEP 06 und MEP21), AgD2 1195-139V (Antikörper MEP 08 und MEP 13) bzw. AgD3 159G-184R (Antikörper MEP 04, MEP 14 und MEP 19) binden.
  • BECHARD et al. (2000) beschreiben die Entwicklung eines immunoenzymatischen Tests des Sandwichtyps, bei dem die monoklonalen Antikörper MEP 19 und MEP 21 eingesetzt werden, um einen Test zum Nachweis des Proteins ESM-1 in einer Probe durchzuführen. Dieser Test erlaubte es den Autoren, eine starke Produktion des Proteins ESM-1 im Serum von Patienten zu zeigen, die wegen eines septischen Schocks ins Krankenhaus aufgenommen wurden. Die in 4 dieses Artikels gezeigten Ergebnisse zeigen, dass der Nachweistest unter Verwendung der Antikörper MEP 19 und MEP 21 es erlaubt, eine Konzentration an Protein ESM-1 von über 4 Nanogramm pro Milliliter nachzuweisen.
  • Da der von BECHARD et al. (2000) beschriebene immunoenzymatische Test des Proteins ESM-1 jedoch zum Nachweis von hohen Konzentrationen des Proteins ESM-1 in einer Probe geeignet ist, erlaubt er es nicht, geringe Mengen dieses Proteins nachzuweisen, welche jedoch kennzeichnend für physiologische Störungen sind, wie eine Veränderung der endothelialen Gefäßwand bei Patienten, wie gemäß der Erfindung gezeigt wird.
  • Kurzbeschreibung der Erfindung
  • Die Anmelderin hat es sich zur Aufgabe gemacht, einen immunologischen Nachweistest des Proteins ESM-1 in einer Probe zu entwickeln, der viel empfindlicher ist als der im Stand der Technik beschriebene Test.
  • Gegenstand der Erfindung ist ein Kit zum Nachweis des Proteins ESM-1 in einer Probe, umfassend:
    • a) einen ersten Antikörper, der spezifisch an den N-terminalen Bereich des Proteins ESM-1 zwischen der Aminosäure auf Position 20 und der Aminosäure auf Position 78 der Aminosäuresequenz dieses Proteins bindet; und
    • b) einen zweiten Antikörper, der spezifisch an den C-terminalen Bereich zwischen der Aminosäure auf Position 79 und der Aminosäure auf Position 184 der Aminosäuresequenz des Proteins ESM-1 bindet.
  • Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zum Nachweis des Proteins ESM-1 in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte umfasst:
    • a) In-Kontakt-Bringen der zu testenden Probe mit einem Träger, auf dem ein erster Antikörper, der spezifisch an den N-terminalen Bereich oder den C-terminalen Bereich der Aminosäuresequenz des Proteins ESM-1 bindet, immobilisiert ist;
    • b) In-Kontakt-Bringen des Komplexes, der gegebenenfalls zwischen dem immobilisierten Antikörper und dem Protein ESM-1 gebildet wurde, mit einem zweiten Antikörper, der spezifisch an den N-terminalen oder C-terminalen Bereich bindet, je nachdem, welcher Bereich vom ersten Antikörper nicht erkannt wurde; und
    • c) Nachweisen des zwischen dem Protein ESM-1 und dem zweiten Antikörper gegebenenfalls gebildeten Komplexes.
  • Die Erfindung bezieht sich auch auf bestimmte Antikörper, die in dem obigen Verfahren eingesetzt werden.
  • Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung des Nachweiskits gemäß der Erfindung zum Nachweisen einer Veränderung der endothelialen Gefäßwand bei einem Patienten, insbesondere bei einem Patienten, der unter einem septischen Schock oder einer Krebserkrankung leidet, oder auch bei einem Patienten, der eine therapeutische Behandlung erfährt, die cytotoxisch gegenüber Gefäßendothelzellen sein kann.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Nachweiskit gemäß der Erfindung
  • Gemäß der Erfindung wird ein Kit bereitgestellt, der es erlaubt, die Gegenwart des Proteins ESM-1 in einer Probe mit großer Empfindlichkeit nachzuweisen.
  • Die Probe, in der nach der Gegenwart des Proteins ESM-1 gesucht wird, kann beliebiger Natur sein. Vorzugsweise handelt es sich um eine biologische Flüssigkeit, wie ein Serum, ein Plasma, Vollblut, Urin, Liquor oder Kulturüberstände oder auch Zelllysate.
  • Die Anmelderin hat gezeigt, dass das von eukaryontischen Zellen sezernierte Protein ESM-1 spezifische Merkmale aufweist, die man in dem Protein ESM-1, das von prokaryontischen Zellen, wie Zellen von Escherichia coli, produziert wird, nicht wiederfindet.
  • Das Protein ESM-1 wird von eukaryontischen Zellen und ganz besonders von Endothelzellen in Form eines Glycoproteins, genauer eines Proteoglycans, das eine Kette des Typs Chondroitin/Dermatansulfat besitzt, sezerniert. Außerdem hat die Anmelderin gezeigt, dass das von eukaryontischen Zellen sezernierte Protein ESM-1 weitere posttranslationale Modifikationen erfährt, einschließlich konformatorischer Modifikationen, die durch die Bildung von Disulfidbrücken zwischen den Cysteinresten, die sich hauptsächlich im N-terminalen Bereich dieses Proteins befinden, hervorgerufen werden. Das Polypeptid ESM-1 mit 184 Aminosäuren wird als Sequenz SEQ ID Nr. 1 bezeichnet.
  • Für die Entwicklung eines immunologischen Nachweistests für das Protein ESM-1 mit hoher Empfindlichkeit hat die Anmelderin monoklonale Antikörper hergestellt, die gegen den N-terminalen Bereich gerichtet sind, der von der Aminosäure auf Position 20 bis zur Aminosäure auf Position 78 der von LASSALLE et al. (1996) beschriebenen Sequenz SEQ ID Nr. 1 reicht, wobei die Aminosäure auf Position 20 die aminoterminale Aminosäure des sezernierten Proteins ESM-1 bildet.
  • Vorzugsweise sind die von der Anmelderin hergestellten monoklonalen Antikörper gegen das von eukaryontischen Zellen sezernierte Protein ESM-1 gerichtet, das die oben genannten posttranslationalen Modifikationen erfahren hat.
  • Insbesondere hat die Anmelderin Hybridomzelllinien hergestellt, die monoklonale Antikörper produzieren, welche insbesondere an den Bereich des Proteins ESM-1 binden, der konformatorischen Modifikationen aufgrund der Bildung von Disulfidbrücken unterliegt, d.h. Antikörper, die gegen den N-terminalen Bereich des Proteins ESM-1 gerichtet sind, der von der Aminosäure auf Position 20 bis zur Aminosäure auf Position 78 der Aminosäuresequenz des Proteins ESM-1 der Sequenz SEQ ID Nr. 1 reicht.
  • Um ein Werkzeug zum Nachweis des Proteins ESM-1 in einer Probe zu erhalten, hat die Anmelderin einen immunologischen Test des Sandwichtyps entwickelt, bei dem zwei Antikörper verwendet werden, die spezifisch an zwei unterschiedliche Bereiche des Proteins ESM-1 binden, nämlich ein Antikörper, der spezifisch an den N-terminalen Bereich bindet, der von der Aminosäure auf Position 20 bis zur Aminosäure auf Position 78 von ESM-1 reicht, und ein Antikörper, der spezifisch an den C-terminalen Bereich bindet, der von Position 79 bis zur Position 184 der Sequenz von ESM-1 reicht.
  • Ein erster Gegenstand der Erfindung besteht also in einem Kit zum Nachweis des Proteins ESM-1 in einer Probe, wobei der Kit Folgendes umfasst:
    • a) einen ersten Antikörper, der spezifisch an den N-terminalen Bereich des Proteins ESM-1 zwischen der Aminosäure auf Position 20 und der Aminosäure auf Position 78 der Aminosäuresequenz dieses Proteins bindet; und
    • b) einen zweiten Antikörper, der spezifisch an den C-terminalen Bereich zwischen der Aminosäure auf Position 79 und der Aminosäure auf Position 184 der Aminosäuresequenz des Proteins ESM-1 bindet.
  • Besonders bevorzugt ist der Antikörper, der spezifisch an den N-terminalen Bereich des Proteins ESM-1 bindet, spezifisch gegen den N-terminalen Bereich des Proteins ESM-1 gerichtet, das von eukaryontischen Zellen sezerniert wird und die oben näher beschriebenen posttranslationalen Modifikationen erfahren hat. Dies bedeutet, dass der Antikörper, der spezifisch an den N-terminalen Bereich bindet, nach einem Verfahren erhalten wurde, das einen Schritt umfasst, im Verlaufe dessen man einem Tier ein gereinigtes Präparat des Proteins ESM-1 injiziert, das von einer eukaryontischen Zelle produziert wird.
  • Unter "Antikörper" im Sinne der Erfindung versteht man jedes Molekül, das ein "Paratop" umfasst, welches spezifisch an den N-terminalen Bereich oder den C-terminalen Bereich des Proteins ESM-1 binden kann. Unter "Antikörper" gemäß der Erfindung versteht man auch eine homogene Population von Molekülen, die alle dasselbe "Paratop" umfassen, das spezifisch an den N-terminalen oder C-terminalen Bereich des Proteins ESM-1 binden kann.
  • Unter "Paratop" versteht man die Stelle der antigenen Kombination, die im Fab-Fragment eines Antikörpers enthalten ist und in den hypervariablen oder CDR-Bereichen der variablen Domänen VH und VL der schweren Kette und der leichten Kette eines Immunglobulins lokalisiert ist.
  • Ein Antikörper gemäß der Erfindung kann ausgehend von Hybridomen gemäß der von KOHLER und MIELSTEIN (1975) beschriebenen Technik oder auch durch die Technik des Hybridoms der von KOZBOR (1983) beschriebenen humanen B-Zellen hergestellt werden. Ein Antikörper gemäß der Erfindung umfasst auch die einzelkettigen chimärischen Fv-Antikörperfragmente (ScFv für "single chain Fv"), wie sie im US-Patent Nr. 4,946,778 und von MARTINEAU et al. (1998) beschrieben sind. Ein Antikörper gemäß der Erfindung kann auch durch Phagenbibliotheken ("phage display libraries"), wie sie von RIDDER et al. (1995) beschrieben sind, produziert werden. Ein Antikörper gemäß der Erfindung kann auch ein humanisierter Antikörper sein, der nach der von REINMANN et al. (1997) beschriebenen Technik oder auch nach der von LEGER et al. (1997) beschriebenen Technik produziert wird.
