PT1336109E - Estojo e processo para a detecção da proteína esm-1 - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO ESTOJO E PROCESSO PARA A DETECÇÃO DA PROTEÍNA ESM-1 Âmbito da invenção A presente invenção refere-se a uma bolsa ou um estojo para a detecção da proteína ESM-1 numa amostra. Refere-se igualmente a um processo para a detecção da proteína ESM-1 numa amostra utilizando uma tal bolsa ou um tal estojo. 0 estojo e o processo de detecção da proteína ESM-1 segundo a invenção são aplicáveis industrialmente especialmente para a quantificação da proteína ESM-1 em amostras biológicas, particularmente em amostras biológicas provenientes de pacientes nos quais se suspeite uma alteração das paredes vasculares endoteliais.

Estado da técnica A proteína SEM-1 (de "Endothelial-cel-Specific Molecule 1") é uma proteína principalmente expressa por células endoteliais e maioritariamente pelas células endoteliais vasculares. A proteína ESM-1 foi descrita pela primeira vez por LASSALLE et al. (1996). 0 ARN mensageiro da ESM-1 codifica para um polipéptido de 184 aminoácidos cuja sequência está descrita na figura 1 do artigo de LASSALLE et al. (1996). A proteína ESM-1 recuperada de lisados celulares de células endoteliais humanas possui um peso molecular aparente de 20 kDa. A forma secretada da proteína ESM-1 possui um peso molecular aparente de 50 kDa, indicando que a proteína ESM-1 secretada sofreu modificações pós-tradução. A utilização de anticorpos monoclonais para detectar a proteína ESM-1 é descrita no pedido de patente francesa publicado com o n° 2.775.691 assim como no artigo BECHARD et 1 al. (2000). Estes anticorpos monoclonais foram preparados por imunização de ratinhos com um antigénio constituído pela sequência que vai do aminoácido na posição 79 até ao aminoácido na posição 184 da proteína ESM-1 que foi associada com a proteína GST (glutationa-S-transferase) . Foram caracterizadas três famílias de anticorpos, fixando-se estas famílias de anticorpos aos determinantes antigénicos, respectivamente, AgDl 79P-99C (anticorpos MEP 01, MEP 06 e MEP 21), AgD2 119 S-139V (anticorpos MEP 08 e MEP13) e AgDl3 159G-184R (anticorpos MEP 04, MEP 14 e MEP 19). BECHARD et al. (2000) descrevem a optimização de um teste imunoenzimático do tipo "sanduíche" que utiliza os anticorpos monoclonais MEP 19 e MEP 21 para realizar um teste de detecção da proteína ESM-1 numa amostra. Este teste permitiu aos autores mostrar uma forte produção de proteína ESM-1 no soro de pacientes hospitalizados devido a um choque séptico. Os resultados apresentados na figura 4 deste artigo mostram que o teste de detecção utilizando os anticorpos MEP 19 e MEP 21 permite detectar uma concentração de proteína ESM-1 superior a 4 nanogramas por mililitro.

No entanto, o teste imunoenzimático da proteína ESM-1 descrito por BECHARD et al. (2000), se for adaptado à detecção de fortes concentrações da proteína ESM-1 numa amostra, não permite detectar pequenas quantidades desta proteína, que são no entanto significativas de distúrbios fisiológicos, tais como uma alteração da parede vascular endotelial em pacientes, como mostrado segundo a invenção.

RESUMO DA INVENÇÃO 0 requerente dedicou-se a desenvolver um teste imunológico de detecção da proteína ESM-1 numa amostra, muito mais sensível do que o teste descrito no estado da técnica. 2 A invenção tem como objecto uma bolsa ou um estojo para a detecção da proteína ESM-1 numa amostra, compreendendo: a) um primeiro anticorpo que se fixa especificamente a região N-terminal compreendida entre o aminoácido na posição 1 e o aminoácido na posição 78 da sequência em aminoácidos da proteína ESM-1; e b) um segundo anticorpo que se fixa especificamente â região C-terminal compreendida entre o aminoácido na posição 79 e o aminoácido na posição 184 da sequência em aminoácidos da proteína ESM-1. A invenção tem igualmente como objecto um processo de detecção da proteína ESM-1 numa amostra, caracterizado por compreender as seguintes etapas: a) pôr em contacto a amostra a testar com um suporte sobre o qual se imobiliza um primeiro anticorpo que se fixa especificamente â região N-terminal ou à região C-terminal da sequência em aminoácidos da proteína ESM-1; b) pôr em contacto o complexo eventualmente formado entre o anticorpo imobilizado e a proteína ESM-1 com um segundo anticorpo que se fixa especificamente à região N-terminal ou C-terminal não reconhecida pelo primeiro anticorpo; e c) detectar o complexo eventualmente formado entre a proteína ESM-1 e o segundo anticorpo. A invenção refere-se igualmente a certos anticorpos utilizados no processo acima. A invenção tem ainda como objecto a utilização do estojo de detecção segundo a invenção para a detecção de uma alteração da parede vascular endotelial num paciente, especialmente num paciente afectado por um choque séptico ou por um cancro ou ainda num paciente que sofre um tratamento terapêutico susceptível de ser citotóxico em relação âs células endoteliais vasculares. 3

DESCRICÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

ESTOJO DE DETECCÃO SEGUNDO A INVENÇÃO É fornecido segundo a invenção uma bolsa ou um estojo que permite detectar com uma elevada sensibilidade a presença da proteína ESM-1 numa amostra. A amostra na qual a presença da proteína ESM-1 é procurada pode ser de qualquer natureza. De preferência, trata-se de um fluido biológico tal como um soro, um plasma, sangue total, urina, um líquido cerebro-espinal, ou sobrenadantes de cultura ou ainda lisados celulares. 0 requerente mostrou que a proteína ESM-1 secretada pelas células eucarióticas apresentava características específicas que não eram encontradas na proteína ESM-1 produzida por células procarióticas, tais como as células de Escherichia coli. A proteína ESM-1 é secretada pelas células eucarióticas, e mais particularmente pelas células endoteliais sob a forma de uma glicoproteína, mais precisamente um proteoglicano que possui uma cadeia do tipo condroitina/sulfato de dermatano. Ainda, o requerente mostrou que a proteína ESM-1 secretada pelas células eucarióticas sofria outras modificações pós-tradução incluindo modificações conformacionais provocadas pela formação de pontes dissulfureto entre os resíduos cisteína localizados maioritariamente na região N-terminal desta proteína. 0 polipéptido ESM-1 de 184 aminoácidos é referenciado como a sequência SEQ ID N°l.

Para o desenvolvimento de um teste de detecção imunológico da proteína ESM-1 de grande sensibilidade, o requerente dedicou-se a preparar anticorpos monoclonais dirigidos contra a região N-terminal indo do aminoácido na posição 20 ao 4 aminoácido na posição 78 da sequência SEQ ID N°1 descrita por LASSALLE et al. (1996), constituindo o aminoácido na posição 20 o aminoácido da terminação amino da proteína ESM-1 secretada.

De preferência, os anticorpos monoclonais preparados pelo requerente são dirigidos contra a proteína ESM-1 secretada por células eucarióticas e tendo sofrido as modificações pós-tradução acima citadas.

Mais especificamente, o requerente fabricou linhas celulares de hibridomas que produzem anticorpos monoclonais que se fixam especificamente â região da proteína ESM-1 que sofre modificações conformacionais devido à criação de pontes dissulfureto, ou seja, anticorpos dirigidos contra a região N-terminal da proteína ESM-1 indo do aminoácido na posição 20 até ao aminoácido na posição 78 da sequência de aminoácidos da proteína ESM-1 de sequência SEQ ID N°l.

De modo a se obter uma ferramenta de detecção da proteína ESM-1 numa amostra, o requerente desenvolveu um teste imunológico do tipo "sanduíche" utilizando dois anticorpos que se fixam especificamente às duas regiões distintas da proteína ESM-1, respectivamente um anticorpo que se liga especificamente à região N-terminal que vai do aminoácido na posição 20 até ao aminoácido na posição 78 ESM-1 e um anticorpo que se liga especificamente à região C-terminal que vai da posição 79 à posição 184 da sequência ESM-1.

Um primeiro objecto da invenção consiste então de um estojo ou de uma bolsa de detecção da proteína ESM-1 numa amostra, compreendendo o referido estojo: a) um primeiro anticorpo que se liga especificamente à região N-terminal da proteína ESM-1 compreendida entre o aminoácido na posição 20 e o aminoácido na posição 78 da sequência em aminoácidos desta proteína; e 5 b) um segundo anticorpo que se liga especificamente à região C-terminal compreendida entre o aminoácido na posição 79 e o aminoácido na posição 184 da sequência em aminoácidos da proteína ESM-1.

