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Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Organtransplantatabstoßungen und
damit verbundene Leiden und insbesondere Materialien und Verfahren
zur Diagnose, Prognose oder Behandlung einer akuten Abstoßung nach
der Transplantation eines festen Organs.
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Hintergrund der Erfindung
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Jedes
Jahr werden weltweit etwa 55.000 Transplantationen fester Organe
durchgeführt.
Diese Zahl umfasst etwa 10.000 Herzen, 35.000 Nieren, 16.000 Lebern
und 2.000 Lungen. Eine Abstoßung
stellt dabei weiterhin die am häufigsten
auftretende Komplikation nach einer Transplantation dar und ist
die Hauptursache für
Morbidität
und Mortalität.
Im Allgemeinen sind drei Arten der Organabstoßung anerkannt: hyperakute,
akute und chronische Abstoßung.
Die hyperakute Abstoßung
tritt innerhalb von 24 h nach der Transplantation auf und ist leicht
zu erkennen. Die akute Abstoßung
wird im Allgemeinen als Abstoßung
betrachtet, die innerhalb der ersten sechs Monate nach der Transplantation
auftritt und durch mononukleare Zellen vermittelt wird, die in das
Transplantat eindringen und die Parenchymzellen des Transplantats
akut beschädigen.
Sie wird gewöhnlicherweise
durch eine zytolytische Anti-T-Zell-Therapie umgekehrt. Die chronische Abstoßung, die
im Allgemeinen als Abstoßung
betrachtet wird, die zumindest sechs Monate nach der Transplantation
auftritt, kann klinisch nur schwer diagnostiziert werden und erfolgt
gewöhnlicherweise
in Form einer graduellen Vaskulopathie (d. h. eines Verschlusses)
transplantierter Gefäße.
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Konstante
Wachsamkeit ist erforderlich, um die Immunreaktion auf ein transplantiertes
Organ in den ersten 3 Monaten zu überwachen, in denen die Wahrscheinlichkeit
für das
Auftreten einer akuten Abstoßung am
höchsten
ist. Nach einer Nierentransplantation sind erhöhte Serumkreatinin- und Harnstoffspiegel
ein Zeichen für
das Versagen der Transplantatfunktion, aber weisen nicht im Speziellen
auf eine immunologische Schädigung
des Transplantats hin. Diese Anzeichen werden dennoch herkömmlicherweise
zur Detektion einer Nierenabstoßung
eingesetzt, und Nierenbi opsien kommen nur gelegentlich zum Einsatz.
Im Gegensatz dazu beruht die Überwachung
transplantierter Herzen und Lungen vollständig auf histologischen oder
klinischen Parametern. Es gibt keine bestehenden Verfahren zur nicht-invasiven
Detektion von Herz- oder Lungentransplantatabstoßungen.
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Bei
Herztransplantationspatienten werden demnach bis 6 Wochen wöchentlich
und danach bis 3 Monate nach der Transplantation alle 2 Wochen Endomyokardbiopsien
zur Überwachung
entnommen. Zusätzlich dazu
folgt auf jede positive Biopsie eine Woche später eine Wiederholungsbiopsie,
um den Erfolg der Anti-Abstoßungstherapie
sicherzustellen. Bei klinischer Indikation können dem Patienten auch weitere
Biopsien durchgeführt
werden. Bei jedem Herztransplantationspatienten werden im ersten
Jahr beispielsweise mindestens 9 Biopsieverfahren durchgeführt. Die
Lungenfunktion wird von den Patienten selbst täglich routinemäßig unter
Verwendung eines Spirometers gemessen. Auf etwaige unerklärliche anhaltende
Rückgänge der
Lungenfunktion folgt eine transbronchiale Biopsie, um die Diagnose
histologisch zu bestätigen.
Es ist besonders wichtig, eine differenzierte Diagnose von Abstoßung bzw.
einer Infektion nach der Lungentransplantation zu erhalten. Aus
diesem Grund wird neben der transbronchialen Biopsie gewöhnlicherweise
eine Bronchiallavage durchgeführt,
die für
eine Kulturanalyse und eine bakteriologische Analyse eingeschickt
wird.
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Eine
routinemäßige histologische
Analyse von Herzbiopsien stellt somit weiterhin einen Eckpfeiler
des Vorgehens nach einer Herztransplantation dar, und etwaige neue
Verfahren zur Detektion einer Abstoßung werden mit der histologischen
Einstufung von Biopsien verglichen, die weiterhin als Goldstandard
gelten. Ein standardisiertes Nomenklatur- und Einstufungssystem
für Herz
und Lunge wurde 1990 (1, 2) vorgeschlagen und wird derzeit von den
Zentren mehrheitlich eingesetzt. Das Endomyokardbiopsieverfahren
ist für
den Patienten jedoch unangenehm, geht mit einer geringen Wahrscheinlichkeit
für das
Auftreten von Komplikationen einher und ist sehr arbeitsintensiv
und teuer. Für
den Patienten und das Krankenhaus wäre ein nicht-invasives Verfahren
anstelle der Endomyokardbiopsie ein großer Vorteil. Theoretisch bestehen
zahlreiche Möglichkeiten für eine nicht-invasive
Detektion einer Abstoßung, einschließlich der
nicht-invasiven Überwachung
der Herzfunktion, wie z. B. mittels Magnetresonanzdarstellung (3),
signalgemitteltem Elektrokardiogramm (SAECG) (4), spezialisierten
echokardiographischen Indizes (5) und der Suche nach Markern in
peripherem Blut. Es gibt zwei wesentliche Ansätze bei der Verwendung von
Blutmarkern: einer besteht in der Nutzung des Wissens in Bezug auf
die Aktivierung des Immunsystems des Rezipienten und der andere
in der Suche nach Markern für eine
Transplantatschädigung.
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In
den letzten zehn Jahren ist das Wissen in Bezug auf die Wirkung
eines Allotransplantats auf das Immunsystem förmlich explodiert. Eine Abstoßung wird
durch CD4+-Rezipienten-T-Lymphozyten initiiert, die fremde MHC-Moleküle der Klasse
II auf antigen-präsentierenden
Zellen in den Spendertransplantaten erkennen. Dadurch wird eine
Cytokin-Kettenreaktion initiiert, die direkt eine Schädigung der
Transplantatparenchymzellen oder das Auslösen und Verstärken weiterer
Effektormechanismen, wie z. B. CD8+-T-Zellen, Makrophagen und B-Zellen,
bewirken kann. Auf dem Gebiet der Herztransplantation, wo eine Dissoziation
zwischen der Größe des Infiltrats
und dem Ausmaß der
hämodynamischen
Beeinträchtigung
des Herzens bestehen kann, wird angenommen, dass TNF-α und Stickoxid
negative inotrope Wirkungen auf schlagende Myozyten aufweisen.