  • Besonders bevorzugt umfasst der Nachweiskit für das Protein ESM-1 gemäß der Erfindung einen der beiden Antikörper in einer auf einem Träger immobilisierten Form. In dieser bevorzugten Ausführungsform liegt der Nachweiskit der Erfindung in einer "gebrauchsfertigen" Form vor, um einen Immunonachweistest des Sandwichtyps für das Protein ESM-1 durchzuführen.
  • Gemäß der Erfindung wurde gezeigt, dass die Verwendung eines Kits, wie er oben definiert ist, zum Nachweis der Gegenwart des Proteins ESM-1 in einer Probe es erlaubt, eine Nachweisempfindlichkeit zu erhalten, die zehnmal so groß ist wie diejenige, die man bei dem von BECHARD et al. (2000) beschriebenen ESM-1-Nachweistest beobachtet.
  • Die hohe Empfindlichkeit des Immunonachweistests gemäß der Erfindung ermöglichte den Nachweis von sehr geringen Konzentrationen des Proteins ESM-1 in einer biologischen Probe, zum Beispiel in einem humanen Serum, und erlaubte so den frühzeitigen Nachweis der Veränderung der endothelialen Gefäßwände bei einem Patienten.
  • Insbesondere hat es die Verwendung eines Immunonachweiskits gemäß der Erfindung erlaubt, bei Individuen, die unter Sepsis leiden und als "atopisch" bezeichnet werden, Serumkonzentrationen von ESM-1 von 1 bis 3 Nanogramm pro ml nachzuweisen.
  • Wie in den Beispielen gezeigt wird, erlaubt es die Verwendung eines Immunonachweiskits gemäß der Erfindung, ESM-1-Konzentrationen in der Größenordnung von 100 bis 200 Picogramm/ml nachzuweisen, während der von BECHARD et al. (2000) beschriebene Test den Nachweis von ESM-1-Konzentrationen von unter 1 Nanogramm/ml nicht erlaubt.
  • Vorteilhafterweise ist der gegen den N-terminalen Bereich von ESM-1-gerichtete Antikörper ein monoklonaler Antikörper, der von einer Hybridomlinie produziert wird, die nach Immunisierung eines Säugers, vorzugsweise einer Maus, mit dem Protein rekombinanten ESM-1 erhalten wird, das von einer eukaryontischen Zelle synthetisiert wird, zum Beispiel von einer Zelle der CHO-Linie, die mit einem Expressionsvektor transformiert ist, der ein DNA-Insert umfasst, das für das von LASSALLE et al. beschriebene ESM-1-Protein codiert, zum Beispiel dem Vektor pcDNA3.
  • Besonders bevorzugt handelt es sich um den monoklonalen Antikörper, der von der als MEC 15 bezeichneten Hybridomlinie produziert wird, die am 17. Oktober 2000 unter der Zugriffsnummer I-2572 bei der Collection de Cultures de Microorganismes (CNCM) de l'Institut Pasteur hinterlegt wurde.
  • Der Antikörper MEC15 bildet einen Gegenstand der Erfindung.
  • Der Antikörper, der spezifisch an den C-terminalen Teil des Proteins ESM-1 bindet, kann gleichermaßen ein Antikörper sein, der gegen das von einer prokaryontischen Zelle, wie Escherichia coli, produzierte oder von einer eukaryontischen Zelle, wie die Zellen der CHO-Linie, produzierte Protein ESM-1 gerichtet ist.
  • Vorzugsweise ist der Antikörper, der spezifisch an den C-terminalen Bereich von ESM-1 bindet, aus den Antikörpern ausgewählt, die eine der folgenden drei antigenen Determinanten des Proteins ESM-1 erkennen können:
    • a) die Determinante AgD1, die vom Prolinrest auf Position 79 bis zum Cysteinrest auf Position 99 von ESM-1 reicht, wie die Antikörper, die von den von BECHARD et al. (2000) beschriebenen Hybridomlinien MEP01, MEP06 und MEP21 produziert werden;
    • b) die antigene Determinante AgD2, die vom Serinrest auf Position 119 bis zum Valinrest auf Position 139 des Proteins ESM-1 reicht und von den Antikörpern erkannt wird, die von den von BECHARD et al. (2000) beschriebenen Hybridomen MEP08 und MEP13 produziert werden;
    • c) die antigene Determinante AgD3, die vom Glycinrest auf Position 159 bis zum Argininrest auf Position 184 von ESM-1 reicht und von den Antikörpern erkannt wird, die von den von BECHARD et al. (2000) beschriebenen Hybridomlinien MEP04, MEP14 und MEP19 produziert werden.
  • Besonders bevorzugt könnte sich der Fachmann für die Verwendung eines Antikörpers, der spezifisch an den C-terminalen Bereich des Proteins ESM-1 bindet, vorteilhafterweise auf die folgenden Antikörper beziehen:
    • – die spezifischen monoklonalen Antikörper der antigenen Determinante D1, die von der Hybridomlinie produziert werden, die am 19. November 1997 unter der Zugriffsnummer I-1944 bei der CNCM hinterlegt wurde (Antikörper MEP 21);
    • – die spezifischen monoklonalen Antikörper der antigenen Determinante D2, die von der Hybridomlinie produziert werden, die am 19. November 1997 unter der Zugriffsnummer I-1941 bei der CNCM hinterlegt wurde (Antikörper MEP08);
    • – die spezifischen monoklonalen Antikörper der antigenen Determinante D3, die von der Hybridomlinie produziert werden, die am 19. November 1997 unter der Zugriffsnummer I-1942 (Antikörper MEP14) und I-1943 (Antikörper MEP19) bei der CNCM hinterlegt wurde.
  • In der bevorzugten Ausführungsform eines Immunonachweiskits gemäß der Erfindung werden der erste und der zweite Antikörper so gewählt, dass ihre jeweiligen Erkennungsstellen bezüglich des Proteins sehr weit voneinander entfernt liegen, um jedes kompetitive Bindungsereignis eines Antikörpers gegenüber dem anderen auf dem Protein zu vermeiden, das in einem Fall, bei dem die jeweiligen Erkennungsstellen der beiden Antikörper zu nahe beieinander liegen, durch ein Phänomen der sterischen Hinderung hervorgerufen werden könnte.
  • So handelt es sich in einer bevorzugten Ausführungsform eines Nachweiskits gemäß der Erfindung bei dem ersten Antikörper, der spezifisch an den N-terminalen Bereich des Proteins ESM-1 bindet, um den Antikörper, der von der Hybridomlinie MEC15 produziert wird. Gemäß dieser bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Antikörper, der spezifisch an den C-terminalen Bereich des Proteins ESM-1 bindet, um den von der Hybridomlinie MEP14 produzierten monoklonalen Antikörper.
  • Allgemein kann ein Antikörper, der gegen den C-terminalen Bereich des Proteins ESM-1 gerichtet ist, gemäß der von BECHARD et al. (2000) beschriebenen Technik ausgewählt werden, die darin besteht, einen Expressionsvektor, der ein DNA-Insert umfasst, das für den C-terminalen Bereich des Proteins ESM-1, der mit dem Protein GST fusioniert ist, codiert, herzustellen, dann Mäuse mit dem gereinigten Protein ESM-1 zu immunisieren, das ausgehend von Zelllysaten von Zellen von Escherichia coli erhalten wird, die mit dem oben genannten Expressionsvektor transformiert sind. Nach der Fusion der Milzzellen der so immunisierten Mäuse mit Myelomzellen, um eine Reihe von Hybridomen zu erhalten, die monoklonale Antikörper produzieren, können die interessierenden Antikörper, die spezifisch an den C-terminalen Bereich des Proteins ESM-1 binden, durch Epitopenmapping mit Hilfe von Peptiden ausgewählt werden, die von ESM-1 abgeleitet sind und progressive Deletionen des N-terminalen Endes des C-terminalen Bereichs dieses Proteins enthalten.
  • Ebenso kann der Fachmann Antikörper, die spezifisch an den N-terminalen Bereich des ESM-1-Proteins binden, auswählen, indem er Mäuse mit dem vollständigen ESM-1-Protein, vorzugsweise dem von einer eukaryontischen Wirtszelle produzierten vollständigen ESM-1-Protein, immunisiert, dann daraus eine Reihe von Hybridomlinien ausgehend von den Milzzellen der immunisierten Mäuse produziert, dann interessierende Antikörper auswählen, die spezifisch an den N-terminalen Bereich binden, zum Beispiel durch kompetitive Immunonachweistests mit den Antikörpern, die spezifisch an den C-terminalen Bereich von ESM-1 binden. Die interessierenden Antikörper sind solche, die nicht mit den für den C-terminalen Bereich von ESM-1 spezifischen Antikörpern in Konkurrenz treten, d.h. die Antikörper, die mit keinem der für die antigenen Determinanten D1, D2 und D3 des Proteins ESM-1 spezifischen Antikörper in Konkurrenz treten.
  • Vorzugsweise ist einer der beiden Antikörper, die den Nachweiskit gemäß der Erfindung bilden, auf einem Träger immobilisiert. Der Träger, auf dem der Antikörper immobilisiert ist, kann beliebiger Art sein, die dem Fachmann auf dem Gebiet der Immunonachweistests, insbesondere der Immunonachweistests des Sandwichtyps, bekannt ist.
  • Zum Beispiel kann der Träger, auf dem der Antikörper immobilisiert ist, ein in Wasser unlösliches, poröses oder nichtporöses Material sein. Der Träger kann hydrophil sein oder hydrophil gemacht werden können und umfasst anorganische Pulver, wie Siliciumoxid, Magnesiumsulfat, und Aluminium, natürliche polymere Materialien, insbesondere Cellulosematerialien und Materialien, die von Cellulose abgeleitet sind, natürliche oder synthetische Polymere, wie Nitrocellulose, Celluloseacetat, Polyvinylchlorid, Polyacrylamid, vernetztes Dextran, Agarose, Polyacrylat, Polyethylen, Polypropylen, Poly-4-methylbuten, Polystyrol, Polymethacrylat, Polyethylenterephthalat, Nylon, Polyvinylbutyrat, bestimmte Arten von Glas, wie Bioglas, oder Keramiken.