De modo particularmente preferido, o anticorpo que se liga especificamente â região N-terminal de ESM-1 é dirigido especificamente contra a região N-terminal da proteína ESM-1 secretada pelas células eucarióticas e tendo sofrido as modificações pós-tradução descritas em detalhe abaixo. Tal siginfica que o anticorpo que se liga especificamente â região N-terminal foi obtido segundo um processo compreendendo uma etapa durante a qual se injecta num animal uma preparação purificada da proteína ESM-1 produzida por uma célula eucariótica.

Por "anticorpo" no sentido da invenção, entende-se qualquer molécula compreendendo um "paratopo" capaz de se ligar especificamente â região N-terminal ou à região C-terminal da proteína ESM-1. Por "anticorpo" segundo a invenção entende-se também uma população homogénea de moléculas compreendendo todas o mesmo "paratopo" capaz de se ligar especificamente à região N-terminal ou C-terminal da proteína ESM-1.

Entende-se por "paratopo" o local de combinação antigénica compreendido no fragmento Fab de um anticorpo que está localizado nas regiões hipervariáveis ou CDR dos domínios variáveis VH e VL da cadeia pesada e da cadeia leve de uma imunoglobulina.

Um anticorpo segundo a invenção pode ser preparado a partir de hibridomas segundo a técnica descrita por KOHLER e MIELSTEIN (1975), ou ainda pela técnica do hibridoma de células B humanas descritas por KOZBOR (1983). Um anticorpo segundo a invenção engloba igualmente os fragmentos de anticorpos quiméricos Fv de cadeia simples (ScFv de "Single Chain Fv") tal como descrito na patente US n° 4.946.778 e por 6 MARTINEAU et al. (1998). Um anticorpo segundo a invenção pode igualmente ser produzido por bancos de fagos ("Phage Display Libraries") tais como descritos por RIDDER et al. (1995). Um anticorpo segundo a invenção pode ser igualmente um anticorpo humanizado produzido segundo a técnica descrita por REINMANN et al. (1997) ou ainda pela técnica descrita por LEGER et al. (1997) .

De modo perfeitamente preferido, o estojo de detecção da proteína ESM-1 segundo a invenção compreende um dos dois anticorpos sob uma forma imobilizada num suporte. Neste modo de realização preferido, o estojo de detecção da invenção apresenta-se sob uma forma dita de "pronta a usar" para realizar um teste de imunodetecção do tipo "sanduíche" da proteína ESM-1.

Mostrou-se segundo a invenção que o desenvolvimento de um estojo tal como definido acima para a detecção da presença da proteína de ESM-1 numa amostra permitia obter uma sensibilidade de detecção 10 vezes maior do que aquela obtida com o teste de detecção de ESM-1 descrito por BECHARD et al. (2000). A elevada sensibilidade do teste de imunodetecção segundo a invenção tornou possível a detecção de concentrações muito baixas da proteína ESM-1 numa amostra biológica, por exemplo em soro humano, e permitiu assim a detecção precoce da alteração das paredes vasculares endoteliais num paciente.

Especialmente, a utilização de um estojo de imunodetecção segundo a invenção permitiu detectar concentrações séricas de ESM-1 que vão de 1 a 3 nanogramas por mL em indivíduos ditos "atópicos" atingidos por sepsia.

Como se ilustra nos exemplos, a utilização de um estojo de imunodetecção segundo a invenção permite detectar concentrações de ESM-1 da ordem de 100 a 200 picogramas/mL, então o teste descrito por BECHARD et al. (2000) não permite 7 a detecção de concentrações de ESM-1 inferiores a 1 nanograma/mL.

Com vantagem, o anticorpo dirigido contra a região N-terminal de ESM-1 +e um anticorpo monoclonal produzido por uma linha de hibridoma obtida após imunização de um mamífero, de preferência um ratinho, com a proteína ESM-1 recombinante sintetizada por uma célula eucariótica, por exemplo por uma célula da linha CHO transformada por um vector de expressão compreendendo um inserto de ADN que codifica para a proteína ESM-1 descrita por LASSALLE et al., por exemplo o vector pcDNA3.

De um modo particularmente preferido, trata-se do anticorpo monoclonal produzido pela linha de hibridoma designado MEC 15 depositado na Colecção de Culturas de Microrganismos (CNCM) do Institut Pasteur a 17 de Outubro de 2000 com o número de acesso N° 1-2572. 0 anticorpo MEC15 constitui um objecto da invenção. 0 anticorpo que se liga especificamente â porção C-terminal da proteína ESM-1 pode ser indiferentemente um anticorpo dirigido contra a proteína ESM-1 produzida por uma célula procariótica, tal como Escherichia coli, ou por uma célula eucariótica, tal como as células da linha CHO.

Preferencialmente, o anticorpo que se liga especificamente â região C-terminal de ESM-1 é escolhido entre os anticorpos capazes de reconhecer um dos três determinantes antigénicos seguintes da proteína ESM-1: - o determinante AgDl que vai do resíduo prolina na posição 79 até ao resíduo cisteína na posição 99 de ESM-1, tais como os anticorpos produzidos pelas linhas de hibridoma MEP01, MEP06 e MEP21 descritos por BECHARD et al. (2000); - o determinante antigénico AgD2 que vai do resíduo serina na posição 119 até ao resíduo valina na posição 139 de ESM-1, reconhecidos pelos anticorpos produzidos pelos hibridomas MEP08 e MEP13 descritos por BECHARD et al. (2000); - o determinante antigénico AgD3 que vai do resíduo glicina na posição 159 até ao resíduo arginina na posição 184 de ESM-1 é reconhecido pelos anticorpos produzidos pelos hibridoma MEP04, MEP14 e MEP19 descritos por BECHARD et al. (2000).

De modo particularmente preferido, o perito na técnica poderá com vantagem referir-se, para utilização de um anticorpo que se liga especificamente à região C-terminal da proteína ESM-1, aos anticorpos seguintes: os anticorpos monoclonais específicos do determinante antigénico Dl produzidos pela linha do hibridoma depositado na CNCM a 19 de Novembro de 1997 com o N° de acesso 1-1944 (anticorpo MEP 21) ; os anticorpos monoclonais específicos do determinante antigénico D2 produzidos pela linha do hibridoma depositado na CNCM a 19 de Novembro de 1997 com o N° de acesso 1-1941 (anticorpo MEP08); os anticorpos monoclonais específicos do determinante antigénico D3 produzidos pela linha do hibridoma depositado na CNCM a 19 de Novembro de 1997 com o N° de acesso 1-1942 (anticorpo MEP14) e 1-1943 (anticorpo MEP19).

No modo de realização preferido de um estojo de imunodetecção segundo a invenção, o primeiro e o segundo anticorpo são escolhidos de tal modo que os seus locais respectivos de reconhecimento na proteína ESM-1 sejam muito distantes um do outro de modo a evitar qualquer fenómeno de fixação competitiva de um anticorpo em relação ao outro na proteína, que poderia ser provocado por um fenómeno de impedimento estérico no caso em que os locais de reconhecimento respectivos dos dois anticorpos são demasiado próximos.

Assim, num modo de realização preferido de um estojo para a detecção segundo a invenção, o primeiro anticorpo que se liga 9 especificamente â região N-terminal da proteína ESM-1 é o anticorpo produzido pela linha de hibridoma MEC15. Segundo este modo de realização preferido, o anticorpo que se liga especificamente â região C-terminal da proteína ESM-1 é o anticorpo monoclonal produzido pela linha do hibridoma MEP14. DE modo geral, um anticorpo direccionado contra a região exterminai da proteína ESM-1 pode ser seleccionado segundo a técnica descrita por BECHARD et al. (2000), que consiste em preparar um vector de expressão que compreende um inserto de ADN que codifica para a região C-terminal da proteína ESM-1 de fusão com a proteína GST, e depois imunizar ratinhos com a proteína ESM-1 purificada obtida a partir de lisados celulares de células de Escheríciha coli transformadas com o vector de expressão acima citado. Após a fusão das células esplénicas dos ratinhos assim imunizados com células de mieloma de modo a obter uma série de hibridomas que produzem anticorpos monoclonais, os anticorpos de interesse ligam-se especificamente à região C-terminal da proteína ESM-1 podendo ser seleccionados por cartografia de epitopos com auxílio de péptidos derivados de ESM-1 que contêm deleções progressivas da extremidade N-terminal da região C-terminal desta proteína.

Igualmente, o perito na técnica pode seleccionar anticorpos que se ligam especificamente à região C-terminal da proteína ESM-1 imunizando ratinhos com a proteína ESM-1 completa, de preferência a proteína ESM-1 completa produzida por uma célula hospedeira eucariótica, e depois produzindo uma série de linhas de hibridomas a partir das células esplénicas de ratinhos imunizados, e depois seleccionar os anticorpos de interesse que se ligam especificamente á região N-terminal, por exemplo, através de testes de imunodetecção competitivos com os anticorpos que se fixam especificamente à região C-terminal de ESM-1. Os anticorpos de interesse são aqueles que não entram em competição com os anticorpos específicos da região C-terminal de ESM-1, ou seja, os anticorpos que não 10 entram em competição com nenhum dos anticorpos específicos dos determinantes antigénicos Dl, D2 e D3 da proteína ESM-1.