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Im
Lauf der Jahre wurden zahlreiche Versuche unternommen, Anzeichen
für Immunaktivierung
in peripherem Blut zu finden. Diese Versuche umfassten die Untersuchung
von peripherem Blut in Bezug auf den Spiegel von IL-2, löslichem
IL-2R, IL-6, IL-7, IL-8, TNF-α,
IFN-γ, löslichem
ICAM-1, löslichen
MHC-Antigenen, aktivierten T-Zellen
und T-Zellpopulationen sowie zytoimmunologische Überwachung (6). Bei diesen
Untersuchungen handelt es sich oft um Querschnittsuntersuchungen,
und wenn die Ergebnisse zusammengeführt werden (z. B. Abstoßung und
Nicht-Abstoßung
verglichen werden), kann das zum Erhalten von signifikanten Unterschieden
führen.
Bei der Durchführung
von Langzeitstudien bei einzelnen Patienten können die Werte für einen
bestimmten Marker jedoch täglich
oder wöchentlich
so deutlich variieren, dass auf diese Weise abgeleitete Empfindlichkeiten
und Spezifitäten
für den
prakti schen Einsatz nicht geeignet sind. Es ist klar, dass das Immunsystem
während
der ersten drei Monate, in denen die meisten Abstoßungsepisoden
auftreten, äußerst labil
ist. Durch eine verstärkte
Immunsuppression kommt es zu direkten (z. B. Anti-Thymozyten-Globulin bindet
an lösliches
HLA und Adhäsionsmoleküle) und
indirekten Modifikationen, indem das Gleichgewicht von Zellunterpopulationen,
während
sich diese von der Erschöpfung
erholen, verändert
wird. Insgesamt sind diese Immunaktivierungsmarker im Vergleich
mit nicht transplantierten Patienten immer erhöht, stellen aber keine zuverlässigen Indikatoren
für eine
Abstoßung
in einzelnen Transplantationspatienten dar.
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Ein
möglicher
Grund für
die geringe Spezifität
und Empfindlichkeit der Marker nach dem Stand der Technik besteht
darin, dass sie nicht zwischen einer Abstoßung und einer Infektion unterscheiden.
Um dieses Problem zu umgehen, wurden Untersuchungen durchgeführt, um
eine Unterscheidung von spenderspezifischen und Fremd-T-Zellreaktionen
zu versuchen, um den Zustand des Immunsystems des Patienten zu bewerten
(7, 8).
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Die
Erfinder haben sich auch damit beschäftigt, wo man erwartungsgemäß spenderspezifische
Lymphozyten finden würde – im peripheren
Blutkreislauf oder in dem Transplantat. Zu diesem Zweck haben die Erfinder
Lymphozyten aus Endomyokardbiopsien von Patienten kultiviert und
eine Grenzverdünnungsanalyse durchgeführt, um
die Anzahl der zytotoxischen Vorläuferzellen mit spenderspezifischer
Spezifität
oder Fremdspezifität
zu bestimmen. Gleichzeitig wurden Lymphozyten aus dem Blut des Patienten
kultiviert und ein Vergleich der im Blut und im Transplantat vorgefundenen
Vorläuferhäufigkeit
spenderspezifischer Zellen durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten
das Vorhandensein von spenderreaktiven CD8+-T-Zellen während der Abstoßung, wobei
diese jedoch fast ausschließlich
im Transplantat und nicht im Blut vorgefunden wurden. Das verringert
die Möglichkeiten,
eine spezifische Reaktivität
im peripheren Blutkreislauf nachzuweisen, wenn kein besonders empfindlicher
Test eingesetzt wird. Dasselbe Argument kann für die Detektion von Zytokinen
im Blutkreislauf eingesetzt werden. Es wurde gezeigt, dass hohe
Spiegel von IL-6 und löslichem
TNF-R1 (TNF-Rezeptor) im Koronarsinus, aber nicht im Aortenblut,
während Abstoßungsepisoden
mit einem mangelhaften vasomotorischen Koronartonus einhergingen
(9).
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Interessanterweise
wird bei manchen Patienten während
zellvermittelten akuten Abstoßungsepisoden spenderspezifischer
Alloantikörper
produziert (10), wobei es jedoch unwahrscheinlich ist, dass diese
Reaktion rasch genug erfolgt, um anhand dieser Patienten zu überwachen.
Kürzlich
wurde über
einen Zusammenhang zwischen der Eosinophilenzahl im Blut und akuter
Herz- und Lungenallotransplantatabstoßung berichtet (11), wobei
abzuwarten ist, ob dieser ausreichend spezifisch und empfindlich
ist, um von praktischem Nutzen zu sein.
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In
den Anfangszeiten der Herztransplantation (etwa in den 1970er-Jahren)
vor dem Aufkommen von Cyclosporin wurden herkömmliche serologische Marker
für Herzschäden (Lactatdehydrogenase,
Creatinkinase) als Marker für
ein Transplantatversagen herangezogen. Diese waren jedoch zu wenig
empfindlich, und es wurde oft zu spät festgestellt, dass sie erhöht waren,
um der Abstoßung
von Herzallotransplantaten entgegenzuwirken. Troponin ist ein kontraktiler
Regulatorkomplex, der in quergestreifter und Herzmuskulatur zu finden ist.
Es besteht aus drei verschiedenen Polypeptidkomponenten: Troponin
C (das calciumbindende Element), Troponin I (das Actinomyosin-ATPase-hemmende
Element) und Troponin T (das tropomyosinbindende Element). Der Komplex
dient zur Regulation der calciumabhängigen Wechselwirkung von Myosin
und Actin und spielt somit eine wesentliche Rolle für die Muskelkontraktion.