  • Die Bindung eines Antikörpers gemäß der Erfindung an einen Träger kann mit Techniken durchgeführt werden, die dem Fachmann wohlbekannt sind. Der Träger kann in verschiedenen Formen auftreten, einschließlich in Form von Bändern oder Teilchen, wie Kugeln. Die Oberfläche des Trägers kann multifunktionell sein oder multifunktionalisiert werden können, wobei man Antikörper über kovalente oder nichtkovalente Wechselwirkungen, die spezifisch oder unspezifisch sein können, fixiert.
  • Zum Beispiel kann sich der Fachmann für die Immobilisierung eines Antikörpers auf einem Träger vorteilhafterweise auf das US-Patent Nr. 4,168,146 oder auch das US-Patent Nr. 4,347,311 beziehen.
  • Vorteilhafterweise ist einer der Antikörper, die den Nachweiskit gemäß der Erfindung bilden, kovalent an ein Molekül gebunden, das seinen direkten oder indirekten Nachweis ermöglicht.
  • In der Ausführungsform, bei der einer der Antikörper auf einem Träger immobilisiert ist, ist der andere Antikörper vorzugsweise kovalent an ein Molekül gebunden, das seinen direkten oder indirekten Nachweis ermöglicht.
  • Das nachweisbare Molekül kann isotopisch oder nichtisotopisch sein.
  • Zum Beispiel, aber ohne Einschränkung, kann das nachweisbare Molekül in eine katalytische Reaktion eingreifen, wie ein Enzym, ein Enzymfragment, ein Enzymsubstrat, ein Enzyminhibitor, ein Coenzym oder ein Katalysator. Das nachweisbare Molekül kann auch ein Chromogen, wie ein Fluorophor, ein Farbstoff oder ein chemilumineszentes Molekül sein.
  • Somit kann es sich bei dem nachweisbaren Molekül um ein fluoreszentes Molekül, wie die von ICHINOSE et al. (1981) beschriebenen Moleküle, oder auch um fluoreszierende Isothiocyanat-Derivate, Phycoerythrin, Rhodaminisothiocyanat, Dansylchlorid oder auch die Verbindung XRITC, das Protein GFP ("grünes fluoreszierendes Protein") des Fischs Aequorea victoria und seine zahlreichen Derivate oder auch das Protein YFP ("gelbes fluoreszierendes Protein") sowie das Protein Luciferase handeln.
  • Von den nachweisbaren Molekülen, die eine katalytische Aktivität besitzen, sind die bevorzugten Moleküle die folgenden Enzyme gemäß der internationalen Klassifizierung I.U.B.: (i) die Oxidoreductasen der Klasse 1 und (ii) die Hydrolasen der Klasse 3. Die bevorzugten Oxidoreductasen sind (i) die Dehydrogenasen der Klasse 1.1, insbesondere 1.1.1, 1.1.3 und 1.1.99, und (ii) die Peroxidasen der Klasse 1.11 und (iii) Hydrolasen der Klasse 3.1 und insbesondere der Klasse 3.1.3 und der Klasse 3.2, insbesondere 3.2.1. Die bevorzugten Dehydrogenasen sind die Malat-Dehydrogenase, die Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase und die Lactat-Dehydrogenase. Die bevorzugte Oxidase ist die Glucose-Oxidase. Die bevorzugte Peroxidase ist die Meerrettich-Peroxidase. Die bevorzugten Hydrolasen sind die Alkalischen Phosphatasen, die β-Glucosidase und das Lysozym.
  • Das nachweisbare Molekül kann auch ein radioaktiv markiertes Molekül sein, zum Beispiel durch ein Isotop, das aus [3H], [32P] und [125I] ausgewählt ist.
  • In der Ausführungsform, bei der das nachweisbare Molekül einen indirekten Marker darstellt, kann einer der Antikörper, die einen Nachweiskit gemäß der Erfindung bilden, kovalent an einen Liganden, wie Biotin oder Streptavidin, gebunden sein.
  • In dieser besonderen Ausführungsform wird das nachweisbare Molekül so ausgewählt, dass es an den Liganden bindet, der kovalent an den Antikörper gebunden ist. Das nachweisbare Molekül kann zum Beispiel selbst an Biotin oder an Streptavidin gebunden sein.
  • Gemäß noch einer anderen Ausführungsform eines Nachweiskits gemäß der Erfindung kann das Mittel zum Nachweis der Bildung eines Komplexes zwischen dem in der getesteten Probe vorhandenen Protein ESM-1 und einem der für das Protein ESM-1 spezifischen Antikörper ein Antikörper sein, zum Beispiel ein Antikörper, der spezifisch an den Fc-Teil des Anti-ESM-1-Antikörpers binden kann, oder auch ein Antikörper, der spezifisch an den Isotyp binden kann, zu dem der betreffende Anti-ESM-1-Antikörper gehört, zum Beispiel ein Antikörper, der die Maus-Antikörper des Isotyps IgG1 spezifisch erkennt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform eines Nachweiskits gemäß der Erfindung ist der Antikörper, der spezifisch den C-terminalen Bereich des ESM-1-Proteins erkennt, auf einem Träger immobilisiert.
  • Vorteilhafterweise ist ein solcher Nachweiskit einer, bei dem der vom Hybridom MEP14 (CNCM Nr. I-1942) produzierte Antikörper auf dem Träger immobilisiert ist und der Antikörper, der spezifisch an den N-terminalen Bereich des Proteins ESM-1 bindet, ist der Antikörper, der vom Hybridom MEC15 (CNCM Nr. I-2572) produziert wird.
  • Das Nachweiswerkzeug kann also ein biotinylierter monoklonaler Antikörper sein, zum Beispiel von der Ratte, der spezifisch die Maus-Antikörper des Isotyps IgG1 erkennt, wobei das Nachweissystem von einem Streptavidin-Peroxidase-Konjugat gebildet werden kann.
  • Immunonachweisverfahren gemäß der Erfindung
  • Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zum Nachweis des Proteins ESM-1 in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte umfasst:
    • a) In-Kontakt-Bringen der zu testenden Probe mit einem ersten Antikörper, der spezifisch an den N-terminalen Bereich des Proteins ESM-1 zwischen der Aminosäure auf Position 20 und der Aminosäure auf Position 78 bindet, oder mit einem ersten Antikörper, der an den C-terminalen Bereich des Proteins ESM-1 bindet;
    • b) In-Kontakt-Bringen des Komplexes, der gegebenenfalls zwischen dem in der Probe vorhandenen Protein ESM-1 und dem ersten Antikörper gebildet wurde, mit einem zweiten Antikörper, der spezifisch an den Bereich des Proteins ESM-1 bindet, der aus dem N-terminalen Bereich zwischen der Aminosäure auf Position 20 und der Aminosäure auf Position 78 und dem C-terminalen Bereich ausgewählt ist, je nachdem, welcher Bereich vom ersten Antikörper nicht erkannt wurde; und
    • c) Nachweisen des zwischen dem Protein ESM-1 und dem zweiten Antikörper gebildeten Komplexes.
  • Unter "Komplex, der zwischen dem Protein ESM-1 und dem zweiten Antikörper gebildet wurde," versteht man den Komplex, der zwischen
    • – dem Komplex, der zwischen dem Protein ESM-1 und dem ersten Antikörper gebildet wurde, und
    • – dem zweiten Antikörper
    gebildet wurde.
  • Gemäß einer ersten Ausführungsform des obigen Immunonachweisverfahrens ist der erste oder der zweite Antikörper auf der Oberfläche eines Trägers immobilisiert.
  • Gemäß einer zweiten Ausführungsform des obigen Immunonachweisverfahrens ist der Antikörper, der auf einem Träger immobilisiert ist, ein Antikörper, der spezifisch an den C-terminalen Bereich des Proteins ESM-1 bindet, und der zweite Antikörper ist ein Antikörper, der spezifisch an den N-terminalen Bereich dieses Proteins bindet.
  • Gemäß einer dritten besonderen Ausführungsform des Immunonachweisverfahrens bindet der Antikörper, der auf einem Träger immobilisiert ist, spezifisch an den N-terminalen Bereich des Proteins ESM-1 zwischen der Aminosäure auf Position 20 und der Aminosäure auf Position 78, und der zweite Antikörper bindet spezifisch an den C-terminalen Bereich dieses Proteins.
  • Die Antikörper, die spezifisch an den N-terminalen oder C-terminalen Bereich von ESM-1 binden, sind wie zuvor definiert.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform des Nachweisverfahrens gemäß der Erfindung ist der Antikörper, der spezifisch an den N-terminalen Bereich des Proteins ESM-1 bindet, der Antikörper MEC15, der von dem Hybridom produziert wird, das am 17. Oktober 2000 unter der Zugriffsnummer I-2572 bei der CNCM hinterlegt wurde.
  • Der zweite Antikörper kann der Antikörper MEP14 sein, der von dem Hybridom produziert wird, das am 19. November 1997 unter der Nr. I-1942 bei der CNCM hinterlegt wurde.
  • Der Schritt c) des obigen Verfahrens kann mit Hilfe eines biotinylierten Antikörpers durchgeführt werden, der an den zweiten Antikörper binden kann, wobei das nachweisbare Molekül aus einem Konjugat des Typs Streptavidin-Peroxidase bestehen kann.
  • Anwendungen des Nachweisverfahrens gemäß der Erfindung
  • Die Anmelderin hat gezeigt, dass das Immunonachweisverfahren für das Protein ESM-1 gemäß der Erfindung es erlaubt, die Serumkonzentration des Proteins ESM-1 beim Menschen, insbesondere bei von Sepsis betroffenen Patienten, mit hoher Empfindlichkeit zu quantifizieren, und es erlaubt, eine Korrelation zwischen der Menge des zirkulierenden Proteins ESM-1 und der Schwere der Sepsis bei den Patienten festzustellen.
  • Gemäß der Norm, die von der American College of Chest Physicians/Society of Critical Care Medicine Consensus Conference definiert wurde (1992, Definitionen für Sepsis und multiples Organversagen sowie Richtlinien für die Verwendung von innovativen Therapien in Sepsis, Crit. Care Med., Vol. 20: 864-874), kann die Sepsis in drei Kategorien zunehmender Schwere unterteilt werden: Sepsis, schwere Sepsis und septischer Schock.
  • Dank des Immunonachweisverfahrens gemäß der Erfindung wurde eine Korrelation zwischen der Schwere der Sepsis und der Konzentration des zirkulierenden Proteins ESM-1 bei den Patienten festgestellt.