De preferência, um dos dois anticorpos constitutivos do estojo de detecção segundo a invenção é imobilizado num suporte. 0 suporte sobre o qual é imobilizado o anticorpo pode ser de qualquer natureza conhecida do perito na técnica especialista em testes de imunodetecção, em particular testes de imunodetecção do tipo "sanduíche". A título de ilustração, o suporte sobre o qual é imobilizado o anticorpo pode ser um material insolúvel em água, poroso ou não poroso. 0 suporte pode ser hidrofílico ou susceptível de ser tornado hidrofílico e compreende pós inorgânicos tais como a sílica, o sulfato de magnésio e o alumínio; os materiais poliméricos naturais, em particular os materiais celulósicos e os materiais derivados da celulose; polímeros naturais ou sintéticos tais como a nitrocelulose, o acetato de celulose, o poli(cloreto de vinilo), a poliacrilamida, o dextrano reticulado, a agarose, o poliacrilato, o polietileno, o polipropileno, o poli(4-metilbuteno), o poliestireno, o polimetacrilato, o poli(tereftalato de etileno), o Nylon, o poli(butirato de vinilo), certos tipos de vidro, tais como o Bioglass, ou cerâmicas. A fixação de um anticorpo segundo a invenção sobre um suporte pode ser realizada através de técnicas bem conhecidas pelo perito na técnica. 0 suporte pode apresentar-se sob formas diversas, incluindo sob forma de bandas ou de partículas tais como abitas. A superfície do suporte pode ser polifuncional ou susceptível de ser polifuncionalizada de modo a fixar o anticorpo através de interacções covalentes ou não covalentes que podem ser específicas ou não específicas. A título ilustrativo, para a imobilização de anticorpos num suporte, o perito da técnica pode com vantagem referir-se à patente US N° 4,168,146 ou ainda à patente US N° 4,347,311. 11

Com vantagem, um dos anticorpos que constitui o estojo de detecção segundo a invenção está ligado de modo covalente a uma molécula que permite a sua detecção directa, ou indirecta.

De preferência, no modo de realização no qual um dos anticorpos está imobilizado sobre um suporte, o outro anticorpo está ligado de modo covalente a uma molécula que permite a sua detecção directa, ou indirecta. A molécula detectável pode ser isotópica ou não isotópica. A título ilustrativo, mas não limitativo, a molécula detectável pode intervir numa reacção catalítica, tal como uma enzima, um fragmento de enzima, um substrato de enzima, um inibidor de enzima, uma co-enzima ou um catalisador. A molécula detectável pode ser igualmente um agente cromogénico, tal como um fluoróforo, um corante, uma molécula quimioluminescente. A molécula detectável pode assim ser uma molécula fluorescente tais como moléculas descritas por ICHINOSE et al. (1991) ou ainda derivados de isotiocianato fluorescentes, a ficoeritrina, o isotiocianato de rodamina, o cloreto de dansilo ou ainda o composto XRITC, a proteína GFP ("Green Fluorescent Protein") do peixe Aequorea Victoria e seus diversos derivados, ou ainda a proteína YFP ("Yellow Fluorescent Protein") assim como a proteína luciferase.

Entre as moléculas detectáveis possuindo uma actividade catalítica, as moléculas preferidas são as seguintes enzimas, segundo a Classificação Internacional I.U.B.: (i) as oxidoredutases de classe 1 e (ii) as hidrolases da classe 3. As oxidoredutases preferidas são (i) as desidrogenases da classe 1.1, mais particularmente 1.1.1-, 1.3.3 e 1.1.99 e (ii) as peroxidases da classe 1.11 e (iii) hidrolases da classe 3.1, e mais particularmente da classe 3.1.3 e da 12 classe 3.2, mais particularmente 3.2.1. As desidrogenases preferidas são a malato desidrogenase; a glucose-β-fosfato desidrogenase e a lactato desidrogenase. A oxidase preferida é a glucose oxidase. A peroxidase preferida é a peroxidase de rábano silvestre ("horse radish peroxidase"). As hidrolases preferidas são as fosfatases alcalinas, a «-glucosidase e a lisozima. A molécula detectável pode ser igualmente uma molécula marcada radioactivamente, por exemplo por um isótopo escolhido entre [3H] , [32P] e [125I] .

No modo de realização no qual a molécula detectável constitui um marcador indirecto, um dos anticorpos constitutivos de um estojo de detecção segundo a invenção pode estar ligado covalentemente a um ligando tal como a biotina ou a estreptavidina.

Neste modo de realização particular, a molécula detectável é escolhida de modo a se fixar sobre o ligando ligado de modo covalente ao anticorpo. A molécula detectável pode por exemplo estar ela própria ligada respectivamente à biotina ou à estreptavidina.

Segundo ainda um outro modo de realização de um estojo de detecção segundo a invenção, o modo de revelação da formação de um complexo entre a proteína ESM-1 presente numa amostra testada e um dos anticorpos específicos da proteína ESM-1, pode ser um anticorpo, por exemplo, um anticorpo capaz de se ligar especificamente à parte Fc do anticorpo anti-ESM-1 ou ainda um anticorpo capaz de se fixar especificamente ao isotipo ao qual pertence o anticorpo anti-ESM-1 considerado, por exemplo, um anticorpo que reconheça especificamente os anticorpos de ratinho do isotipo IgGl.

Num modo de realização preferido de uma bolsa de detecção segundo a invenção, é o anticorpo que reconhece 13 especificamente a região C-terminal da proteína ESM-1 que é imobilizado sobre um suporte.

Com vantagem, um estojo tal de detecção é aquele no qual o anticorpo produzido pelo hibridoma MEP14 (CNCM N° 1-1942) está imobilizado sobre o suporte, é o anticorpo que se liga especificamente à região N-terminal da proteína ESM-1 e o anticorpo produzido pelo hibridoma MEC15 (CNCM N° 1-2572). A ferramenta de detecção pode ser então um anticorpo monoclonal biotinilado, por exemplo de rato, que reconhece especificamente os anticorpos de ratinho do isotipo IgGl, podendo o sistema de detecção ser fornecido por um conjugado estreptavidina-peroxidase.

PROCESSO DE IMUNODETECÇÃO SEGUNDO A INVENÇÃO A invenção tem ainda como objecto um processo de detecção da proteína ESM-1 numa amostra caracterizada por compreender as seguintes etapas: a) colocar em contacto a amostra a testar com um primeiro anticorpo que se liga especificamente à região N-terminal da proteína ESM-1 que vai do aminoácido na posição 20 ao aminoácido na posição 78 ou com um primeiro anticorpo que se liga â região C-terminal da proteína ESM-1. b) colocar em contacto o complexo eventualmente formado entre a proteína ESM-1 presente na amostra e o primeiro anticorpo com um segundo anticorpo que se liga especificamente à região da proteína ESM-1 escolhida entre a região N-terminal que vai do aminoácido na posição 20 ao aminoácido na posição 78 e a região C-terminal não reconhecida pelo primeiro anticorpo; e c) detectar o complexo formado entre a proteína ESM-1 e o segundo anticorpo. 14

Por "complexo formado entre a proteína ESM-1 e o segundo anticorpo", entende-se o complexo formado entre o complexo formado entre: - o complexo formado entre a proteína ESM-1 e o primeiro anticorpo, e - o segundo anticorpo.

Segundo um primeiro modo de realização do processo de imunodetecção acima, o primeiro ou o segundo anticorpo está imobilizado à superfície de um suporte.

Segundo um segundo modo de realização do processo de imunodetecção acima, o anticorpo que está imobilizado sobre um suporte é um anticorpo que se liga especificamente à região C-terminal da proteína. ESM-1 e o segundo anticorpo é um anticorpo que se liga especificamente à região N-terminal desta proteína.

Segundo um terceiro modo de realização particular do porcesso de imunodetecção, o anticorpo que está imobilizado sobre um suporte liga-se especificamente à região N-terminal da proteína ESM-1 que vai do aminoácido na posição 2 0 até ao aminoácido na posição 78 e o segundo anticorpo liga-se especificamente â região C-terminal desta proteína.

Os anticorpos que se ligam especificamente as regiões N-terminal ou C-terminal de ESM-1 são tais como definidos anteriormente.

Num modo de realização preferido do processo de detecção segundo a invenção, o anticorpo que se liga especificamente â região N-terminal da proteína ESM-1 é o anticorpo MEC15 produzido pelo hibridoma depositado a 17 de Outubro de 2000 junto da CNCM com o N° de acesso 1-2572. 15 0 segundo anticorpo pode ser o anticorpo MEP14 produzido pelo hibridoma depositado na CNCM a 19 de Novembro de 1997 com o N° 1-1942. A etapa c) do processo acima pode ser realizada com auxílio de um anticorpo biotinilado capaz de se fixar ao segundo anticorpo, podendo a molécula detectável ser constituída por um conjugado do tipo estreptavidina-peroxidase. APLICAÇÕES DO PROCEDIMENTO DE DETECÇÃO SEGUNDO A INVENÇÃO. 0 requerente mostrou que o processo de imunodetecção da proteína ESM-1 segundo a invenção permitia quantificar com uma grande sensibilidade a concentração sérica da proteína ESM-1 no homem, em particular em pacientes atingidos de sepsia, e permitiu estabelecer uma correlação entre a quantidade de proteína ESM-1 circulate e a gravidade da sepsia nos pacientes.