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In
den 1990er-Jahren wurden spezifische Enzymimmuntests gegen herzspezifische
Isoformen von Troponin T und Troponin I entwickelt, die nur eine
geringe Kreuzreaktivität
mit den Isoformen der Skelettmuskulatur aufweisen (12). Mit den
derzeit im Handel erhältlichen
Sets können
Troponin T oder Troponin I im Blutkreislauf nur bei Patienten mit
schwerer Herzmuskelschädigung,
wie z. B. mit einem Myokardinfarkt (13) oder nach einer Herzoperation
(14), detektiert werden. Katus berichtete als Erster darüber, dass
der Einsatz von Troponin T zur Überwachung
der Herzabstoßung
eingeschränkt
war, da in den ersten Tagen nach der Transplantation ein hoher Spie gel
zu beobachten war, der 2–3
Monate weit über
dem Normalwert blieb (15). Dies wurde nicht mit der Ischämiezeit
in Zusammenhang gebracht, und die Gründe für diese erhöhten Spiegel sind weiterhin
unklar. Sie spiegeln wahrscheinlich durch humorale Faktoren (Antikörper oder
Zytokine) hervorgerufene geringe immunologische Schädigungen
wider. Aus diesem Grund kann der Test nicht zur Überwachung der Abstoßung in
den ersten drei Monaten eingesetzt werden, während derer die Wahrscheinlichkeit
für das Auftreten
einer Abstoßung
am höchsten
ist. Nach dieser Phase detektiert der Test eine Abstoßung der
Grade 3 oder 4 mit einer hohen Empfindlichkeit von 80,4% und einem
ausgeprägten
negativen Vorhersagewert von 96,2% (16). Der Test wurde auch bei
Patienten sechs Monate nach der Transplantation eingesetzt, bei
denen angenommen wird, dass steigende Spiegel eine chronische Abstoßung vorhersagen
(17). Eine interessante Anpassung dieses Tests an Transplantationen
erfolgte durch die Messung des Serum-Troponin-T-Spiegels in Spendern:
hohe Spiegel korrelierten dabei mit dem Auftreten von Abstoßungen bei
den Rezipienten solcher Herzen (18), was vermutlich eine Schädigung und
die Freisetzung von Transplantatantigenen widerspiegelt, die vom
Immunsystem erkannt werden.
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Kawauchi
et al. (Jap. J. Surgery 20(2), 212–216 (1990)) offenbaren die
Diagnose einer Herzallotransplantatabstoßung bei Japanmakaken durch
die Detektion von Plasma-Herzmyosin-Leichtketten.
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EP 0 357 856 A offenbart
das Klonieren der menschlichen Ventrikelmyosin-Leichtkette 2.
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GB 2 268 935 A offenbart
die Verwendung des Proteinmarkers Vimentin zur Diagnose und Prognose chronischer
Transplantatabstoßungen.
WO 93/003381 offenbart
die Verwendung von FSC als Marker für die Abstoßung von transplantierten Organen.
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Kovalyov
et al. (Electrophoresis 16, 1160–1169 (1995)) beschreiben das
Proteinexpressionsprofil des menschlichen Herzens anhand zweidimensionaler
Elektrophoreseexperimente.
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Watkins
et al. (The New England Journal of Medicine, 1058–1064 (20.
April 1995)) offenbaren Mutationen in den Genen für Herztroponin
T und α-Tropomyosin
bei familiärer
hypertropher Kardiomyopathie. Hwang et al. (Genomics 66, 1–14 (2000))
betrifft auch auf die Expressionsmuster von Proteinen bei Patienten
mit dieser Erkrankung.
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US-Patent Nr. 5.840.477 und
WO 00/20488 betreffen Mutationen
von α-Tropomyosin
und Herztroponin T und Verbindungen zu hypertropher Kardiomyopathie.
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Aus
den oben stehenden Erläuterungen
geht hervor, dass auf dem Gebiet der Erfindung weiterhin das Problem
besteht, Marker zu finden, die eine präzise und frühe Diagnose einer akuten Abstoßung bereitstellen.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Im
Allgemeinen betrifft die vorliegende Erfindung Marker in Zusammenhang
mit Organtransplantatabstoßung
und damit zusammenhängenden
Leiden und stellt insbesondere Materialien und Verfahren zur Diagnose,
Prognose und Behandlung von akuter Abstoßung und insbesondere akuter
Abstoßung
nach der Transplantation fester Organe bereit.
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Die
Ansätze
zur Suche nach Markern nach dem Stand der Technik erforderten zunächst die
Vorkenntnis der an einer akuten Abstoßung beteiligten Prozesse,
wobei diese Kenntnis dann eingesetzt wurde, um mögliche Marker auszuwählen. Die
vorliegende Erfindung verwendete einen alternativen, umfassenden
Ansatz, der kein Vorwissen und keine Annahmen erfordert und bei
dem nach Gewebe- oder Serumveränderungen
in Zusammenhang mit akuter Abstoßung gesucht wurde, mit dem
Ziel, Diagnose- und/oder Prognosemarker für eine akute Abstoßung nach
der Transplantation fester Organe zu identifizieren. Der eingesetzte
Ansatz besteht darin, mit tels 2D-Analyse sequenzieller Endomyokardbiopsiegewebeproben
Veränderungen
in Bezug auf die Proteinexpression zu identifizieren, die vor oder
während
einer akuten Abstoßung
auftreten. Diese potentiellen Marker für akute Abstoßung werden
dann unter Einsatz von mikrochemischen Verfahren, wie z. B. mittels
Massenspektroskopie, identifiziert und charakterisiert. Mono- und/oder
polyklonale Antikörper,
die für diese
Proteine spezifisch sind, werden dann in sensiblen Immuntests eingesetzt,
um zu ermitteln, ob diese Proteine im Plasma der Transplantationspatienten
detektiert werden können.
Auf diese Weise identifizierte Proteine stellen dann potentielle
Kandidaten zur Verwendung in nicht-invasiven Diagnose- und/oder
Prognosetests für
akute Abstoßungen
dar. Die Proteine können
dann durch das Screenen einer großen Anzahl von Serumproben
von Transplantationspatienten mit und ohne akute Abstoßung unter
Verwendung der Immuntests zur Detektion dieser Marker oder von als
Reaktion auf diese erzeugten Antikörpern als Marker bewertet werden.
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Dementsprechend
stellt die vorliegende Erfindung in einem ersten Aspekt die Verwendung
der Tropomyosin-1-α-Kette
(TMP1) oder eines Fragments davon oder von Antikörpern, die in der Lage sind,
TMP1 zu binden, als Marker zur Diagnose und/oder Prognose einer
akuten Abstoßung
und damit zusammenhängender Leiden
bereit, wobei ein Anstieg der TMP1-Menge oder der Menge der Antikörper in
einer aus einem Patienten erhaltenen Probe einen Indikator für die Prognose
oder Diagnose der akuten Abstoßung
oder des damit zusammenhängenden
Leidens darstellt.