  • Außerdem erlaubte es die hohe Empfindlichkeit des Immunonachweistests gemäß der Erfindung, zu zeigen, dass die Patienten, die von einer einfachen Sepsis betroffen sind, eine Konzentration des zirkulierenden Proteins ESM-1 zeigten, die, obwohl gering, signifikant nachweisbar ist und signifikant über (p < 0,001) der Konzentration des Proteins ESM-1 liegt, die man im Serum von gesunden Freiwilligen findet.
  • Bisher wurde die Entwicklung der Sepsis bei einem Patienten anhand der Quantifizierung von drei Markern verfolgt, und zwar reaktives Protein C, lösliches Protein ICAM-1 und Procalcitonin.
  • Gemäß der Erfindung wurde gezeigt, dass die Entwicklung der Mengen an reaktivem Protein C und löslichem Protein ICAM-1 nicht mit der Entwicklung der Konzentration von ESM-1 korreliert.
  • Dagegen gibt es eine gute Korrelation zwischen der Entwicklung der Mengen an Procalcitonin und Protein ESM-1. Die biologische Bedeutung des Procalcitonins im Falle einer Sepsis ist jedoch nicht bekannt, und dieses Protein bildet also keinen guten biologischen Marker für die Entwicklung einer Sepsis.
  • Dagegen bildet das Protein ESM-1 aufgrund seiner Rolle bei der Regulation der Entzündungsreaktionen einen neuen Marker für die Entwicklung einer Sepsis, dessen physiologische Bedeutung direkt mit der unkontrollierten Entwicklung der Entzündungsreaktion verknüpft ist, insbesondere der Rekrutierung von Leukocyten während der Phänomene der Extravasation und der massiven Infiltration dieser Zellen in den verschiedenen Geweben, insbesondere Lungengeweben, Phänomene, die eine Veränderung der endothelialen Gefäßwand verursachen oder wenigstens mit einer solchen einhergehen.
  • Somit hat die Anmelderin gezeigt, dass der Immunonachweistest der Erfindung den Nachweis von schwachen Konzentrationen von zirkulierendem Protein ESM-1 in der Größenordnung von 1 bis 3 Nanogramm pro Milliliter erlaubt, wobei diese geringen Konzentrationen, die man bei atopischen Patienten findet, eindeutig von den basalen Konzentrationen in der Größenordnung von Nanogramm/ml oder noch weniger, die man bei gesunden Freiwilligen misst, unterschieden werden können.
  • Außerdem wurde gezeigt, dass die Menge an ESM-1 im Serum, die man bei von Sepsis betroffenen Patienten findet, eine zuverlässige Voraussage der Mortalität bei diesen Patienten erlaubt. So wiesen von 68 getesteten Patienten die Patienten, die 10 Tage nach ihrer Aufnahme ins Krankenhaus gestorben waren, am Tag 0 und am Tag 1 Konzentrationen an zirkulierendem ESM-1 auf, die signifikant höher waren als die Konzentrationen an ESM-1, die man im Serum der überlebenden Patienten findet (10,6 ± 0,8 Nanogramm pro ml bei den gestorbenen Patienten gegenüber 4,0 ± 0,6 Nanogramm pro ml bei den überlebenden Patienten [p > 0,01]).
  • Diese enge Korrelation zwischen der zirkulierenden Menge des Proteins ESM-1 und der Prognose der Mortalität bei den Patienten wird bei den klassischen Markern der Sepsis, d.h. dem reaktiven Protein C, Procalcitonin und dem löslichen Protein ICAM-1, nicht gefunden.
  • Die Messung der Konzentration von zirkulierendem ESM-1 bei einem Patienten reicht jedoch alleine nicht aus, um eine medizinische Diagnose durchzuführen, die es dem Arzt erlaubt, therapeutische Maßnahmen zu ergreifen, die an den globalen Zustand des Patienten angepasst sind.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung eines Nachweiskits für das Protein ESM-1 gemäß der Erfindung zum Nachweisen von Veränderungen der endothelialen Gefäßwand beim Menschen, insbesondere bei Patienten, in vitro.
  • Die Erfindung bezieht sich auch auf die Verwendung eines Nachweiskits für das Protein ESM-1, wie er oben definiert ist, für die in-vitro-Verfolgung eines Markers der Schwere einer Sepsis bei einem Patienten.
  • Gemäß der Erfindung wird auch gezeigt, dass eine Konzentration des zirkulierenden Proteins ESM-1 oberhalb der normalen Konzentration bei Patienten gefunden wird, die eine Organtransplantation erhalten haben und mit einer immunsupprimierenden Verbindung behandelt wurden. Bei diesen Patienten, die eine Transplantation erhalten haben und mit einer immunsupprimierenden Verbindung behandelt wurden, zeigt die Erhöhung der Konzentration des zirkulierenden Proteins ESM-1 eine cytotoxische Aktivität der immunsupprimierenden Verbindung gegenüber Endothelzellen, insbesondere Endothelzellen der Gefäßwand, an.
  • So ermöglicht die Verwendung eines Immunonachweiskits für das Protein ESM-1 gemäß der Erfindung die Nachsorge von Patienten, die mit immunsupprimierenden Verbindungen behandelt wurden, und die Bestimmung des Zeitpunkts, wenn diese Immunsuppressoren cytotoxisch werden.
  • Der Nachweis von Mengen an zirkulierendem ESM-1 oberhalb der normalen Menge bei diesen Patienten kann für den Arzt ein Hinweis sein, der es ihm erlaubt, die Dosen der verabreichten immunsupprimierenden Verbindungen zu reduzieren, wenn diese Maßnahme mit anderen physiologischen Parametern des Patienten assoziiert ist.
  • Gemäß einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung eines Immunonachweiskits gemäß der Erfindung zur Quantifizierung des Proteins ESM-1 in vitro bei einem Patienten, der mit einer immunsupprimierenden Verbindung behandelt wird, insbesondere bei einem Patienten, der eine Organtransplantation erhalten hat.
  • Die Anmelderin hat auch eine signifikante Erhöhung der Menge an zirkulierendem Protein ESM-1 bei Patienten gezeigt, die an Krebs, insbesondere broncho-pulmonalem Krebs, leiden.
  • Gemäß noch einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung eines Immunonachweiskits, wie es oben definiert ist, für die in-vitro-Quantifizierung des Proteins ESM-1 bei einem Patienten, der unter einer Krebserkrankung leidet.
  • Allgemein deutet eine Menge an zirkulierendem Protein ESM-1 von über 1 Nanogramm pro ml auf eine Veränderung der Endotheizellen der Gefäßwand hin und kann somit einen Parameter darstellen, der bei der Etablierung einer klinischen Diagnose eines Patienten durch einen Arzt in Betracht zu ziehen ist, wobei man sich darüber im Klaren sein sollte, dass dieser alleinige Parameter, isoliert genommen, es für sich genommen nicht erlaubt, irgendeine therapeutische oder klinische Diagnose eines Patienten zu etablieren.
  • Die vorliegende Erfindung wird außerdem anhand der folgenden Figuren und Beispiele erläutert, ohne auf diese beschränkt zu sein:
  • Figuren
  • 1 zeigt einen Vergleich der Nachweisempfindlichkeit des Immunonachweistests des Proteins ESM-1 gemäß der Erfindung (leere Kreise) mit dem von BECHARD et al. (2000) beschriebenen Nachweistest, der durch ausgefüllte Kreise dargestellt wird. Die Skala der Ordinate stellt die Konzentration des Proteins ESM-1 in der zu testenden Probe dar, die in Nanogramm pro ml ausgedrückt wird. Auf der Skala der Abszisse ist die optische Dichte dargestellt.
  • 2 zeigt die Immunonachweisprofile, die gemäß der immunoenzymatischen Technik des Sandwichtyps realisiert werden. In allen Fällen ist der vom Hybridem MEP14 produzierte monoklonale Antikörper auf einer Mikrotiterplatte adsorbiert. Auf der Skala der Abszisse tritt der Wert der optischen Dichte auf. Auf der Skala der Ordinate ist die Konzentration an Protein ESM-1, die von den Zellen der Linie HEK293 produziert wird, in Nanogramm pro ml dargestellt. Der zweite Antikörper, der in dem Immunonachweistest verwendet wird, ist ein Antikörper, der spezifisch gegen den N-terminalen Bereich des Proteins ESM-1 gerichtet ist. Es handelt sich um den Antikörper MEC2 (2A), MEC15 (2B) und MEC36 (2C).
  • 3 zeigt einen Vergleich der Konzentration des Proteins ESM-1, die man im Plasma oder Serum von gesunden Freiwilligen oder von Patienten findet. Die Skala der Ordinate stellt die Serumkonzentration des Proteins ESM-1 dar, ausgedrückt in Nanogramm pro ml. Die Skala der Abszisse stellt die Plasmakonzentration des Proteins ESM-1 dar, ausgedrückt in Nanogramm pro ml.
  • 4 zeigt die Menge des zirkulierenden Proteins ESM-1, die man im Serum von gesunden Freiwilligen oder von Patienten, die unter einer Sepsis mit wachsender klinischer Schwere leiden, findet. Die in Nanogramm pro ml ausgedrückte Serumkonzentration des Proteins ESM-1 ist auf der Ordinate dargestellt. Auf der Abszisse sind die verschiedenen Populationen von getesteten Individuen dargestellt, und zwar gesunden Probanden (CTRL) sowie Patienten, die unter Sepsis, schwerer Sepsis oder septischem Schock gemäß der klinischen Definition, die in Crit. Care Med., 1992, Vol. 20: 864-874, veröffentlicht ist, leiden.
  • 5 zeigt die Quantifizierung von drei Sepsismarkern bei Populationen von gesunden Patienten oder von Patienten, die unter Sepsis, schwerer Sepsis oder septischem Schock leiden.
  • 5A zeigt die Quantifizierung des löslichen Proteins ICAM-1 im Serum, ausgedrückt in Nanogramm pro ml.
  • 5B zeigt die Quantifizierung des reaktiven Proteins C, ausgedrückt in Milligramm pro ml.
  • 5C zeigt die Quantifizierung von Serum-Procalcitonin, ausgedrückt in Nanogramm pro ml.
  • 6 zeigt einen Vergleich zwischen den Mengen an zirkulierendem Protein ESM-1 und von jedem der drei klassischen Sepsismarker, und zwar des löslichen Proteins ICAM-1, des reaktiven Proteins C und des Procalcitonins am Tag 0 der Aufnahme der Patienten ins Krankenhaus jeweils bei den überlebenden und bei den gestorbenen Patienten.
  • 6A zeigt die Serumkonzentration des Proteins ESM-1, ausgedrückt in Nanogramm pro ml.