Segundo a norma definida pelo American Colledge of Chest Physicians / Society of Criticai Medicai Care Medicine Consensus Conference (1992, definitions for sepsis and multiple organ failure, and guide lines for the use of innovative therapies in sepsis; Crit Care Med., vol. 20: 864-874), a sepsia pode ser dividida em três categorias de gravidade crescente: a sepsia, a sepsia grave e o choque séptico.

Graças ao processo de imunodetecção segundo a invenção, foi estabelecido uma correlação entre a gravidade da sepsia e a concentração de proteína ESM-1 circulante nos pacientes.

Além disso, a grande sensibilidade do teste de imunodetecção segundo a invenção permitiu mostrar que os pacientes atingidos por uma sepsia simples possuíam uma concentração de proteína ESM-1 circulante a qual, apesar de baixa, era significativamente detectável e significativamente superior 16 (ρ < a 0,001) â concentração da proteína ESM-1 encontrada no soro de voluntários sãos.

Até a data, a evolução da sepsia num paciente era seguida através da quantificação de três marcadores, respectivamente a proteína C-reactiva, a proteína ICAM-1 solúvel e a pro-calcitonina.

Mostrou-se segundo a invenção que a evolução dos teores de proteína C-reactiva e de proteína ICAM-1 solúvel não se correlacionava com a evolução da concentração de ESM-1.

Por seu lado, existe uma boa correlação entre a evolução dos teores de pro-calcitonina e da proteína ESM-1. No entanto, o significado biológico da pro-calcitonina no caso da sepsia não é conhecido e então esta proteína não constitui um bom marcador biológico da evolução da sepsia.

Pelo contrário, a proteína ESM-1, devido ao seu papel na regulação das reacções inflamatórias, constitui um novo marcador da evolução da sepsia cujo significado fisiológico está directamente ligado ao desenvolvimento não controlado da reacção inflamatória, particularmente o recrutamento dos leucócitos durante os fenómenos de extravasão e de infiltração massiva destas células nos diferentes tecidos, especialmente os tecidos pulmonares, fenómenos casuais, ou pelo menos, com uma alteração da parede vascular endotelial.

Assim, a requerente mostrou que o teste de imunodetecção da invenção permitia evidenciar baixas concentrações da proteína ESm-1 circulante, da ordem dos 1 a 3 nanogramas por mililitro, podendo ser estas baixas concentrações encontradas em pacientes atópicos claramente distinguidas das concentrações basais da ordem de um nanograma/mL ou ainda inferior medidas em voluntários sãos. 17

Ainda, foi mostrado que a quantidade de ESM-1 sérica encontrada em pacientes atingidos por sepsia constituía um prognóstico fiável de mortalidade nestes pacientes. Assim, em 68 pacientes testados, os pacientes que faleceram 10 dias após a sua hospitalização apresentavam concentrações de ESM-1 circulantes ao dia 0 e ao dia 1 significativamente superiores do que as concentrações de ESM-1 encontradas no soro dos pacientes que sobrevieram (10,6 ± 0,8 nanogramas por mL nos pacientes falecidos contra 4,0 ± 0,6 nanogramas por mL nos pacientes que sobrevieram [p > 0,01]).

Esta correlação estreita entre o nível circulante de proteína ESM-1 e o prognóstico de mortalidade em pacientes não é encontrada com marcadores clássicos da sepsia, ou seja a proteína C-reactiva, a procalcitonina e a proteína ICAM-1 solúvel.

No entanto, a medição da concentração de ESM-1 circulante num paciente não é suficiente por si só para realizar um diagnóstico médico que permite ao médico tomar as medidas terapêuticas adaptadas ao estado global do paciente.

Um outro objecto da invenção consiste na utilização de um estojo de detecção da proteína ESM-1 segundo a invenção para detectar in vitro alterações da parede vascular endotelial no Homem, em particular nos pacientes. A invenção é igualmente relativa à utilização de um estojo de detecção da proteína ESM-1 tal como definida acima para o acompanhamento in vitro de um marcador da gravidade da sepsia num paciente.

Foi também mostrado segundo a invenção que uma concentração da proteína ESM-1 circulante superior à normal era encontrada em pacientes que receberam um transplante de órgãos e tratados por um composto imunossupressor. Nestes pacientes transplantados e tratados por um composto imunossupressor. 0 18 aumento da concentração da proteína ESM-1 circulante é indicadora de uma actividade citotóxica do composto imunossupressor em relação a células endoteliais, particularmente células endoteliais da parede vascular.

Assim, a utilização de um estojo de imunodetecção da proteína ESM-1 segundo a invenção torna possível o acompanhamento de pacientes tratados com compostos imunossupressores e a determinação do momento no qual estes imunossupressores se tornam citotóxicos. A detecção dos teores de ESM-1 circulante superior à normal em pacientes pode constituir uma indicação para o médico de modo a lhe permitir moderar as doses de compostos imunossupressores administrados, quando esta medição está associada a outros parâmetros fisiológicos do paciente. Segundo um outro aspecto, a invenção refere-se à utilização de um estojo de imunodetecção segundo a invenção para a quantificação da proteína ESM-1 in vitro num paciente tratado por um composto imunossupressor, em particular num paciente tendo sido submetido a um transplante de órgãos. 0 requerente mostrou igualmente um aumento significativo do teor de proteína ESM-1 circulante em pacientes que sofrem de cancro, em particular de cancro bronco-pulmonar.

Segundo um outro aspecto, a invenção refere-se à utilização de um estojo de imunodetecção tal como definida acima para a quantificação in vitro da proteína ESM-1 num paciente afectado por um cancro.

De modo geral, um teor de proteína ESM-1 circulante superior a 1 nanograma por mL significa uma alteração das células endoteliais da parede vascular e pode assim constituir um parâmetro a tomar em conta aquando do estabelecimento de um diagnóstico clínico de um paciente dado por um médico, entendendo-se que o único parâmetro, tomado isoladamente, não 19 permite por si só estabelecer qualquer diagnóstico terapêutico ou clínico do paciente. A presente invenção foi entre outros ilustrada, sem ser no entanto limitada, às figuras e aos exemplos seguintes:

FIGURAS A figura 1 ilustra uma comparação da sensibilidade de detecção do teste de imunodetecção da proteína ESM-1 segundo a invenção (círculos vazios) com o teste de detecção descrito por BECHARD et al. (2000) representado pelos círculos cheios. A escala das ordenadas representa a concentração da proteína ESm-1 numa amostra a testar, expresso em nanogramas por mL. Na escala das abcissas, é representada pela densidade óptica. A figura 2 ilustra os perfis de imunodetecção realizados segundo a técnica imunoenzimática do tipo "sandwich". Em todo o caso, o anticorpo monoclonal produzido pelo hibridoma MEP14 é adsorvido numa placa de micro-titulação. Na escala das abcissas é apresentado o valor da densidade óptica. Na escala das ordenadas, representa-se a concentração na proteína ESM-1 produzida por células da linha HEK293, expresso em nanogramas por mL. 0 segundo anticorpo utilizado no teste de imunodetecção é um anticorpo dirigido especificamente contra a região N-terminal da proteína ESM-1. Trata-se do anticorpo MEC2 (figura 2A), MEC15 (figura 2B) e MEC36 (figura 2C). A figura 3 ilustra uma comparação da concentração da proteína ESM-1 encontrada no plasma do soro de voluntários sãos ou de pacientes. A escala das ordenadas representa a concentração sérica da proteína ESM-1, expressa em nanogramas por mL. A escala das abcissas representa a concentração plasmática da proteína ESM-1, expressa em nanograma por mL. A figura 4 ilustra a quantidade de proteína ESM-1 circulante encontrado no soro de voluntários sãos ou de pacientes 20 atingidos de sepsia de gravidade clínica crescente. A concentração de proteína ESM-1 sérica, expressa em nanograma por mL, é representada em ordenada. Em abcissa são representadas diferentes populações de indivíduos testados, respectivamente os indivíduos sãos (CTRL), os pacientes afectados com sepsia, de sepsia grave ou de choque séptico, segundo a definição clínica publicada em Crit. Care Med., 1992, vol. 20: 864-874. A figura 5 ilustra a quantificação de três marcadores da sepsia em populações de pacientes sãos, ou de pacientes atingidos por sepsia, de sepsia grave ou de choque séptico. A figura 5A ilustra a quantificação da proteína ICAM-1 solúvel no soro, expressa em nanograma por mL. A figura 5B ilustra a quantificação de proteína C-reactiva, expressa em miligrama por mL. A figura 5C ilustra a quantificação da procalcitonina sérica, expressa em nanograma por mL. A figura 6 ilustra uma comparação entre os níveis de proteína ESM-1 circulante, e de cada um dos três marcadores clássicos de sepsia, respectivamente a proteína ICAM-1 solúvel, a proteína C-reactiva e a procalcitonina ao dia 0 de hospitalização dos pacientes, respectivamente em pacientes que sobrevieram e em pacientes que faleceram. A figura 6A ilustra o nível sérico da proteína ESM-1, expressa em nanograma por mL. A figura 6B ilustra o nível sérico da proteína ICAM-1 solúvel, expressa em nanograma por mL. A figura 6C ilustra o nível de proteína C-reactiva, expressa em nanograma por mL. 21 A figura 6D ilustra o nível de procalcitonina, expressa em nanograma por mL. A figura 7 ilustra o valor prognóstico da quantidade de proteína ESM-1 ou da proteína solúvel ICAM-1 nos pacientes ao dia 0 e ao dia 1 após a hospitalização, em relação à sua mortalidade. A figura 7A ilustra o nível de proteína ESM-1, expresso em nanograma por mL encontrado respectivamente em pacientes que sobreviveram (círculo cheio) e os pacientes que faleceram (círculo vazio) , respectivamente ao dia 0 e ao dia 1 após hospitalização. A figura 7B ilustra o nível de proteína solúvel ICAM-1 sérico nos mesmos pacientes. A figura 8 ilustra o valor prognóstico de mortalidade do nível de proteína ESM-1 e ICAM-1 solúvel medido ao dia 0 e ao dia 1 após a hospitalização. A figura 8A ilustra o nível de proteína sérica, expresso em nanograma por mL, em pacientes que sobrevieram (círculo cheio) e nos pacientes que faleceram (círculo vazio). A figura 8B ilustra o nível de proteína solúvel ICAM-1 sérica expressa em nanograma por mL nos pacientes que sobrevieram (círculo cheio) e nos pacientes que faleceram (círculo vazio).