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In
einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren
zur Diagnose und/oder Prognose einer akuten Abstoßung und
damit verbundener Leiden bereit, wobei das Verfahren die Bestimmung
des Vorhandenseins oder der Menge von Tropomyosin-1-α-Kette (TMP1)
oder einem Fragment davon oder Antikörpern, die in der Lage sind,
TMP1 zu binden, in einer aus einem Patienten erhaltenen Probe umfasst,
wobei ein Anstieg der Menge von TMP1 oder Antikörpern in der Probe die Prognose
oder Diagnose einer akuten Abstoßung oder eines damit zusammenhängenden
Leidens anzeigt.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
umfasst das Verfahren folgende Schritte:
- (a)
Kontaktieren einer aus einem Patienten erhaltenen Probe mit einem
festen Träger,
der ein darauf immobilisiertes Bindungsmittel mit Bindungsstellen
aufweist, die in der Lage sind, spezifisch an TMP1 oder TMP1-Antikörper zu
binden, die in der Probe aus dem Patienten vorhanden sind, unter
Bedingungen, unter welchen sich TMP1 oder die TMP1-Antikörper an
das Bindungsmittel binden, und
- (b) Bestimmung des Vorhandenseins oder der Menge von TMP1 oder
TMP1-Antikörpern,
die an das Bindungsmittel gebunden sind.
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In
einer Ausführungsform
umfasst Schritt (b) (i) das Kontaktieren des festen Trägers mit
einem Entwicklungsmittel, das in der Lage ist, an besetzte Bindungsstellen,
nicht-besetzte Bindungsstellen
oder TMP1 oder TMP1-Antikörper
zu binden, wobei das Entwicklungsmittel eine Markierung umfasst,
und (ii) das Detektieren der Markierung zum Erhalten eines Werts,
der für
das Vorhandensein oder die Menge von TMP1 oder TMP1-Antikörpern in
der Probe repräsentativ
ist. Beispiele für
Markierungen sind unten stehend angeführt. In einer bevorzugten Ausführungsform
handelt es sich bei der Markierung um ein Enzym, das durch seine
Wirkung auf ein Substrat ein detektierbares Ergebnis liefert, z.
B. in einem Test vom ELISA-Typ. In einer alternativen Ausführungsform
wird der Analyt in Schritt (b) durch Markieren detektiert, um zu
ermöglichen,
dass er detektiert wird, wenn er an das Bindungsmittel in der Anordnung
bindet. Markierungsverfahren sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt.
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In
einigen Ausführungsformen
wird in dem Verfahren immobilisiertes Protein in einem Test in Bezug auf
Antikörper
(z. B. Anti-Endothel-Antikörper)
eingesetzt, die in der Lage sind, an das Protein zu binden. Alternativ
dazu kann das Protein der Zielanalyt des Tests sein, z. B. indem
es an immobilisierte Antikörper
auf dem festen Träger
bindet. Bevorzugte Testformate werden unten stehend detaillierter
beschrieben.
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Um
ein Verfahren zur Diagnose und/oder Prognose bereitzustellen, das
präziser
ist als nach dem Stand der Technik, kann das Verfahren gegebenenfalls
eingesetzt werden, um das Vorhandensein oder die Menge einer Vielzahl
an Proteinmarkern oder Antikörpern
zu bestimmen, z. B. eines oder mehrerer der in Tabelle 2 angeführten Marker,
die mit der Organtransplantatabstoßung in einer Probe aus einem
Patienten in Zusammenhang stehen. Die Tests in Bezug auf die verschiedenen
Marker können
vorzugsweise unter Einsatz einer Vielzahl verschiedener Bindungsmittel
durchgeführt
werden, wobei jedes Bindungsmittel für einen anderen Analyt in der
Probe spezifisch ist und die Bindungsmittel an vordefinierten (d.
h. örtlich
voneinander getrennten) Stellen auf dem festen Träger immobilisiert
sind.
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In
einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Set zur
Verwendung zur Diagnose oder Prognose einer akuten Abstoßung durch
die Bestimmung des Vorhandenseins oder der Menge von Tropomyosin-1-α-Kette (TMP1)
oder einem Fragment davon oder Antikörpern, die in der Lage sind,
TMP1 zu binden, in einer aus einem Patienten erhaltenen Probe bereit,
wobei das Set Folgendes umfasst:
- (a) einen
festen Träger
mit einem Bindungsmittel, das in der Lage ist, an darauf immobilisierte
TMP1 oder TMP1-Antikörper
zu binden,
- (b) ein Entwicklungsmittel, das in der Lage ist, an besetzte
Bindungsstellen, nicht-besetzte
Bindungsstellen oder den Antikörper
oder das Antigen zu binden, wobei das Entwicklungsmittel eine Markierung
umfasst,
- (c) eine oder mehrere aus der aus Waschlösungen, Verdünnungsmitteln
und Puffern bestehenden Gruppe ausgewählte Komponenten.
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Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung werden nun zur Veranschaulichung und
nicht zur Einschränkung
unter Bezugnahme auf die beigefügten
Zeichnungen detaillierter beschrieben.
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Kurzbeschreibung der Zeichnungen
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1 zeigt
ein 2D-Gel, das Proteinmarker zur Diagnose einer akuten Abstoßung identifiziert.
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2 und 3 zeigen
die Ergebnisse eines ELISA-Tests in Bezug auf die hierin identifizierten
Marker einer akuten Abstoßung.
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Detaillierte Beschreibung
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Organtransplantatabstoßung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Diagnose, Prognose und Behandlung
der akuten Abstoßung
von transplantierten Organen und damit zusammenhängender Leiden. Akute Abstoßung bezeichnet,
wie auf dem Gebiet der Erfindung verwendet, die Form der Abstoßung, die
innerhalb der ersten sechs Monate nach einer Transplantation stattfindet,
und wird durch mononukleare Zellen vermittelt, die in das Transplantat
eindringen und eine akute Schädigung
der Transplantatparenchymzellen hervorrufen. Gewöhnlicherweise wird sie durch eine
zytolytische Anti-T-Zell-Therapie umgekehrt.