  • 6B zeigt die Serumkonzentration des löslichen Proteins ICAM-1, ausgedrückt in Nanogramm pro ml.
  • 6C zeigt die Konzentration des reaktiven Proteins C, ausgedrückt in Nanogramm pro ml.
  • 6D zeigt die Konzentration von Procalcitonin, ausgedrückt in Nanogramm pro ml.
  • 7 zeigt den prognostischen Wert der Menge des Proteins ESM-1 oder des löslichen Proteins ICAM-1 bei Patienten am Tag 0 und am Tag 1 nach der Aufnahme ins Krankenhaus in Bezug auf ihre Mortalität.
  • 7A zeigt die in Nanogramm pro ml ausgedrückte Konzentration des Proteins ESM-1, die man jeweils bei den überlebenden Patienten (ausgefüllter Kreis) und den gestorbenen Patienten (leerer Kreis) jeweils am Tag 0 und am Tag 1 nach der Aufnahme ins Krankenhaus findet.
  • 7B zeigt die Serumkonzentration des löslichen Proteins ICAM-1 bei denselben Patienten.
  • 8 zeigt den prognostischen Wert der Konzentration des Proteins ESM-1 und des löslichen Proteins ICAM-1, gemessen am Tag 0 und am Tag 1 nach der Aufnahme ins Krankenhaus, in Bezug auf die Mortalität.
  • 8A zeigt die in Nanogramm pro ml ausgedrückte Serumkonzentration des Proteins bei den überlebenden Patienten (ausgefüllter Kreis) und den gestorbenen Patienten (leerer Kreis).
  • 8B zeigt die in Nanogramm pro ml ausgedrückte Serumkonzentration des löslichen Proteins ICAM-1 bei den überlebenden Patienten (ausgefüllter Kreis) und den gestorbenen Patienten (leerer Kreis).
  • Beispiele
  • Beispiel 1: Herstellung der monoklonalen Antikörper, die spezifisch an den N-terminalen Bereich des von eukaryontischen Zellen produzierten Proteins ESM-1 binden.
  • Um monoklonale Anti-ESM-1-Antikörper zu erhalten, die gegen den N-terminalen Bereich des Proteins ESM-1, der reich an Cysteinresten ist, gerichtet sind, wurde die native Form des Proteins ESM-1 gereinigt, die von der CHO-Zelllinie produziert wurde, die mit einem Expressionsvektor transfiziert ist, der ein DNA-Insert enthält, das für das Protein ESM-1 codiert.
  • Die cDNA-Sequenz, die für das Protein ESM-1 codiert, wird als Sequenz SEQ ID Nr. 2 des Sequenzprotokolls bezeichnet.
  • Die cDNA von ESM-1 wird in den eukaryontischen Expressionsvektor pcDNA3 (Invitrogen) eingefügt, und dann werden die CHO-Zellen mittels Lipofectamin (Gibco) nach den Empfehlungen des Herstellers damit transfiziert. 48 h nach der Transfektion werden die Zellen in Gegenwart eines Selektionsmittels (G418, Gibco) in einer Dosis von 1000 Mikrogramm/ml übergeimpft. Nach zwei Wochen Selektion werden die CHO-Zellen, die gegenüber G418 resistent sind, durch Grenzverdünnung kloniert. Klone, die ESM-1 exprimieren, werden anschließend selektiert und CHO-ESM genannt (bei der CNCM hinterlegt).
  • Für die Produktion werden die CHO-ESM-Zellen in Suspension in einem konditionierten Medium ohne fetales Kälberserum (Medium CHO SFM II, Gibco) kulti viert. Der Überstand wird auf pH 8 eingestellt und auf eine DEAE-Sepharose-Säule (Pharmacia) gegeben. Die Säule wird mit einem 50 mM Tris-Puffer, pH 8, 0,2 M NaCl, gewaschen. Das ESM-1-Molekül wird in einem 50 mM Tris-Puffer, pH 8, 1 M NaCl, eluiert. Das Eluat wird anschließend in einem 50 mM Tris-Puffer, pH 8, 1:4 verdünnt und in Gegenwart von monoklonalen Anti-ESM-1-Antikörpern (MEC4), die auf Agarose (Biorad) immobilisiert sind, inkubiert. Nach einer Nacht Inkubation bei 4 °C unter Rühren werden die Agarosekugeln mit dem 50 mM Tris-Puffer, pH 8, 0,2 M NaCl, gewaschen. ESM-1 wird mit 3 M MgCl2 eluiert. Das Eluat wird konzentriert und im 50 mM Tris-Puffer, pH 8, 0,5 M NaCl, dialysiert und bei –70 °C gelagert.
  • Balb/c-Mäuse wurden durch Injektion von 10 μg gereinigtem rekombinantem ESM-1-Protein pro Maus gemäß einer Standardimmunisierungsvorschrift in Gegenwart von Freunds Adjuvans immunisiert.
  • Die Hybridomzellen, die die monoklonalen Anti-ESM-1-Antikörper sezernieren, wurden durch Fusion, Screening und Subklonierung gemäß der von BECHARD et al. (2000) beschriebenen Technik gewonnen.
  • Fünf Hybridomzellklone wurden erhalten und generisch als MEC ("mouse monoclonal antibody to ESM-1 produced by CHO cells") bezeichnet.
  • Vier der selektierten Hybridome gehören zum Isotyp IgG1,k, und zwar die als MEC4, MEC5, MEC15 und MEC36 bezeichneten Hybridome.
  • Eines der Hybridome gehört zum Isotyp IgM,k, und zwar das Hybridom MEC11.
  • Die Hybridomzellklone wurden in Kulturmedium in Abwesenheit von Serum kultiviert, und die Anti-ESM-1-Antikörper wurden durch Chromatographie auf G-Sepharose-Proteinsäule, die von der Firma Pharmacia (Uppsala, Schweden) vertrieben wird, gereinigt.
  • Beispiel 2: Selektion der monoklonalen Antikörper, die spezifisch gegen den N-terminalen Teil des Proteins ESM-1 gerichtet sind, das von den Zellen der CHO-Linie produziert wird
  • Die MEC-Antikörper der Klasse IgG1,k werden anhand der Persistenz einer starken Bindung der Antikörper der Reihe MEC an ESM/Fc in Gegenwart von MEP-Antikörpern eines anderen Isotyps und bei einer Endkonzentration von 1 μg/ml selektiert. Die Tests werden durch ELISA gemäß den oben für die Selektion der MEP- und MEC-Antikörper beschriebenen Beispielen durchgeführt (insbesondere durch kompetitive Immunonachweisexperimente, die von LASSALLE et al. (1996) beschrieben wurden).
  • Beispiel 3: Immunonachweistest des Proteins ESM-1 gemäß der Erfindung
  • Der Immunonachweistest besteht in einem immunoenzymatischen Test des Sandwichtyps, dessen allgemeine Merkmale mit den von BECHARD et al. (2000) beschriebenen identisch sind.
  • Der von der Hybridomlinie MEP14 (CNCM Nr. I.1942) produzierte monoklonale Anti-ESM-1-Antikörper wurde in einem 0,1 M Carbonatpuffer, pH 9,5, auf eine Konzentration von 5 μg/ml verdünnt und über Nacht bei +4 °C auf einer 96-Napf-Platte (EIA/RIA-Platte, Costar, Cambridge, MA, USA) adsorbiert.
  • Die Platte wurde eine Stunde lang bei Labortemperatur mit einem Volumen von 200 μl pro Napf an PBS-Puffer, der 0,1% Rinderserumalbumin und 5 mM EDTA enthielt, gesättigt, dann zweimal mit einem ELISA-Puffer (dem obigen PBS-Puffer, der mit 0,1% Tween 20 versetzt wurde) gewaschen.
  • Eine Eichung wurde mit dem Protein ESM-1 vorgenommen, das gemäß der von BECHARD et al. (2000) beschriebenen Technik gereinigt worden war.
  • Aus den Blutproben wurde eine Verdünnungsreihe (1:2 bis 1:128) in einem ELISA-Puffer hergestellt, und die Verdünnungen wurden eine Stunde lang bei Labortemperatur auf einer ELISA-Platte inkubiert.
  • Die Näpfe wurden dreimal mit einem ELISA-Puffer gewaschen und dann 1 Stunde lang bei Labortemperatur mit einem zweiten, gegen ESM-1 gerichteten monoklonalen Antikörper, dem Antikörper MEC15 (CNCM Nr. I-2572), in einer Konzentration von 0,1 μg/ml in 100 μl Puffer pro Napf inkubiert.
  • Nach drei Waschvorgängen wurde ein in einem ELISA-Puffer verdünnter biotinylierter monoklonaler Rattenantikörper, der gegen Maus-IgG1 gerichtet war (von Pharmingen vertrieben), hinzugefügt, und es wurde eine Stunde lang mit diesem zweiten Antikörper inkubieren gelassen.
  • Nach drei Waschvorgängen im ELISA-Puffer wurden die Näpfe mit einem Streptavidin-Peroxidase-Konjugat in einer Verdünnung von 1:10 000 v/v (vertrieben von der Firma Zymed) inkubiert.
  • Nach 30 Minuten Inkubation mit dem Streptavidin-Peroxidase-Konjugat werden drei Waschvorgänge mit jedem Napf in einem ELISA-Puffer und dann zwei Waschvorgänge in einem PBS-Puffer durchgeführt.
  • Das Streptavidin-Peroxidase-Konjugat wird mit dem Substrat TMB, das von der Firma Sigma (Saint Louis, MO, USA) vertrieben wird, in Gegenwart von 5 ml H2O2 während 30 min nachgewiesen.
  • Die Nachweisreaktion wird durch Zugabe eines Volumens von 100 μl an 2 N H2SO4 abgebrochen.
  • Die Platte wird mit Hilfe eines Spektrophotometers (Anthos Labtec LP40, Frankreich) bei einer Wellenlänge von 405 Nanometer abgelesen.
  • Die Plasma- oder Serumkonzentration des Proteins ESM-1 wird ausgehend von den Messungen der optischen Dichte berechnet und in Nanogramm pro ml ausgedrückt.
  • Beispiel 4: Vergleichende Ergebnisse zur Bestimmung von ESM-1 mit dem Immunonachweistest gemäß der Erfindung und einem Immunonachweistest des Standes der Technik
  • Die vergleichenden Bestimmungen einer bekannten Konzentration des rekombinanten Proteins ESM-1, das in der transfizierten CHO-Zelllinie produziert und dann gemäß der Beschreibung in Beispiel 1 gereinigt wurde, wurden durchgeführt.