EXEMPLOS EXEMPLO 1: Preparação dos anticorpos monoclonais que aa ligam especificamente à região N-terminal da proteína ESM-1 produzida pelas células eucarióticas. 22

De modo a se obter anticorpos monoclonais anti-ESM-1 dirigidos contra a região N-terminal da proteína ESM-1 rica em resíduos cisteína, foi purificada a forma nativa da proteína ESM-1 produzida pela linha celular CHO transfectada por um vector de expressão, contendo um inserto de ADN que codifica para a proteína ESM-1. A sequência de cADN codificante para a proteína ESM-1 é referenciada como a sequência SEQ ID N°2 da listagem de sequências. 0 cADN de ESM-1 é inserido no vector de expressão eucariota pcDNA3 (Invitrogen) e depois transfectado nas células CHO com a lipofectamina (Gibco) segundo as recomendações do fabricante. 48 h após a transfecção as células são repicadas na presença de um agente de selecção (G418, Gibco) à dose de 1000 micrograma / mL) . Após duas semanas de selecção as células CHO resistentes a G418 são clonados por diluição limite. São de seguida seleccionados clones que expressam ESM-1 e denominados CHO-ESM (depositados na CNCM).

Para a produção, as células CHO-ESM são cultivadas em suspensão num meio condicionado sem soro fetal bovino (meio CHO SFM II, Gibco) . 0 sobrenadante é ajustado a pH 8 e passado por uma coluna DEAE-sepharose (Pharmacia). A coluna é lavada com um tampão 50 mM de Tris, pH 8, 0,2 M NaCl. A molécula ESM-1 é eluída num tampão 50 mM de Tris, pH 8, 1 M NaCl. 0 eluato é de seguida diluído a 1:4 em tampão 50 mM de Tris, pH 8 e incubado na presença de anticorpo monoclonal anti-ESM-1 (MEC4) imobilizado em agarose (Biorad) . Após uma noite de incubação a 4°C com agitação, as esferas de agarose são lavadas com tampão 50 mM de Tris, pH 8, 0,2 M NaCl. A ESM-1 é eluída com 3 M de MgC12. 0 eluato é concentrado e dialisado no tampão 50 mM de Tris, pH 8, 0,5 M NaCl e armazenado a -70°C. 23

Imunizaram-se ratinhos Balb/C por injecção de 10 «g de proteína ESM-1 recombinada purificada por ratinhos, segundo um protocolo de imunização padrão na presença de adjuvante de Freund.

As células de hibridomas que secretam os anticorpos monoclonais anti-ESM-1 foram obtidas por fusão, triagem, e sub-clonagem segundo a técnica descrita por BECHARD et al. (2000).

Cinco clones celulares de hibridoma foram obtidos e foram designados genericamente MEC ("Mouse Monoclonal Antibody to ESM-1 produced by CHO Cells").

Quatro dos hibridomas seleccionados são do isotipo IgGl,k respectivamente os hibridomas designados MEC4, MEC5, MEC15 e MEC36.

Um dos hibridomas é o isotipo IgM,k, o hibridoma MEC11.

Os clones celulares de hibridomas foram cultivados em meio de cultura na ausência de soro e os anticorpos anti-ESM-1 foram purificados por cromatografia em coluna de proteína G-Sepharose comercializada pela sociedade Pharmacia (UPSALA, Suécia). EXEMPLO 2: Seleccão dos anticorpos monoclonais dirigidos especificamente contra a porção N-terminal da proteína ESM-1 produzida pelas células da linha CHO.

Os anticorpos MEC, de classe IgGl,K são seleccionados pela persistência de uma ligação forte dos anticorpos da série MEC a ESM/Fc na presença de anticorpos MEP de isotipo diferente e â concentração final de 1 •g/mL. Os testes são realizados por ELISA segundo os exemplos anteriormente descritos para a selecção dos anticorpos MEP e MEC, (especialmente pelas 24 experiências de imunodetecção por competição descritas por LASSALLE et al. (1996). EXEMPLO 3: Teste de imuno-detecção da proteína ESM-1 segundo a invenção. 0 teste de imuno-detecção consiste num teste imunoenzimático do tipo "sanduíche" cujas características gerais são idênticas ao daquele descrito por BECHARD et al. (2000). 0 anticorpo monoclonal anti-ESm-1 produzido pela linha de hibridomas MEP14 (CNCM N°I-1942) foi diluído para a concentração de 5 «g/rriL num tampão carbonato 0,1 M, pH 9,5, e adsorvido durante uma noite a +4°C numa placa de 96 poços (placa E.I.A./R.I.A., Costar, Cambridge, MA, EUA). A placa foi saturada durante uma hora à temperatura do laboratório com um volume de 200 *L/poço de tampão PBS contendo 0,1% de soro albumina bovina e 5 mM de EDTA, e depois lavada duas vezes com um tampão ELISA (o tampão PBS acima com adição de 0,1% de Tween 20).

Foi realizada uma calibração com a proteína ESM-1 purificada segundo a técnica descrita por BECHARD et al. (2000).

As amostras de sangue foram diluídas em série (1:2 a 1:128), num tampão ELISA e incubadas numa placa ELISA durante uma hora a temperatura do laboratório.

Os poços foram lavados três vezes com um tampão ELISA e depois foram incubados durante 1 hora â temperatura do laboratório com um segundo anticorpo monoclonal dirigido contra ESM-1, o anticorpo MEC15 (CNCM N° 1-2572) â concentração de 0,1 *g/mL em 100 *L de tampão por poço.

Após três lavagens, adicionou-se anticorpo monoclonal de rato biotinilado dirigido contra os IgGl de ratinho 25 (comercializado pela PHARMIGEN) diluído num tampão ELISA e deixou-se incubar este segundo anticorpo durante uma hora.

Após três lavagens no tampão ELISA, os poços foram incubados com um conjugado de estreptavidina-peroxidase à diluição 1:10000 v/v (comercializado pela sociedade ZYMED).

Após 30 minutos de incubação com o conjugado estreptavidina-peroxidase, realizam-se três lavagens de cada poço num tampão ELISA e depois duas lavagens num tampão PBS. 0 conjugado estreptavidina-peroxidase é revelado com o substrato TMB comercializado pela sociedade SIGMA (Saint-Louis, MO, EUA) na presença de 5 *L de H202 durante 30'. A reacção de revelação é parada através da adição de um volume de 100 *L de H2S04 a 2N. A placa é lida com auxílio de um espectrofotómetro (anthos labtec LP40, França) ao comprimento de onda de 405 nanómetros. A concentração da proteína ESM-1 plasmática ou sérica é calculada a partir das medições de densidade óptica e expressa em nanograma por mL. EXEMPLO 4 i

Resultados comparativos de dosagem de ESm-1 com o teste de imunodetecção segundo a invenção e um teste de imunodetecção do estado da técnica.