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Die
hierin beschriebenen Protein- und Antikörpermarker können zur
Diagnose, Prognose oder Behandlung der Abstoßung eines transplantierten
Organs, einschließlich
transplantierter fester Organe, wie z. B. Herz, Niere, Leber oder
Lunge, und anderer transplantierter Gewebe, wie z. B. Pankreas und
Dünndarm,
sowie pathologischer Leiden eingesetzt werden, die mit der akuten
Organ- oder Gewebeabstoßung
in Zusammenhang stehen.
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Tests
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Verfahren
zur Bestimmung der Konzentration von Analyten in Proben aus Individuen
sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und können durch Fachleute im Zusam menhang
mit der vorliegenden Erfindung leicht zur Bestimmung des Vorhandenseins
oder der Menge der Proteinmarker oder von Fragmenten davon oder
von Antikörpern
gegen die Marker in einer Probe aus einem Patienten angepasst werden.
Die Ergebnisse solcher Tests können
es einem Arzt wiederum ermöglichen,
zu bestimmen, ob ein Patient an einer Erkrankung leidet oder ob
das Risiko besteht, dass es zur Entwicklung einer akuten Abstoßung oder
eines damit zusammenhängenden
Leidens kommt. Sie können
es einem Arzt auch ermöglichen,
die Behandlung der Leiden zu optimieren. Demnach wird die Planung
einer geeigneten therapeutischen und/oder prophylaktischen Behandlung
ermöglicht,
wobei eine Optimierung der Behandlung dadurch ermöglicht wird,
dass sie auf jene abzielt, die mit hoher Wahrscheinlichkeit davon
profitieren.
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Die
hierin beschriebenen Verfahren sind sowohl zur Diagnose als auch
zur Prognose akuter Abstoßungen
nützlich.
Eine akute Abstoßung
kann dann angezeigt sein, wenn ein oder mehrere Marker in gesteigerter
oder verringerter Konzentration vorhanden sind. Bei manchen Markern
kann sowohl eine gesteigerte als auch eine verringerte Konzentration
eine akute Abstoßung
anzeigen.
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Bei
den Verfahren wird typischerweise eine biologische Probe aus dem
Patienten verwendet, wie z. B. Blut, Serum, Gewebe, Urin oder andere
geeignete Körperflüssigkeiten.
Blut stellt eine bevorzugte Probe aus dem Patienten dar.
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Bei
den Testverfahren zur Bestimmung der Konzentration der Proteinmarker
oder der Antikörper
werden typischerweise Bindungsmittel mit Bindungsstellen eingesetzt,
die in der Lage sind, gegenüber
anderen Molekülen
bevorzugt spezifisch an Proteinmarker oder Fragmente davon oder
Antikörper
zu binden. Beispiele für
Bindungsmittel umfassen Antiköper,
Rezeptoren und andere Moleküle,
die in der Lage sind, den Analyt von Interesse spezifisch zu binden.
Die Bindungsmittel sind vorzugsweise auf einem festen Träger, z.
B. an definierten, räumlich
voneinander getrennten Stellen, immobilisiert, damit sie während des
Tests einfach gehandhabt werden können.
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Die
Probe wird im Allgemeinen mit dem Bindungsmittel/den Bindungsmitteln
unter geeigneten Bedingungen kontaktiert, die es ermöglichen,
dass der Analyt in der Probe an das/die Bindungsmittel bindet. Die
teilweise Belegung der Bindungsstellen des Bindungsmittels/der Bindungsmittel
kann dann entweder durch die direkte oder indirekte Markierung des
Analyts oder unter Einsatz eines oder mehrerer Entwicklungsmittel
bestimmt werden, um ein Anzeichen für das Vorhandensein oder die
Menge des Analyts in der Probe zu erhalten. Typischerweise werden
die Entwicklungsmittel direkt oder indirekt markiert (z. B. mit
radioaktiven Markierungen, fluoreszierenden Markierungen oder Enzymmarkierungen,
wie z. B. Meerrettichperoxidase), so dass sie unter Einsatz von
Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, detektiert
werden können.
Direkt markierte Entwicklungsmittel weisen eine Markierung auf,
die mit dem Mittel assoziiert oder an dieses gebunden ist. Indirekt
markierte Entwicklungsmittel können
in der Lage sein, an eine markierte Spezies (z. B. einen markierten
Antikörper,
der in der Lage ist, an das Entwicklungsmittel zu binden) zu binden,
oder können
auf eine weitere Spezies wirken, damit diese ein detektierbares
Ergebnis liefert. Demnach können
radioaktive Markierungen unter Einsatz eines Szintillationszählers oder
einer Strahlungszählvorrichtung
detektiert werden, fluoreszierende Markierungen unter Einsatz eines
Lasers und eines konfokalen Mikroskops und Enzymmarkierungen durch
die Wirkung einer Enzymmarkierung auf ein Substrat, typischerweise
um eine Farbveränderung hervorzurufen.
In weiteren Ausführungsformen
wird das Entwicklungsmittel oder der Analyt markiert, um dessen
Detektion zu ermöglichen,
z. B. an eine Nucleotidsequenz gebunden, die in einer PCR-Reaktion zur Detektion
des Analyts amplifiziert werden kann. Weitere Markierungen sind
Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und werden unten
stehend erläutert.
Das/die Entwicklungsmittel kann/können in einem kompetitiven
Verfahren, in dem das Entwicklungsmittel mit dem Analyt um besetzte
Bindungsstellen des Bindungsmittels konkurriert, oder in nicht-kompetitiven
Verfahren eingesetzt werden, in denen das markierte Entwicklungsmittel
den durch das Bindungsmittel oder an besetzte Bindungsstellen gebundenen
Analyt bindet. Beide Verfahren stellen eine Angabe der Anzahl der
durch den Analyt besetzten Bindungsstellen und somit die Konzentration
des Analyts in der Probe bereit, z. B. durch den Vergleich mit Standards, die
unter Einsatz von Proben mit bekannten Konzentrationen des Analyts
erhalten wurden.
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In
alternativen Ausführungsformen
kann der Analyt markiert werden, bevor er auf den Träger, der
das Bindungsmittel umfasst, aufgebracht wird.
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In
einem bevorzugten Format wird das Vorhandensein oder die Menge von
einem in Tabelle 2 angeführten
Marker oder von Antikörpern
gegen diese Antigene in einem ELISA-Test bestimmt.