  • Die erste Bestimmung wurde gemäß der Lehre von Beispiel 3 durchgeführt. Kurz gesagt, der Antikörper MEP14 wurde auf einer 96-Napf-Platte des ELISA-Typs immobilisiert, dann mit einer Reihe von PBS-Pufferlösungen, die eine bekannte Konzentration des Proteins ESM-1 enthielten, in Kontakt gebracht. Nach dem Waschen wurde der zwischen dem immobilisierten Antikörper MEP14 und dem Protein ESM-1 gebildete Komplex mit einer Pufferlösung inkubiert, die den Antikörper MEP15 der Erfindung enthielt.
  • Nach einer neuen Reihe von Waschvorgängen wurde der gebildete Antigen/Antikörper-Komplex nacheinander mit einem biotinylierten Ratten-Anti-Maus-IgG1-Antikörper, dann mit einem Streptavidin-Peroxidase-Konjugat inkubiert, bevor der Nachweis mit Wasserstoffperoxid durchgeführt wurde.
  • Der zweite Test wurde unter denselben Bedingungen durchgeführt, aber unter Verwendung des Antikörpers MEP19, der auf der 96-Napf-Platte des ELISA-Typs immobilisiert war, und des Antikörpers MEP21 als zweiten Antikörper in dieser immunoenzymatischen Technik des Sandwichtyps.
  • Die Ergebnisse sind in 1 gezeigt.
  • Mit der Kombination von Antikörpern gemäß der Erfindung wird ein signifikanter Unterschied im Wert der optischen Dichte mit einer Konzentration des Proteins ESM-1 in der Größenordnung von 0,15 bis 0,2 Nanogramm pro Milliliter erhalten.
  • Dagegen wird mit einer Kombination der Antikörper MEP19 und MEP21 eine signifikante Erhöhung des Werts der optischen Dichte nur für eine ESM-1-Konzentration von 1 oder 2 Nanogramm pro ml erhalten.
  • Die in 1 dargestellten Ergebnisse zeigen eindeutig die große Empfindlichkeit des Immunonachweistests für das Protein ESM-1 gemäß der Erfindung im Vergleich zu einem Immunonachweistest des Standes der Technik, da man einen Unterschied der Empfindlichkeit vom 5- bis 10fachen zwischen diesen beiden Tests zugunsten des Immunonachweistests der Erfindung beobachtet.
  • Beispiel 5: Vergleichende Ergebnisse von Immunonachweistests unter Verwendung verschiedener Antikörper der Erfindung, die gegen den N-terminalen Bereich des ESM-1-Proteins gerichtet sind und durch die transfizierten Zellen der HEK293-Linie produziert wurden
  • Immunonachweistests des Sandwichtyps wurden gemäß der in Beispiel 3 beschriebenen Vorschrift durchgeführt.
  • In allen Fällen wurde der Antikörper MEP14 auf den Näpfen einer 96-Napf-Platte des ELISA-Typs immobilisiert. Nach der Inkubation der so hergestellten Platte mit Lösungen bekannter Konzentrationen an rekombinanten ESM-1, die von transfizierten Zellen der HEK293-Linie produziert wurden, und Waschen wurde der gebildete Antigen/Antikörper-Komplex in Gegenwart eines zweiten Antikörpers, und zwar des Antikörpers MEC2, des Antikörpers MEC15 und des Antikörpers MEC36, inkubiert.
  • Die Ergebnisse sind in 2 dargestellt.
  • Die Ergebnisse zeigen, dass die Verwendung von monoklonalen Antikörpern, die gegen den N-terminalen Bereich des rekombinanten ESM-1-Proteins, das von eukaryontischen Zellen produziert wurde, gerichtet sind, in einem immunoenzymatischen Test des Sandwichtyps eine Bestimmung des Proteins ESM-1 mit sehr hoher Empfindlichkeit, dessen Empfindlichkeit von einem Antikörper zum nächsten reproduzierbar ist, ermöglicht.
  • Für die Gesamtheit der getesteten Antikörper MEC15, MEC2 und MEC36 konnten Konzentrationen in der Größenordnung von 0,15 bis 0,2 Nanogramm pro ml ESM-1 nachgewiesen werden.
  • Beispiel 6: Anwendung des Immunonachweistests gemäß der Erfindung zum Quantifizieren des zirkulierenden ESM-1-Proteins bei Patienten, die unter mehr oder weniger schweren Formen einer Sepsis leiden
  • A. Materialien und Verfahren
  • A.1 Immunonachweistest
  • Der Immunonachweistest wurde gemäß der oben in Beispiel 3 beschriebenen Vorschrift durchgeführt.
  • A.2 Test der anderen Blutmarker
  • Der quantitative Test für das lösliche Protein ICAM-1 im Serum wurde mit einem kommerziellen ELISA-Test (Diaclone Research, Besançon, Frankreich) durchgeführt. Die Platte wird mit Hilfe eines Spektrophotometers (Anthos Labtec LP40, Frankreich) bei einer Wellenlänge von 450 Nanometer abgelesen. Die Serumkonzentration des löslichen ICAM-1 wurde ausgehend von den Messungen der optischen Dichte berechnet und in Nanogramm pro ml ausgedrückt. Der Normalwert der Konzentration des löslichen Proteins ICAM-1 betrug 571 ± 168 Nanogramm pro ml (219-1042; n = 77).
  • Der Test zur Quantifizierung des Proteins Procalcitonin wurde mit einem immunologischen Test des ILMA-Typs (Lumitest, B.R.A.M.S.-Diagnostica GmbH, Deutschland) durchgeführt.
  • Der Normalwert für Procalcitonin ist kleiner als 0,5 Nanogramm pro ml. Die Werte, die bei den Patienten mit systemischem inflammatorischem Response-Syndrom (SIRS für "systemic inflammatory response syndrome") gemessen wurden, liegen im Allgemeinen zwischen 0,5 und 2 Nanogramm pro ml.
  • Die Menge des reaktiven Proteins C wurde durch Immunonephelometrie gemessen. Der Normalwert ist kleiner als 10 mg/l (Morley et al., 1982, Ann. N.Y. Acad. Sci., Vol. 389: 406-418).
  • A.3 Probanden
  • Die Studie wurde mit vier Gruppen von Probanden durchgeführt, einer Gruppe von nicht atopischen gesunden Probanden (Geschlechterverhältnis gleich 1) und drei Gruppen von Patienten mit systemischen und/oder pulmonalen septischen entzündlichen Störungen (Geschlechterverhältnis gleich 1,6, Alter: 56 ± 2 Jahre).
  • Alle nichtatopischen gesunden Freiwilligen zeigten eine negative Reaktion auf den Hauttest der sofortigen Hypersensibilitätsreaktion, der auch "Pricktest" genannt wird, und zeigten auch keine klinische Vorgeschichte mit Allergien.
  • Keiner der 68 Patienten wurde zum Zeitpunkt der Entnahme von Blutproben mit Corticosteroid-Verbindungen behandelt oder erhielt eine Hämodialyse.
  • Das Versuchsprotokoll wurde vom Comité Locale d'Ethique des Hôpitaux d'Universités de Suisse genehmigt.
  • A.4 Definitionen Die folgenden Ausdrücke wurden für die Studie verwendet.
  • "Infektion" ist ein mikrobielles Phänomen, das durch eine Entzündungsreaktion auf die Anwesenheit von Mikroorganismen oder auf die Invasion von Gewebe des normalerweise sterilen Wirts durch diese Mikroorganismen gekennzeichnet ist.
  • "Systemisches inflammatorisches Response-Syndrom (SIRS für "systemic inflammatory response syndrome")" mit keinerlei Anzeichen einer Infektion ist durch die Anwesenheit von wenigstens zwei der vier folgenden klinischen Kriterien gekennzeichnet:
    • a) Fieber oder Hypothermie (Temperatur von über 100,4 °F [> 38 °C] oder unter 96,8 °F [< 36 °C]);
    • b) Tachykardie (> 90 Schläge pro Minute);
    • c) Tachypnoe (> 20 Atemzüge pro Minute oder PaCO2 < 4,3 kPa [32 mm Hg]); und
    • d) anomale Zahl von weißen Blutkörperchen von > 12 000 Zellen/mm3, < 4000 Zellen/mm3 oder Anwesenheit von mehr als 10% unreifen Formen.
  • "Sepsis" ist definiert als SIRS, das mit einer Infektion einhergeht.
  • "Schwere Sepsis" ist definiert als eine Sepsis, die mit einer Fehlfunktion, einer Hypoperfusion oder Hypotonie eines Organs einhergeht. Zu den Anomalien bei der Hypoperfusion und der Perfusion können unter anderem Oligourie (Exkretionsvolumen < 30 ml/h), Lactatacidose (Lactatserumspiegel über 2 mmol/l) oder eine akute Veränderung des Mentalstatus ohne Sedierung (Reduktion von wenigstens 3 Punkten gegenüber dem Basiswert gemäß dem Koma-Score des Glasgow-Typs).
  • "Septischer Schock" ist definiert als Vorhandensein einer Sepsis, die mit einer dauerhaften Reduktion des systolischen Blutdrucks einhergeht (< 90 mm Hg oder eine Reduktion von 40 mm Hg gegenüber dem Basiswert des systolischen Blutdrucks), welche mit der Anwesenheit von Perfusionsanomalien (siehe oben) verbunden ist, trotz adäquater Intensivbehandlung und Notwendigkeit von vasoaktiven Aminen, um einen adäquaten Blutdruck aufrechtzuerhalten (Crit. Care Med. 1992, Vol. 20: 864-874).
  • A.5 Beschreibung der Studie
  • Für jeden Patienten wurden die folgenden biologischen und klinischen Parameter erhalten: Alter, Geschlecht, Haupt- und Nebendiagnose, wie sie in Crit. Care Med. 1992, Vol. 20: 864-874, definiert sind, Anamnese, Behandlung, Vitalzustand 10 Tage vor der Entnahme von Blutproben, Serum- und Plasmakonzentration des Proteins ESM-1.
  • Bei den meisten Patienten wurden auch andere biologische Blutparameter gemessen, wie die Menge des zirkulierenden löslichen ICAM-1 (slICAM-1), des Procalcitonins (proCT) und des reaktiven Proteins C (CRP).
  • Die Blutproben wurden von jedem der Patienten (oder von jedem der gesunden Freiwilligen) in trockene Röhrchen und in EDTA-behandelte Röhrchen entnommen, dann 30 min lang mit einer Geschwindigkeit von 3500 U/min in einer Zentrifuge des Typs Jouan C3i (Frankreich) zentrifugiert.