Foram realizados os doseamentos comparativos da concentração conhecida da proteína ESM-1 recombinante produzida na linha 26 celular CHO transfectada, e depois purificada como descrito no exemplo 1. 0 primeiro doseamento foi efectuado em conformidade com os ensinamentos do exemplo 3. Resumidamente, o anticorpo MEP14 foi imobilizado numa placa de 96 poços do tipo ELISA, e depois colocado em contacto com uma série de soluções tampão PBS contendo uma concentração conhecida de proteína ESM-1. Após lavagem, o complexo formado entre o anticorpo MEP14 imobilizado e a proteína ESM-1 foi incubada com uma solução tampão contendo o anticorpo MEP15 da invenção.

Após uma nova série de lavagens, o complexo antigénio/anticorpo formado foi incubado sucessivamente com um anticorpo de rato anti-IgGl de ratinho biotinilado, e depois com um conjugado estreptavidina-peroxidase antes da revelação com peróxido de hidrogénio. 0 segundo teste foi realizado nas mesmas condições, mas utilizando o anticorpo MEP119 imobilizado na placa de 96 poços do tipo ELISA e o anticorpo MEP21 como segundo anticorpo nesta técnica imunoenzimática do tipo "sanduíche".

Os resultados são apresentados na figura 1.

Com a combinação de anticorpos segundo a invenção, obtém-se uma diferença significativa da densidade óptica com uma concentração da proteína ESM-1 da ordem de 0,15 a 0,2 nanogramas por mililitro.

Pelo contrário, com a combinação dos anticorpos MEP19 e MEP21, apenas se obtém um aumento significativo do valor da densidade óptica para uma concentração de ESM-1 igual a 1 ou 2 nanogramas por mL.

Os resultados apresentados na figura 1 mostram claramente a grande sensibilidade do teste de imunodetecção da proteína 27 ESM-1 segundo a invenção, em relação a um teste de imunodetecção do estado da técnica, uma vez que se observa uma diferença de sensibilidade compreendida entre 5 e 10 vezes entre estes dois testes, em favor do teste de imunodetecção da invenção. EXEMPLO 5:

Resultados comparativos de testes de imunodetecção utilizando diferentes anticorpos da invenção dirigidos contra a recrião N-terminal da proteína ESM-1 produzida pelas células da linha HEK293 transfectadas.

Foram realizados testes de imunodetecção do tipo "sandwich" em conformidade com o protocolo descrito no exemplo 3.

Em todos os casos, o anticorpo MEP14 foi imobilizado em poços de uma placa de 96 poços do tipo ELISA. Após a incubação da placa assim preparada com soluções de concentrações conhecidas de ESM-1 recombinantes produzidas por células da linha HEK293 transfectadas e lavagem, o complexo antigénio/anticorpo formado foi incubado na presença de um segundo anticorpo, respectivamente o anticorpo MEC2, o anticorpo MEC15 e o anticorpo MEC36.

Os resultados são representados na figura 2.

Os resultados mostram que a utilização de anticorpos monoclonais dirigidos contra a região N-terminal da proteína ESM-1 recombinante produzida por células eucarióticas num teste imunoenzimático do tipo "sanduíche" permite uma dosagem da proteína ESM-1 de grande sensibilidade, e cuja sensibilidade é reprodutível de um anticorpo para o outro.

Para o conjunto dos anticorpos MEC15, MEC2 e MEC36 testados, puderam ser detectadas concentrações da ordem dos 0,15 a 0,2 nanogramas por mL de ESM-1. 28 EXEMPLO 6: Aplicação do teste de imunodeteccão segundo a invenção para quantificar a proteína ESM-1 circulante em pacientes que sofrem de formas mais ou menos graves de spesia A. Materiais e métodos. A.l Teste de imunodetecção 0 teste de imunodetecção foi realizado em conformidade com o protocolo descrito no exemplo 3 acima. A. 2. Teste de outros marcadores sanguíneos 0 teste quantitativo da proteína solúvel ICAM-1 sérica foi realizada com um teste ELISA comercial (Diaclone Research, Besançon, França) . A placa é lida com auxílio de um espectrofotómetro (Anthos Labtec LP40, França) ao comprimento de onda de 450 nanómetros. A concentração de ICAM-1 solúvel sérica foi calculada a partir de medições da densidade óptica e expressa em nanograma por mL. O valor normal de concentração de proteína ICAM-1 solúvel foi de 571 ± 168 nanogramas por mL (219-1042; n = 77). 0 teste de quantificação da proteína procalcitonina foi realizado com um teste imunológico do tipo ILMA (Lumitest, B. R.A.M.S.-Diagnostica GmbH, Alemanha). 0 valor normal de procalcitonina é inferior a 0,5 nanogramas por mL. Os valores medidos para os pacientes atingidos de síndroma de resposta inflamatória sistémica (SIRS de "Systemic Inflammatory Response Syndrom") são geralmente compreendidos entre 0,5 e 2 nanogramas por mL. A quantidade de proteína C reactiva foi medida por imuno-nefelometria. 0 valor normal é inferior a 10 mg/L (Morley et al., 1982, Ann. N.Y. Acad. Sei. Vol. 389: 406-418). 29 A.3 Indivíduos 0 estudo foi realizado com quatro grupos de indivíduos, um grupo de indivíduos sãos não atópicos (razão de sexo igual a 1) e três grupos de pacientes atingidos de distúrbios inflamatórios sépticos sistémicos e/ou pulmonares (razão de sexo igual a 1,6, idade: 56 ± 2 anos).

Todos os voluntários sãos não atópicos apresentavam uma resposta negativa ao teste cutâneo de reacção de hipersensibilidade imediata, também denominado "prick test", e não apresentavam igualmente um histórico clínico de alergias.

Nenhum dos 68 pacientes era tratado com compostos corticoesteróides ou não sofriam hemodiálise no momento da recolha de amostras de sangue. 0 protocolo de experimentação foi aprovado pelo Comité Local de Ética dos Hospitais de universidades da Suíça. A.4 Definições.

Os termos seguintes foram utilizados para o estudo.

Infecção ê um fenómeno microbiano caracterizado por uma resposta inflamatória na presença de microrganismos ou na invasão de tecido do hospedeiro normalmente estéril por microrganismos. Síndroma de resposta inflamatória sistémica (SIRS de «Svstemic Inflammatory Response Svndrome») com nenhum sinal de infecção, é caracterizado pela presença de pelo menos dois dos quatro seguintes critérios clínicos: a) febre ou hipotermia (temperatura superior a 100,4°F [< a 38°C] ou > 96,8°F [> 36°C] ); b) taquicardia (> a 90 batimentos por minuto); 30 c) taquipneia (> a 20 respirações por minuto ou PaC02 < a 4,3 kPa [32 mmHg]); e d) uma contagem anormal de glóbulos brancos > a 12000 células/mm3, ou a presença de mais de 10% de formas imaturas respectivamente.

Soesia é definido como o SIRS acompanhado de uma infecção.

Sepsia grave ê definida como uma sepsia associada a uma disfunção, uma hipoperfusão ou uma hipotensão de um órgão. Anomalias de hipoperfusão e a perfusão podem incluir, mas não se limitam à oligúria (volume excretado < 30 mL/h), acidose láctica (nível de lactato sérico superior a 2 mmol/L) ou uma alteração aguda do estatuto mental sem sedação (redução de pelo menos 3 pontos em relação ao valor de base segundo a escala de coma do tipo Glasgow).

Choque séptico é definido como a presença de uma sepsia acompanhada por uma redução durável da pressão sanguínea cistólica (< a 90 mmHg, ou uma redução de 40 mmHg em relação ao valor de base da pressão sanguínea cistólica), associada à presença de anormalidades de perfusão (ver acima), apesar de uma reanimação adequada e da necessidades de aminas vasoactivas para manter uma pressão sanguínea adequada (Crit. Care Med. 1992, vol. 20: 864-874). A.5 Descrição do estudo

Para cada paciente, os parâmetros biológicos e clínicos seguintes foram obtidos: idade, sexo, diagnóstico principal e secundário tal como definido em Crit Care er., 1992, vol. 20: 864-874, antecedentes, tratamento, estado vital 10 dias antes da recolha de amostras de sangue, concentrações sérica e plasmática da proteína ESM-1.

Para a maioria dos pacientes, mediu-se igualmente outros parâmetros biológicos sanguíneos tais como a ICAM-1 solúvel 31 circulante (sICAM-1), a procalcitonina (proCT), e a proteína C-reactiva (CRP).

As amostras de sangue foram recolhidas de cada um dos pacientes (ou de cada um dos voluntários sãos) em tubos secos e em tubos tratados com EDTA, depois centrifugados durante 30 minutos à velocidade de 3500 rotações/minuto numa centrífuga do tipo jouan C3i (França).

As amostras de soro e de plasma foram conservadas durante um curto período a -20°C antes da realização dos testes. 0 período de sobrevivência a dez dias de hospitalização foi escolhido postulando que a infecção tinha contribuído directamente para a morte em pacientes ou que a contribuição do distúrbio inflamatório inicial em relação a outras causas de mortalidade não podia ser excluída. A.7 Análise estatística

Os dados são expressos como a média mais o menos o erro padrão (SEM).