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Auf
dem Gebiet der Diagnostik besteht auch eine immer stärker werdende
Tendenz in Richtung einer Miniaturisierung solcher Tests, z. B.
unter Verwendung von an kleinen, voneinander getrennten Stellen
(Mikrospots) und/oder in Form von Arrays auf festen Trägern oder
Diagnosechips immobilisierten Bindungsmitteln (wie z. B. Antikörpern oder
Nucleinsäuresequenzen).
Diese Ansätze
können
besonders wertvoll sein, da sie eine große Empfindlichkeit bereitstellen
können
(insbesondere durch die Verwendung von fluoreszierend markierten
Reagenzien), nur eine geringe Menge der biologischen Probe aus den
getesteten Individuen erfordern und die gleichzeitige Durchführung verschiedener
einzelner Tests ermöglichen.
Der zuletzt angeführte
Vorteil kann nützlich
sein, da er einen Test bereitstellt, bei dem eine Vielzahl an Analyten
eingesetzt werden kann und der unter Einsatz einer einzigen Probe
durchgeführt
werden kann. Beispiele für
Verfahren, die diese miniaturisierte Technologie ermöglichen,
sind in
WO84/01031 ,
WO88/01058 ,
WO89/01157 ,
WO93/08472 ,
WO95/18376 ,
WO95/18377 ,
WO95/24649 und
EP 0 373 203 A bereitgestellt.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung demnach
ein Set bereit, das einen Träger
oder Diagnosechip mit einer darauf immobilisierten Vielzahl an Bindungsmitteln
umfasst, die in der Lage sind, verschiedene Proteinmarker oder Antikörper spezifisch
zu binden, gegebenenfalls in Kombination mit anderen Reagenzien
(wie z. B. markierten Entwicklungsreagenzien), die erforderlich
sind, um einen Test durchzuführen.
In diesem Zusammenhang kann der Träger Bindungsmittel umfassen,
die für
Analyte, wie z. B. Vimentin, spezifisch sind, wie z. B. in
US-Patent Nr. 5.716.787 offenbart.
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Proteinexpression
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Nach
der Identifizierung von Proteinmarkern, die mit einer akuten Abstoßung in
Zusammenhang stehen, können
große
Mengen des Proteins unter Einsatz von Expressionsverfahren erzeugt
werden, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind. Das auf diese
Weise hergestellte Protein kann als Bindungsmittel, wobei es in
einem Test für
Antikörper
in einer Probe aus einem Patienten auf einem festen Träger immobilisiert
wird, oder als Immunogen zur Herstellung von Antikörpern eingesetzt
werden. Alternativ dazu können
das Protein oder Fragmente davon in der therapeutischen Behandlung
einer Organtransplantatabstoßung,
d. h. zur Linderung der schädlichen
Wirkung der Antikörper,
eingesetzt werden.
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Systeme
zum Klonieren und Exprimieren eines Polypeptids in zahlreichen verschiedenen
Wirtszellen sind bekannt. Geeignete Wirtszellen umfassen Bakterien,
eukaryotische Zellen, wie z. B. Säugetier- und Hefezellen, und
Baculovirensysteme. Säugetierzelllinien,
die auf dem Gebiet der Erfindung für die Expression eines heterologen
Polypeptids zur Verfügung
stehen, umfassen CHO-Zellen, HeLa-Zellen, BHK-Zellen, COS-Zellen und viele andere.
Ein herkömmlicher
bevorzugter bakterieller Wirt ist E. coli.
-
Geeignete
Vektoren können
ausgewählt
oder konstruiert werden, die geeignete Regulationssequenzen, einschließlich Promotorsequenzen
Terminatorfragmente, Polyadenylierungssequenzen, Enhancersequenzen,
Markergene, und andere Sequenzen wie benötigt enthalten. Bei den Vektoren
kann es sich auf angemessene Weise um Plasmide, virale Vektoren,
z. B. Phagen, oder Phagemidvektoren handeln. Für weitere Details siehe beispielsweise
Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2. Aufl.,
Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Viele bekannte Verfahren
und Protokolle für
die Manipulation von Nucleinsäure,
beispielsweise bei der Herstellung von Nucleinsäurekonstrukten, für Mutagenese,
Sequenzieren, das Einführen
von DNA in Zellen und für
Genexpression, sowie die Analyse von Proteinen sind detailliert
in Ausubel et al. (Hrsg.), Current Protocols in Molecular Biology,
John Wiley & Sons
(1992), beschrieben.
-
Nach
dem Transformieren der Wirtszellen mit der für die Proteine kodierenden
Nucleinsäure
können diese
dadurch erzeugt werden, dass die Expression aus der Nucleinsäure hervorgerufen
oder zugelassen wird, z. B. durch das Kultivieren von Wirtszellen
(die Zellen umfassen können,
die tatsächlich
transformiert wurden, wenngleich es wahrscheinlicher ist, dass die
Zellen von den transformierten Zellen abstammen) unter Bedingungen
zur Expression des Gens, so dass das Polypeptid, für das kodiert
wird, produziert wird. Wenn das Polypeptid an ein geeignetes Signal-Leader-Peptid
gebunden exprimiert wird, kann es aus der Zelle in das Nährmedium
sekretiert werden. Nach der Herstellung mittels Expression kann
ein Polypeptid je nachdem aus der Wirtszelle und/oder dem Nährmedium
isoliert und/oder gereinigt werden und anschließend wunschgemäß eingesetzt
werden, z. B. zur Formulierung einer Zusammensetzung, die eine oder
mehrere zusätzliche
Komponenten enthalten kann, wie z. B. eine pharmazeutische Zusammensetzung,
die ein/einen oder mehrere pharmazeutisch annehmbare Exzipienten,
Vehikel oder Träger
umfasst.
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Antikörper
-
In
alternativen Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung können
Antikörper
erforderlich sein, die in der Lage sind, das mit einer akuten Abstoßung in
Zusammenhang stehende Protein zu binden, z. B. für den Einsatz in Tests zur
Bestimmung des Vorhandenseins oder der Menge eines bestimmten Proteins
in einer Probe oder für
den therapeutischen Einsatz zur Reduktion der schädlichen
Wirkung eines Proteins in vivo. Die vorliegende Erfindung stellt
demnach die Herstellung von Antikörpern, die die Eigenschaft
aufweisen, spezifisch an die hierin identifizierten Markerproteine
zu binden, oder von Fragmenten oder aktiven Abschnitten davon bereit.