  • Die Serum- und Plasmaproben wurden vor der Durchführung der Tests während einer kurzen Zeit bei –20 °C aufbewahrt.
  • Die Überlebenszeit bis zehn Tage nach Aufnahme ins Krankenhaus wurde gewählt, indem man postulierte, dass die Injektion bei diesen Patienten direkt zum Tod beigetragen hat oder dass der Beitrag der anfänglichen entzündlichen Störung im Vergleich zu anderen Todesursachen nicht ausgeschlossen werden konnte.
  • A.7 Statistische Analyse
  • Die Daten werden als Mittelwert plus/minus Standardfehler (des Mittelwerts) ausgedrückt.
  • Die Vergleiche der mittleren Konzentrationen an ESM-1, sICAM-1, Procalcitonin und CRP zwischen den unterschiedlichen Gruppen erfolgten unter Verwendung des einseitigen ANOVA-Tests (Bonferroni-Dunn), des Kruskal-Wallis-Tests und des Mann-Whitney-Tests.
  • Die Korrelation zwischen den Werten der Marker wurde dank des Spearman-Rangtests realisiert.
  • Die Korrelation zwischen der Konzentration des zirkulierenden Markers und der Schwere des Ausgangs für den Patienten wurde unter Verwendung des einseitigen ANOVA-Tests (Bonferroni-Dunn), des Mann-Whitney-Tests und des Wilcoxon-Tests realisiert.
  • Im Allgemeinen gilt ein Wert von p < 0,05 als statistisch signifikant.
  • Die Graphiken wurden in Form von Graphiken in vertikalen Balken realisiert, die durch ihren Median und den ersten und dritten Interquartilbereich dargestellt werden.
  • B. Ergebnisse
  • B.1 Korrelation zwischen den Plasma- und Serumspiegeln von ESM-1
  • In einem ersten Versuch wurde bestimmt, ob die Bedingungen der Entnahme der Blutproben den Wert der ESM-1-Konzentration beeinflussen können. Der Vergleich der Werte der Plasma- und Serumspiegel von ESM-1 bei 41 gesunden Probanden hat eine starke Korrelation (r = 0,85; p < 0,0001) gezeigt. In 3 kann man beobachten, dass bei den ersten sechsunddreißig Patienten der Studie wie in der Kontrollgruppe bei einem gegebenen Patienten kein signifikanter Unterschied zwischen der Plasma- und Serumkonzentration von ESM-1 beobachtet wird.
  • Diese Ergebnisse lassen zunächst vermuten, dass die Blutgerinnung die ESM-1-Konzentration nicht modifiziert. Diese Ergebnisse lassen ebenfalls vermuten, dass das Protein ESM-1 unterschiedslos ausgehend von Blut- oder von Plasmaproben quantifiziert werden kann.
  • Folglich wurde für den Rest der Studie nur die Serumkonzentration von ESM-1 verwendet.
  • B.2 Kontrollgruppe
  • Der Mittelwert der Serumkonzentration von ESM-1 betrug 0,7 ± 0,4 Nanogramm pro ml bei gesunden Probanden, wie in Tabelle 1 gezeigt ist, während die Serumkonzentration von ESM-1 in der Gruppe der atopischen Probanden 1,0 ± 0,1 Nanogramm pro ml betrug.
  • Obwohl der Unterschied gering ist, ist er statistisch signifikant (p < 0,05).
  • Folglich ist die Kontrollgruppe, von der in der Studie die Rede ist, die Gruppe von nichtatopischen gesunden Probanden, die representativ für die allgemeine Bevölkerung sind, und der Mittelwert der Konzentration von ESM-1 in dieser Gruppe von nichtatopischen gesunden Probanden wurde als Standardnormalwert bestimmt.
  • B.3 Gruppen von Patienten
  • Die Ergebnisse der zirkulierenden Marker in den Patientengruppen sind in Tabelle 1 zusammengefasst und in den 4 und 5 gezeigt.
  • Im Serum der Patienten, die wegen einer schweren Sepsis zugelassen wurden, sind die Konzentrationen von sESM-1, sICAM-1, CRP und proCT bei jeder Patientengruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe stark erhöht (Tabelle 1).
  • Diese gesteigerten Konzentrationen sind bei allen Markern und bei allen Patientengruppen mit Ausnahme von Procalcitonin in der Gruppe der Patienten, die unter Sepsis leiden, statistisch signifikant (p < 0,01 oder weniger) (Tabelle 1, 4 und 5).
  • Die Schwere der Krankheit wird einheitlich gemäß drei graduellen Niveaus definiert, die als Sepsis, schwere Sepsis bzw. septischer Schock bezeichnet werden. In jeder dieser Gruppen nehmen die Konzentrationen von ESM-1 statistisch korreliert mit der Schwere der Krankheit zu (p < 0,01, n = 61) (siehe Tabelle 2).
  • Ähnliche Erhöhungen wurden für die Konzentrationen an Serumprocalcitonin und CRP gefunden (p = 0,0001, n = 34, bzw. p < 0,01, n = 43).
  • Andererseits wird die Konzentration von sICAM-1 auf ungefähr das Fünffache des Normalwerts erhöht, zeigt aber bei jeder der Patientengruppen ein ähnliches Niveau.
  • Die Konzentrationen von CRP (ANOVA und Mann-Whitney) und ProCT (Mann-Whitney) erlauben eine Unterscheidung der Patientengruppen, die unter einer Sepsis leiden, von Patienten, die unter schwerer Sepsis leiden, was bei den Konzentrationen von ESM-1 nicht der Fall ist.
  • Die Konzentrationen von ESM-1 (ANOVA und Mann-Whitney) und ProCT (Mann-Whitney) erlauben eine Unterscheidung der Patientengruppen, die unter einer schweren Sepsis bzw. unter septischem Schock leiden, was bei den Konzentrationen von CRP nicht der Fall ist (siehe Tabelle 2).
  • Im Hinblick auf diese Ergebnisse ist die Konzentration von CRP anscheinend der empfindlichste Marker bei der am wenigsten schweren Krankheit, und die Konzentration von ESM-1 scheint bei schwererer Sepsis ein besserer Marker zu sein als der Marker ProCT.
  • Eine Suche nach einer Korrelation zwischen den Serumspiegeln von ESM-1, sICAM-1, CRP oder ProCT hat es ermöglicht, eine signifikante Korrelation zwischen der Konzentration von CRP und von Procalcitonin festzustellen (p < 0,01, Tabelle 3).
  • Es wurde jedoch keinerlei Korrelation zwischen den anderen Markern gefunden (siehe Tabelle 3).
  • Außerdem wurde in der Gruppe der Patienten, die unter septischem Schock leiden (Ergebnisse nicht gezeigt), keinerlei Korrelation zwischen den Konzentrationen von ESM-1 und Plasmacreatinin gefunden.
  • Um zu bestimmen, ob die Serumspiegel von ERSM-1 eine Vitalprognose ermöglichen, wurden in einem ersten Ansatz die mittleren Konzentrationen von Serum-ESM-1 zwischen den gestorbenen Patienten und den überlebenden Patienten miteinander verglichen.
  • Wenn alle Patienten ab der Zulassung zur Intensivbehandlung gemäß der fatalen oder nichtfatalen Entwicklung berücksichtigt werden, zeigen die Ergebnisse, dass die Serumkonzentration von ESM-1 am Tag der Aufnahme ins Krankenhaus (Tag 0) in der Gruppe von Patienten, die bis zum Tag 10 gestorben sind, signifikant größer ist (Tag 10; p < 0,01; 6A und 7A). Man kann unterstreichen, dass solche Unterschiede bei den anderen Markern sICAM-1, CRP oder ProCT nicht nachgewiesen werden (6B-9).
  • Gemäß einem zweiten Ansatz wurden die Konzentrationen von sESM-1 und sICAM-1 am Tage der Aufnahme ins Krankenhaus (Tag 0) und 24 Stunden später (Tag 1) gleichzeitig gemessen. Die Konzentration von ESM-1 am Tag 0 ist bei den gestorbenen Patienten signifikant größer als bei den überlebenden Patienten (7A). Dieser Unterschied dauert am Tag 1 an (n = 20, p < 0,05) (7A).
  • Ein solcher Unterschied kann mit keinem der anderen Marker sICAM-1 beobachtet werden (7B), weder mit CRP, noch mit Procalcitonin oder sICAM-1.
  • In der einzigen Gruppe der Patienten, die unter septischem Schock leiden, sind die Serumspiegel von ESM-1 am Tag 0 und am Tag 1 (n = 11) bei den gestorbenen Patienten signifikant größer als bei den überlebenden Patienten (8A-B).
  • In jeder Gruppe getrennt wurde keinerlei statistisch signifikante Korrelation zwischen den Konzentrationen von sICAM-1 am Tag 0, von sICAM-1 am Tag 1 (8B), von CRP am Tag 0 oder von ProCT am Tag 0 und dem Überleben jedes Patienten am Tag 10 gefunden.
  • Die in diesem Beispiel vorgestellten Ergebnisse zeigen, dass der Mittelwert der Konzentration des zirkulierenden Proteins ESM-1 im Vergleich zu den gesunden Probanden stark erhöht ist. Diese Erhöhung der mittleren Konzentration von zirkulierendem ESM-1 ist mit dem Niveau der klinischen Schwere der Krankheit korreliert. Die höchsten Konzentrationen an zirkulierendem ESM-1 im frühen Stadium der Krankheit sind mit einer geringeren Wahrscheinlichkeit des Überlebens des Patienten nach 10 Tagen verbunden.
  • Im Einklang mit den früheren Studien sind die zirkulierenden Marker, wie das reaktive Protein C oder CRP (Morley et al.), Procalcitonin oder ProCT (ASSICOT M. et al.; MULLER B. et al.; WANNER G.A. et al.) und das lösliche Protein ICAM-1 oder sICAM-1 (KAYAL S. et al., SESSLER C.N. et al. (1995), SESSLER C.N. et al. (1993), bei den Patienten der Studie ebenfalls signifikant erhöht. Die Marker CRP und ProCT sind mit der klinischen Schwere der Patienten korreliert.
  • Dagegen erlaubt es die Bestimmung der Konzentrationen der drei Marker CRP, ProCT und sICAM-1 nicht, eine Vitalprognose abzugeben, im Gegensatz zur Bestimmung der Konzentration des zirkulierenden Proteins ESM-1. Außerdem ist der Vorhersagewert der Serumkonzentration von ESM-1 hauptsächlich mit dem Anfangswert des Serum-ESM-1 am Tag 0 der Aufnahme ins Krankenhaus verbunden.