As comparações dos níveis médios de ESM-1, sICAM-1, procalcitonina e CRP entre os diferentes grupos foram realizados utilizando o teste «One way Analysis» Anova (Bonferroni-Dunn), o teste de Kruskal-Wallis e o teste Mann-Whitney. A correlação entre os valores dos marcadores foi realizada graças ao teste Spearman Rank. A correlação entre o nível de marcador circulante e a gravidade do resultado para o paciente foi realizada utilizando o teste «One Way» ANOVA (Bonferroni-Dunn), o teste de Mann-Whitney e o teste de Wilcoxon. 32

Em geral, um valor de p < 0,05 é considerado como estatisticamente significativo.

Os gráficos foram realizados sob a forma de gráficos de barras verticais representadas pela sua mediana e os primeiro e terceiro espaços interquartis.

B. RESULTADOS B.l Correlação entre os níveis plasmáticos e séricos de ESM- li

Num primeiro ensaio, determinou-se se as condições de recolha de amostras de sangue podiam afectar o valor do nível ESM-1. A comparação dos valores de nível de ESM-1 plasmáticos e séricos em 41 indivíduos sãos apresentaram uma forte correlação (r = 0,85; p < a 0,0001). Na figura 3, pode-se observar que, como para o grupo controlo, não se observa nenhuma diferença significativa para um dado paciente entre os níveis plasmáticos e séricos de ESM-1, nos primeiros trinta e seis pacientes do estudo.

Estes resultados sugerem primeiramente que a coagulação do sangue não modifica o nível de ESM-1. Estes resultados sugerem ainda que a proteína ESm-1 pode ser quantificada indiferentemente a partir de amostras de sangue ou de plasma.

Em consequência, apenas o nível sérico de ESM-1 foi utilizado para o resto do estudo. B,3. Grupos de pacientes

Os resultados dos marcadores circulantes nos grupos de pacientes são resumidos na tabela 1 e ilustrados nas figuras 4 e 5.

No soro dos pacientes admitidos para uma sepsia severa, os níveis de sESM-1, sICAM-1, CRP e proCT são fortemente 33 aumentados para cada grupo de pacientes, comparados com o grupo controlo (tabela 1).

Estes níveis acrescidos são estatisticamente significativos (p < a 0,01 ou menos) para todos os marcadores e para todos os grupos de pacientes, â excepção da procalcitonina no grupo de pacientes atingidos de sepsia (tabela 1, figuras 4 e 5). A gravidade da doença é unicamente definida segundo três níveis graduais designados respectivamente sepsia, sepsia grave e choque séptico. Em cada um destes grupos, os níveis de ESM-1 aumentam de modo estatisticamente correlacionado com a gravidade da doença (p < 0,01, n = 61) (ver tabela 2).

Foram encontrados aumentos similares para os níveis de procalcitonina sérica e de CRP (respectivamente p = 0,0001, n = 34 e p < a 0,1, n = 43).

Por outro lado, o nível de sICAM-1 aumenta cerca de 5 vezes em relação ao valor normal, mas apresenta um nível similar em cada um dos grupos de pacientes.

Os teores de CRP (Anova e Mann-Whitney) e de ProCT (Mann-Whitney) permitem distinguir os grupos de pacientes atingidos por sepsia dos pacientes atingidos por sepsia grave, o que não é o caso para os níveis de ESM-1.

Os níveis de ESM-1 (Anova e Mann-Whitney) e de ProCT (Mann-Whitney) permitem distinguir os grupos de pacientes atingidos respectivamente por sepsia grave e de choque séptico, o que não é o caso para os níveis de CRP (ver tabela 2).

Em vista destes resultados, o nível de CRP parece como o marcador mais sensível na doença menos severa e o nível de ESM-1 parece ser um melhor marcador do que o marcador ProCT para as sepsia mais severas. 34

Uma procura de correlação entre os níveis séricos de ESM-1, sICAM-1, CRP ou ProCT permitiu estabelecer uma correlação significativa entre o nível de CRP e de procalcitonina (p < a 0,01, tabela 3).

No entanto, não se encontrou qualquer correlação entre os outros marcadores (ver tabela 3).

Ainda, não se observou qualquer correlação entre os níveis de ESM-1 e de creatinina plasmática no grupo dos pacientes afectados de choques sépticos (resultados não apresentados).

De modo a determinar se os níveis séricos de ESM-1 podiam prever um prognóstico vital, comparou-se numa primeira abordagem, os níveis médios de ESM-1 sérico entre os pacientes que faleceram e os pacientes que sobrevieram.

Quando todos os pacientes são tidos em conta desde a admissão em reanimação e segundo a evolução fatal ou não, os resultados mostram que o nível de ESM-1 sérico no dia da hospitalização (dia 0) é significativamente mais elevado no grupo dos pacientes que faleceram ao nível 10 (dia 10; p < a 0. 01; figura 6A e figura 7A) . Pode-se sublinhar que tais diferentes não são evidenciadas com outros marcadores sICAM- 1, CRP ou ProCT (figuras 6B-9).

Segundo uma segunda abordagem, os níveis de sESM.l e sICAMl foram medidos à vez no dia da hospitalização (dia 0) e 24 horas depois (dia 1) . O nível de ESM-1 ao dia 0 é significativamente superior nos pacientes que faleceram do que nos pacientes que sobreviveram (figuras 7A). Esta diferença persiste no dia 1 (n = 20, p < a 0,05) (figura 7A).

Uma tal diferença não pode ser observada com nenhum dos outros marcadores sICAM-1 (figura 7B) nem com a CRP, a procalcitonina ou a sICAM-1. 35

No grupo único de pacientes atingidos de choque séptico, os níveis séricos de ESM-1 ao dia 0 e ao dia 1 (n = 11) são significativamente mais elevados nos pacientes que faleceram do que nos pacientes que sobreviveram (figuras 8A-B).

Em cada grupo separadamente, não foi encontrada qualquer correlação estatisticamente significativa entre os níveis de sICAM-1 ao dia 0, de sICAM-1 ao dia 1 (figura 8B) , de CRP ao dia 0, ou de ProCT ao dia 0 e a sobrevivência ao dia 10 de cada paciente.

Os resultados apresentados neste exemplo mostram que o valor médio da concentração da proteína ESM-1 circulante é muito aumentado em relação aos indivíduos sãos. Este aumento da concentração média de ESM-1 circulante está correlacionado com o nível de gravidade clínica da doença. OS níveis mais elevvados de ESM-1 circulante nas fases precoces da doença são associados com uma probabilidade mais baixa de sobrevivência do paciente após 10 dias.

De acordo com estudos anteriores, os marcadores circulantes tais como a proteína C reactiva ou CRP (Morley et al.), a procalcitonina ou ProCT (ASSICOT M et al.); (MULLER B et al), (WANNER GA et al.) e a proteína solúvel ICAM-1 ou sICAM-1 (KAYAL S et al.), (SESSLER C N et al. (1995)) são igualmente significativamente em pacientes do estudo. Os marcadores CRP e ProCT são correlacionados com a gravidade clínica dos pacientes.

Em contrapartida, a determinação dos níveis dos três marcadores CRP, ProCT e sICAM-1 não permite prever o prognóstico vital, ao contrário da determinação do nível da proteína ESM-1 circulante. Ainda, o valor de previsão do nível sérico de ESM-1 está maioritariamente ligado ao valor inicial de ESM-1 sérica ao dia 0 de hospitalização. 36

Neste estudo, o aumento do nível de ESM-1 sérica não é correlacionado com uma disfunção renal, tendo esta sido medida pelo aumento do nível de creatinina plasmática. Este resultado sugere que os níveis acrescidos da proteína ESM-1 no soro em pacientes atingidos por choques sépticos provém de tecidos pulmonares alterados ou de células das paredes vasculares em estado de stress.

Em conclusão, os resultados do estudo apresentado neste exemplo indicam que ESM-1 representa um novo marcador de disfunção das células endoteliais em pacientes atingidos por sepsia.