-
Die
Herstellung von monoklonalen Antikörpern ist auf dem Gebiet der
Erfindung bekannt. Monoklonale Antikörper können den Verfahren der DNA-Rekombinationstechnologie
unterzogen werden, um andere Antikörper oder chimäre Moleküle zu erzeugen,
die weiterhin die Spezifität
des ursprünglichen
Antikörpers
aufweisen. Solche Verfahren können
das Einführen
von DNA, die für
die variable Region eines Immunglobulins oder die komplementaritätsbestimmenden
Bereiche (CDR) eines Anti körpers
kodiert, in konstante Regionen oder konstante Regionen und Gerüstregionen
eines anderen Immunglobulins umfassen. Siehe beispielsweise
EP 0 184 187 A ,
GB 2 188 638 A oder
EP 0 239 400 A .
Ein Hybridom, das einen monoklonalen Antikörper erzeugt, kann einer genetischen
Mutation oder anderen Veränderungen
unterzogen werden, die die Bindungsspezifität der erzeugten Antikörper verändern können oder
nicht.
-
Diese
Antikörper
können
in dem Sinn spezifisch sein, dass sie in der Lage sind, zwischen
dem Polypeptid, das sie binden können,
und anderen menschlichen Polypeptiden, für die sie keine oder im Wesentlichen
keine Bindungsaffinität
(z. B. eine mehr als 103-, noch bevorzugter
von 104- und noch bevorzugter 105-mal bessere Bindungsaffinität als für nicht
verwandte Moleküle)
aufweisen, zu unterscheiden. Spezifische Antikörper binden ein Epitop an dem
Molekül,
das an anderen Molekülen
entweder nicht vorhanden oder nicht zugänglich ist. Antikörper sind
auch nützlich
zur Reinigung des Polypeptids oder der Polypeptide, an die sie binden,
z. B. nach der Produktion durch eine rekombinante Expression ausgehend
von der kodierenden Nucleinsäure.
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Bevorzugte
Antikörper
gemäß der vorliegenden
Erfindung sind in dem Sinn isoliert, dass sie frei von Verunreinigungen,
wie z. B. Antikörpern,
die in der Lage sind, andere Polypeptide zu binden, und/oder frei
von Serumkomponenten sind. Monoklonale Antikörper sind für manche Zwecke zu bevorzugen,
wobei polyklonale Antikörper
jedoch auch Teil des Umfangs der vorliegenden Erfindung sind.
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Antikörper können unter
Einsatz von Verfahren erhalten werden, die zum Standard auf dem
Gebiet der Erfindung gehören.
Verfahren zur Herstellung von Antikörpern umfassen das Immunisieren
eines Säugetiers (z.
B. Maus, Ratte, Kaninchen, Pferd, Ziege, Schaf oder Affe) mit dem
Protein oder einem Fragment davon. Antikörper können aus den immunisierten
Tieren unter Einsatz verschiedener Verfahren, die auf dem Gebiet der
Erfindung bekannt sind, erhalten und, vorzugsweise durch die Bindung
des Antikörpers
an das Antigen von Interesse, gescreent werden. Beispielsweise können Western-Blotting-Verfahren
oder Immunausfällung
eingesetzt werden (Armitage et al., Nature 357, 80–82 (1992)).
Das Isolieren von Antikörpern
und/oder Antikörper-erzeugenden
Zellen aus einem Tier kann mit dem Schritt des Tötens des Tiers einhergehen.
-
Als
Alternative oder Ergänzung
zur Immunisierung eines Säugetiers
mit einem Peptid kann ein für
ein Protein spezifischer Antikörper
aus einer auf rekombinante Weise erzeugten Bibliothek exprimierter
variabler Immunglobulinregionen erhalten werden, z. B. unter Einsatz
von λ-Bakteriophagen
oder filamentösen
Bakteriophagen, die funktionelle Immunglobulinbindungsregionen auf
ihrer Oberfläche
aufweisen, siehe z. B.
WO92/01047 .
Die Bibliothek kann naiv sein, d. h. aus Sequenzen konstruiert,
die aus einem Organismus erhalten wurden, der nicht mit einem der
Proteine (oder der Fragmente) immunisiert wurde, oder sie kann unter Einsatz
von Sequenzen konstruiert sein, die aus einem Organismus erhalten
werden, der dem Antigen von Interesse ausgesetzt wurde.
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Antikörper gemäß der vorliegenden
Erfindung können
auf verschiedene Weisen modifiziert werden. Die Bezeichnung „Antikörper" sollte so ausgelegt
werden, dass sie sich auf eine beliebige Bindungssubstanz mit einer
Bindungsdomäne
mit der erforderlichen Spezifität
bezieht. Demnach umfasst die Erfindung Antikörperfragmente, Derivate, funktionelle Äquivalente
und Homologe von Antikörpern,
einschließlich
synthetischer Moleküle
und Moleküle,
deren Form jene eines Antikörpers
nachahmt, was sie in die Lage versetzt, ein Antigen oder Epitop
zu binden.
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Hybridome,
die in der Lage sind, Antikörper
mit den gewünschten
Bindungseigenschaften zu produzieren, sind wie eukaryotische oder
prokaryotische Wirtszellen, die Nucleinsäure enthalten, die für Antikörper (einschließlich Antikörperfragmente)
kodiert, und in der Lage sind, die Antikörper zu exprimieren, Teil des
Umfangs der vorliegenden Erfindung. Die Erfindung stellt auch Verfahren
zur Herstellung von Antikörpern
bereit, einschließlich
das Züchten
einer Zelle, die in der Lage ist, den Antikörper zu produzieren, unter
Bedingungen, unter denen der Antikörper produziert und vorzugsweise
sekretiert wird.
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Antikörper zur
Verwendung als Bindungs- oder Entwicklungsmittel in den hierin beschriebenen
Tests können
markiert werden. Das Markieren mit einzelnen Reportermolekülen stellt
dabei eine Möglichkeit
dar. Die Reportermoleküle
können
direkt oder indirekt detektierbare und vorzugsweise messbare Signale
erzeugen. Die Bindung von Reportermolekülen kann direkt oder indirekt,
kovalent, z. B. über
eine Peptidbindung, oder nicht-kovalent erfolgen. Die Bindung über eine
Peptidbindung kann das Ergebnis der rekombinanten Expression einer
Genfusion sein, die für
den Antikörper
und das Reportermolekül
kodiert. Eine bevorzugte Form besteht in der kovalenten Bindung
jedes Antikörpers
mit einem einzelnen Fluorochrom, Phosphor- oder Laserfarbstoff mit
spektral isolierten Absorptions- oder Emissionseigenschaften. Geeignete
Fluorochrome umfassen Fluorescein, Rhodamin, Phycoerythrin und Texas
Red. Geeignete chromogene Farbstoffe umfassen Diaminobenzidin. Weitere
Reporter umfassen makromolekulare Kolloidteilchen oder teilchenförmiges Material,
wie z. B. Latexperlen, die gefärbte,
magnetische oder paramagnetische und biologisch oder chemisch aktive
Stoffe darstellen, die direkt oder indirekt detektierbare Signale
hervorrufen können,
die durch eine Sichtprüfung
zu beobachten, elektronisch detektierbar sind oder auf andere Weise
aufgezeichnet werden können.