  • In dieser Studie ist die Erhöhung der Serumkonzentration von ESM-1 nicht mit einer Nierendysfunktion korreliert, wie dies anhand der Erhöhung der Plasmakonzentration von Creatinin gemessen wurde. Dieses Ergebnis lässt vermuten, dass die erhöhten Konzentrationen des Proteins ESM-1 im Serum bei den Patienten, die unter septischen Schocks leiden, aus veränderten pulmonalen Geweben oder Zellen der Gefäßwände im Stresszustand stammen.
  • Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Ergebnisse der in diesem Beispiel vorgestellten Studie darauf hinweisen, dass ESM-1 einen neuen Marker für die Dysfunktion der Endothelzellen bei unter einer Sepsis leidenden Patienten darstellt.
  • In Verbindung mit den Werten anderer Parameter von zirkulierenden Markern, wie den löslichen Adhäsionsmolekülen, den Cytokinen, Procalcitonin oder anderer Marker der spezifischen Dysfunktion bestimmter Zellen ist die Konzentration des Proteins ESM-1 geeignet, eine interessante Information über die klinische Schwere und den Ausgang bei den von Sepsis betroffenen Patienten zu liefern. Tabelle 1 Konzentrationswerte des zirkulierenden Proteins ESM-1 bei gesunden Freiwilligen und in verschiedenen Gruppen von Patienten, die von Sepsis betroffen sind
    Blutmarker
    Gruppe n sESM-1 (ng/ml) sICAM-14 (ng/ml) CRP (mg/l) Procalcitonin (ng/ml)
    normaler Wert (gesund, nichtatopisch) 20 0,7 ± 0,1 571 ± 168 < 10 < 0,5
    Gesamtheit der Patienten 61 5,4 ± 0,8*** 2510 ± 261*** 194 ± 21** 39,8 ± 12,4***
    Sepsis (pulmonal) 29 2,5 ± 0,3*** 2336 ± 406*** 126 ± 15*** 2,0 ± 1,4
    schwere Sepsis 12 4,5 ± 1,4*** 2696 ± 721* 292 ± 73** 23,8 ± 9,2***
    septischer Schock 20 10,0 ± 1,8*** 2661 ± 373*** 245 ± 29*** 90,8 ± 29,5***
  • Die Werte der Blutmarker sind als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts ausgedrückt. Signifikanter Unterschied zwischen jeder Gruppe von Patienten und dem Normalwert (Gruppe der gesunden nichtatopischen Probanden): * p < 0,01; ** p < 0,0001; *** p < 0,0001. Tabelle 2 Potentielle Unterscheidung der Schwere des Zustands des Patienten als Funktion der Konzentration der zirkulierenden Marker
    Marker, die einen signifikanten (ANOVA) Unterschied zeigen sESM-1 sICAM-1 CRP ProCT
    ECS und S/S p < 0,01 NS NS NS
    ECS und S p < 0,0001 NS p < 0,05 p < 0,01
    S/S und S NS NS p < 0,01 NS
    Kruskal-Wallis p < 0,01 NS p < 0,01 p = 0,0001
    Marker, die einen signifikanten (Mann-Whitney) Unterschied zeigen sESM-1 sICAM-1 CRP ProCT
    ECS und S/S p < 0,05 NS NS p < 0,05
    ECS und S p < 0,001 NS p < 0,01 p = 0,0001
    S/S und S NS NS p < 0,05 p < 0,01
    • NS = nicht signifikant
    Tabelle 3 Korrelation zwischen den verschiedenen Werten der Blutmarker
    Marker sESM-1 pESM-1 Alter sICAM-1 CRP ProCT Plasmacreatinin
    sESM-1 – p < 0,0001 NS NS NS NS NS
    sICAM-1 NS – – – NS NS –
    CRP NS – – NS – p < 0,01 –
    ProCT NS – – NS p < 0,01 – –
    • NS = nicht signifikant
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Claims (18)

  1. Kit zum Nachweis des Proteins ESM-1 in einer Probe, umfassend: a) einen ersten Antikörper, der spezifisch an den N-terminalen Bereich des Proteins ESM-1 zwischen der Aminosäure auf Position 20 und der Aminosäure auf Position 78 der Aminosäuresequenz dieses Proteins bindet; und b) einen zweiten Antikörper, der spezifisch an den C-terminalen Bereich zwischen der Aminosäure auf Position 79 und der Aminosäure auf Position 184 der Aminosäuresequenz des Proteins ESM-1 bindet.
  2. Nachweiskit gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper, der spezifisch an den N-terminalen Bereich des Proteins ESM-1 bindet, nach der Immunisierung eines Säugers mit dem rekombinanten Protein ESM-1, das durch eine eukaryontische Zelle produziert wurde, erhalten wird.
  3. Nachweiskit gemäß einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper, der spezifisch an den N-terminalen Bereich des Proteins ESM-1 bindet, der monoklonale Antikörper ist, der von der als MEC15 bezeichneten Hybridomlinie produziert wird, die am 17. Oktober 2000 unter der Zugriffsnummer I-2572 bei der Collection de Cultures de Micro-organismes de l'Institut Pasteur hinterlegt wurde.
  4. Nachweiskit gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper, der spezifisch an den C-terminalen Bereich von ESM-1 bindet, aus den Antikörpern ausgewählt ist, die eine der folgenden drei antigenen Determinanten erkennen können: a) die Determinante AgD1, die vom Prolinrest auf Position 79 bis zum Cysteinrest auf Position 99 von ESM-1 reicht; b) die antigene Determinante AgD2, die vom Serinrest auf Position 119 bis zum Valinrest auf Position 139 des Proteins ESM-1 reicht; c) die antigene Determinante AgD3, die vom Glycinrest auf Position 159 bis zum Argininrest auf Position 184 des Proteins ESM-1 reicht.
  5. Nachweiskit gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper, der spezifisch an den C-terminalen Bereich des Proteins ESM-1 bindet, aus den folgenden Antikörpern ausgewählt ist: a) dem Antikörper MEP21, der von der Hybridomlinie produziert wird, die am 19. November 1997 unter der Zugriffsnummer I-1944 bei der CNCM hinterlegt wurde; b) dem monoklonalen Antikörper MEP08, der von der Hybridomlinie produziert wird, die am 19. November 1997 unter der Zugriffsnummer I-1941 bei der CNCM hinterlegt wurde; c) dem monoklonalen Antikörper MEP14, der von der Hybridomlinie produziert wird, die am 19. November 1997 unter der Zugriffsnummer I-1942 bei der CNCM hinterlegt wurde; d) dem monoklonalen Antikörper MEP19, der von der Hybridomlinie produziert wird, die am 19. November 1997 unter der Zugriffsnummer I-1943 bei der CNCM hinterlegt wurde.
  6. Nachweiskit gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens einer der beiden Antikörper kovalent an ein Molekül gebunden ist, das seinen direkten oder indirekten Nachweis ermöglicht.
  7. Nachweiskit gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der erste oder der zweite Antikörper auf einem Träger immobilisiert ist.
  8. Nachweiskit gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der auf einem Träger immobilisierte Antikörper der Antikörper ist, der spezifisch den C-terminalen Bereich des Proteins ESM-1 erkennt.
  9. Verfahren zum Nachweis des Proteins ESM-1 in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte umfasst: a) In-Kontakt-Bringen der zu testenden Probe mit einem ersten Antikörper, der spezifisch an den N-terminalen Bereich des Proteins ESM-1 zwischen der Aminosäure auf Position 20 und der Aminosäure auf Position 78 der Aminosäuresequenz dieses Proteins bindet, oder mit einem ersten Antikörper, der an den C-terminalen Bereich des Proteins ESM-1 bindet; b) In-Kontakt-Bringen des Komplexes, der gegebenenfalls zwischen dem in der Probe vorhandenen Protein ESM-1 und dem ersten Antikörper gebildet wurde, mit einem zweiten Antikörper, der spezifisch an den Bereich des Proteins ESM-1 bindet, der aus dem N-terminalen Bereich zwischen der Aminosäure auf Position 20 und der Aminosäure auf Position 78 der Aminosäuresequenz dieses Proteins und dem C-terminalen Bereich ausgewählt ist, je nachdem, welcher Bereich vom ersten Antikörper nicht erkannt wurde; und c) Nachweisen des zwischen dem Protein ESM-1 und dem zweiten Antikörper gebildeten Komplexes.
  10. Nachweisverfahren gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Antikörper auf einem Träger immobilisiert ist.
  11. Nachweisverfahren gemäß einem der Ansprüche 9 und 10, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Antikörper ein Antikörper ist, der spezifisch an den C-terminalen Bereich des Proteins ESM-1 bindet, und der zweite Antikörper ein Antikörper ist, der spezifisch an den N-terminalen Bereich des Proteins ESM-1 zwischen der Aminosäure auf Position 20 und der Aminosäure auf Position 78 der Aminosäuresequenz dieses Proteins bindet.
  12. Nachweisverfahren gemäß einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper, der spezifisch an den N-terminalen Bereich des Proteins ESM-1 bindet, der Antikörper MEC15 ist, der von dem Hybridom produziert wird, das am 17. Oktober 2000 unter der Zugriffsnummer I-2572 bei der CNCM hinterlegt wurde.
  13. Nachweisverfahren gemäß einem der Ansprüche 9 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt c) des Verfahrens mit Hilfe eines biotinylierten Antikörpers durchgeführt wird, der an den zweiten Antikörper binden kann.
  14. Hybridomlinie MEC15, die am 19. November 1997 unter der Nr. I-2572 bei der CNCM hinterlegt wurde.
  15. Monoklonaler Antikörper, der von der Hybridomlinie MEC15 produziert wird, die am 17. Oktober 2000 unter der Zugriffsnummer I-2572 bei der CNCM hinterlegt wurde.
  16. Verwendung eines Nachweiskits gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 zum Nachweisen der Veränderungen der endothelialen Gefäßwand beim Menschen in vitro.
  17. Verwendung eines Immunnachweiskits gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Quantifizierung des Proteins ESM-1 in vitro bei einem Patienten, der mit einer immunsupprimierenden Verbindung behandelt wurde.
  18. Verwendung eines Nachweiskits gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Quantifizierung des Proteins ESM-1 in vitro bei einem Patienten, der unter einer Krebserkrankung leidet.
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