Associados aos valores de outros parâmetros de marcadores circulantes como as moléculas de adesão solúveis, as citocinas, a procalcitonina ou outros marcadores de disfunção específica de certas células, o nível da proteína ESM-1 é de natureza a fornecer uma informação de interesse sobre a gravidade clínica e resultado nos pacientes atingidos de sepsia. TABELA 1

Valores de concentracão da proteína ESM-1 circulante em voluntários sãos e em diferentes grupos de pacientes atingidos por sepsia Marcadores sanguíneos Grupo n sESM-1 (ng/mL) SICAM-14 (ng/mL) CRP (mg/L) Procalcitonina (ng/mL) Valor 20 0,7 ± 571 ± < 10 < 0,5 37 normal (são não atópico) 0,1 168 Conjunto dos pacientes 61 5,4 ± 0,8*** 2510 ± 261*** 194 ± 21** 39,8 ± 12,4*** Sepsia (pulmonar) 29 2,5 ± 0,3*** 2336 ± 406*** 126 ± ]_5 * * * 2,0 ± 1,4 Sepsia severa 12 4,5 ± ]_ 4 * * * 2696 ± 721* 292 ± 73** 23,8 ± 9,2*** Choque séptico 20 10,0 ± 1,8*** 2661 ± 373*** 245 ± 2 9 * * * 90,8 ± 29,5*** Os valores dos marcadores sanguíneos são expressos como o valor médio ± SEM (erro padrão) . Diferença significativa entre cada grupo de pacientes e o valor normal (grupo de indivíduos p < 0,0001. sãos não atópicos): * p < 0,01; ** ? < 0,0001; *** TABELA 2

Descricão potencial da aravidade do estado do paciente em função do nível dos marcadores circulantes Marcadores que apresentam uma diferença significativa (ANOVA) sESM-1 SlCAM-1 CRP ProCT ECS e S/S p<0,01 NS NS NS ECS e S p<0,0001 NS p<0,05 p<0,01 S/S e S NS NS p<0,01 NS Kruskal-Wallis p<0,01 NS p<0,01 p<0,0001 Marcadores que apresentam uma diferença significativa sESM-1 sICAM-1 CRP ProCT 38 (Mann-Whitney) ECS e S/S p<0,05 NS NS p<0,05 ECS e S p<0,001 NS p<0,01 p<0,0001 S/S e S NS NS p<0,05 p<0,01 NS = não significativo. TABELA 3

Correlação entre os diferentes valores dos marcadores sanguíneos Marcador SESM- 1 pESM-1 Idade 1ICAM-1 CRP ProCT Creatinina no plasma sESM-l - p<0,0001 NS NS NS NS NS Sicam-1 NS - - - NS NS - CRP NS - - NS - p<0,01 - ProCT NS - - NS p<0,01 - - NS = não significativo.

REFERÊNCIAS • AMERICAN COLLEGE OF CHEST PHYSICIANS/SOCIETY OF CRITICAL CARE MEDICINE CONSENSUS CONFERENCE (1992). • ASSICOT M et al., 1993, Lancet, vol. 341: 515-518 • BECHARD et al. (2000) J. Vasc. Res. , vol. 37(5): 417-425. • ICHINOSE N et al. (1991, In: Fluorometric analysis in Biomedical Chemistry, vol. 10, page 110, Chemical Analysis, Winefordner JD et al. editor, John Whiley and Sons, New York) • KAYAL S et al., 1998, Am. J. Respir. Crit Care Med, vol. 157: 774-776; • KOHLER e MIELSTEIN (1975, Nature, vol. 256: 495) 39 • KOZBOR et al. (1983, hybridoma, vol. 2 (1): 7-16). • LASSALLE P et al. (1996) The Journal of Biological

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Claims (18)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Bolsa ou estojo de detecção da proteína ESM-1 numa amostra, compreendendo: a) um primeiro anticorpo que se fixa especificamente à região N-terminal da proteína ESM-1 compreendida entre o aminoácido na posição 20 e o aminoãcido na posição 78 da sequência em aminoácidos desta proteína; e b) um segundo anticorpo que se liga especificamente à região C-terminal compreendida entre o aminoácido na posição 79 e o aminoácido na posição 184 da sequência em aminoácidos da proteína ESM-1.
2. 2. Estojo de detecção segundo a reivindicação 1, caracterizada pelo anticorpo que se liga especificamente â região N-terminal da proteína ESM-1 ter sido obtido após imunização de um mamífero com a proteína ESM-1 recombinante produzida por uma célula eucariótica.
3. 3. Bolsa de detecção segundo qualquer uma das reivindicações 1 e 2, caracterizada pelo anticorpo que se liga especificamente à região N-terminal da proteína ESM-1 ser o anticorpo monoclonal produzido pela linha de um hibridoma designado MEC15 depositado na Colecção de Culturas de Microrganismos do Institut Pasteur a 17 de Outubro de 2000 com o número de acesso N° 1-2572.
4. 4. Bolsa de detecção segundo uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo anticorpo que se liga especificamente à região C-terminal de ESM-1 ser escolhido entre os anticorpos capazes de reconhecer um dos três seguintes determinantes antigénicos. a) o determinante AgDl que vai do resíduo prolina na posição 79 até ao resíduo cisteína na posição 99 de ESM-1; b) o determinante antigénico AgD2 que vai do resíduo serina na posição 119 até ao resíduo valina na posição 189 da proteína ESM-1; 1 c) o determinante antigénico AgD3 que vai do resíduo glicina na posição 159 até ao resíduo arginina na posição 184 da proteína ESM-1.
5. 5. Bolsa de detecção segundo a reivindicação 4, caracterizada pelo anticorpo que se liga especificamente à região C-terminal de ESM-1 ser escolhido entre os anticorpos seguintes: a) o anticorpo MEP21 produzido pela linha do hibridoma depositada na CNCM a 19 de Novembro de 1997 com o N° de acesso 1-1944; b) o anticorpo monoclonal MEP08 produzido pela linha do hibridoma depositada a 19 de Novembro de 1997 na CNCM com o N° de acesso 1-1941; c) o anticorpo monoclonal MEP14 produzido pela linha do hibridoma depositada a 19 de Novembro de 1997 na CNCM com o N° de acesso 1-1942; d) o anticorpo monoclonal MEP19 produzido pela linha do hibridoma depositada a 19 de Novembro de 1997 na CNCM com o N° de acesso 1-1943.
6. 6. Bolsa de detecção segundo uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada por pelo menos um dos dois anticorpos estar ligado de modo covalente a uma molécula que permite a sua detecção directa, ou indirecta.
7. 7. Bolsa de detecção segundo uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo primeiro ou o segundo anticorpo estar imobilizado num suporte.
8. 8. Bolsa de detecção segundo a reivindicação 7, caracterizada pelo anticorpo imobilizado num suporte ser o anticorpo que reconhece especificamente a regia C-terminal da proteína ESM-1.
9. 9. Processo de detecção da proteína ESM-1 numa amostra, caracterizado por compreender as seguintes etapas: 2 a) pôr em contacto a amostra a testar com um primeiro anticorpo que se liga especificamente â região N-terminal da proteína ESM-1 que vai do aminoácido na posição 20 ao aminoácido na posição 78 da sequência desta proteína, ou com um primeiro anticorpo que se liga â região C-terminal da proteína ESM-1; b) pôr em contacto o complexo eventualmente formado entre a proteína ESM-1 presente na amostra e o primeiro anticorpo com um segundo anticorpo que se liga especificamente à região da proteína ESM-1, escolhida entre a região N-terminal que vai do aminoácido em posição 20 ao aminoácido em posição 78 da sequência desta proteína e a região C-terminal, não reconhecida pelo primeiro anticorpo; e c) detectar o complexo eventualmente formado entre a proteína ESM-1 e o segundo anticorpo.
10. 10. Processo de detecção segundo a reivindicação 9, caracterizado pelo primeiro anticorpo ser imobilizado sobre um suporte.
11. 11. Processo de detecção segundo uma das reivindicações 9 e 10, caracterizado pelo primeiro anticorpo ser um anticorpo que se liga especificamente à região C-terminal da proteína ESM-1 e o segundo anticorpo é um anticorpo que se liga especificamente â região N-terminal da proteína ESM-1 que vai do aminoácido na posição 20 ao aminoácido na posição 78 da sequência desta proteína.
12. 12. Processo de detecção segundo qualquer uma das reivindicações 9 a 11, caracterizada pelo anticorpo que se liga especificamente â região N-terminal da proteína ESM-1 ser o anticorpo MEC15 produzido pelo hibridoma depositado a 17 de Outubro de 2000 na CNCM com o número de acesso I-2572 .
13. 13. Processo de detecção segundo qualquer uma das reivindicações 9 a 12, caracterizado pela etapa c) do processo ser realizada com auxílio de um anticorpo biotinilado capaz de se fixar ao segundo anticorpo. 3
14. 14. Linha do híbridoma MEC15 depositada na CNCM a 19 de Novembro de 1997 com o n° 1-2572.
15. 15. Anticorpo monoclonal produzido pela linha do hibridoma MEC15 depositada na CNCM a 19 de Novembro de 1997 com o n° I- 2572.
16. 16. Utilização de um estojo de detecção segundo qualquer uma das reivindicações 1 a 8 para detectar in vitro alterações da parede vascular endotelial no Homem.
17. 17. Utilização de um estojo de imunodetecção segundo qualquer uma das reivindicações 1 a 8 para quantificação da proteína ESM-1 in vitro num paciente tratado por um composto imunossupressor.
18. 18. Utilização de um estojo de detecção segundo qualquer uma das revindicações 1 a 8 para a quantificação in vitro da proteína ESM-1 num paciente afectado por um cancro. II- 09-2007 4