Bei diesen Molekülen
kann es sich um Enzyme handeln, die Reaktionen katalysieren, die
beispielsweise zu einer Farbentstehung oder -veränderung oder zu Veränderungen
der elektrischen Eigenschaften führen.
Diese Moleküle
können
molekular anregbar sein, so dass die elektronischen Übergänge zwischen
Energiezuständen
zu charakteristischen spektralen Absorptionen oder Emissionen führen. Sie
können
chemische Einheiten umfassen, die in Verbindung mit Biosensoren
eingesetzt werden. Detektionssysteme mit Biotin/Avidin oder Biotin/Streptavidin
und alkalischer Phosphatase können
eingesetzt werden. Weitere Verfahren, die zur Markierung von Antikörpern eingesetzt
werden können,
umfassen das Markieren, beispielsweise mit einer Nucleotidsequenz,
die mittels PCR amplifiziert werden kann.
-
Die
Art, auf die die Bindung bestimmt wird, ist nicht Teil der vorliegenden
Erfindung, und Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung sind in der
Lage, gemäß ihren
Vorlieben und ihrem allgemeinen Wissen eine geeignete Form auszuwählen.
-
Antikörper gemäß der vorliegenden
Erfindung können
für das
Screenen in Bezug auf das Vorhandensein eines Polypeptids, beispielsweise
in einer Testprobe, die, wie erläutert,
Zellen oder ein Zelllysat enthält,
eingesetzt werden und können
zum Reinigen und/oder Isolieren eines Polypeptids gemäß der vorliegenden
Erfindung eingesetzt werden, beispielsweise nach der Herstellung
des Polypeptids durch die Expression durch eine Nucleinsäure, die
für dieses
kodiert. Antikörper
können
die Aktivität
des Polypeptids, an das sie binden, verändern und können demnach, wenn dieses Polypeptid
in einem Individuum eine schädigende
Wirkung hat, in einem therapeutischen Zusammenhang (der die Prophylaxe
einschließen
kann) nützlich
sein.
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Ein
Antikörper
kann in einem Set bereitgestellt werden, das Anweisungen für die Verwendung
des Antikörpers
umfassen kann, z. B. zur Bestimmung des Vorhandenseins einer bestimmten
Substanz in einer Testprobe. Ein oder mehrere andere Reagenzien
können
ebenfalls Teil des Sets sein, wie z. B. Markierungsmoleküle, Pufferlösungen,
Elutionsmittel usw. Die Reagenzien können in Behältern bereitgestellt werden,
die sie vor ihrem Außenumfeld
schützen,
wie z. B. in verschlossenen Glasfläschchen.
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Experimenteller Teil
-
Die
folgenden Untersuchungen von akuten Abstoßungen nach Herztransplantationen
wurden herangezogen, um potentielle Marker für die Diagnose und/oder Prognose
einer akuten Abstoßung
zu identifizieren.
-
Patienten und Endomyokardbiopsieproben
-
Diese
Untersuchungen wurden mit der Genehmigung durch den Ethikausschuss
an Patienten durchgeführt,
bei denen eine Herztransplantation im Harefield-Hospital vorgenommen
worden war. Sequenzielle Endomyokardbiopsien wurden einer Gruppe
von 20 Patienten in den ersten 4 Monaten nach der Transplantation entnommen,
wobei in diesem Zeitraum gewöhnlicherweise
acht Biopsieproben entnommen wurden. Es wurden auch Serumproben
entnommen und für
die spätere
Bewertung der Marker für
eine akute Abstoßung
mittels eines Immuntests gelagert. Eine Probe jeder Gewebebiopsie
wurde unmittelbar in flüssigem
Stickstoff gefroren, während
eine zweite Probe 20 h lang in Gegenwart von [35S]-Methionin
inkubiert wurde, um jene Proteine, die neu synthetisiert wurden,
mit einer Radiomarkierung zu versehen. Die radiomarkierten Proteine
wurden unmittelbar mittels 2D-Analyse unter Einsatz von IPG 3–10 NL (um
die meisten, einschließlich
basische Proteine abzutrennen) und IPG 4–7 (um saure bis neutrale Proteine
abzutrennen) pH-Gradienten für
die erste IEF-Dimension abgetrennt. Die gefrorenen Biopsien wurden
für mögliche zukünftige Untersuchungen
von Markern für
akute Abstoßungen
gelagert. Quantitative Veränderungen
in Bezug auf die Proteinsynthese unter Einsatz der mit [35-S]-Met radiomarkierten Gele wurden unter
Einsatz des PDQuest-Softwaresystems (Bio-Rad) analysiert.
-
Computeranalyse von 2D-Profilen von radiomarkierten
Proteinen aus Herzbiopsien
-
Dann
wurde eine Computeranalyse der 2D-Profile der mit [35S]-Met
radiomarkierten Proteine für
Patienten mit einem vollständigen
4-Monatssatz von Biopsieproben unter Einsatz von IPG 3–10 NL pH-Gradienten für die erste
IEF-Dimension durchgeführt,
und Tabelle 1 fasst die Ergebnisse dieser Analyse für vier der
an der Studie teilnehmenden Patienten zusammen.
-
Für alle Proben
wurden unter Einsatz von IPG 4–7
L pH-Gradienten für
die erste IEF-Dimension
auch 2D-Trennungen durchgeführt.
Dadurch wurde im Vergleich mit den oben beschriebenen IPG 3–10 NL pH-Gradienten
(die eine umfassende Übersicht über die
Probeproteine liefern und auch eine Analyse der basischen Proteine
ermöglichen)
eine verbesserte Trennung der sauren bis neutralen Proteine erhalten.
Eine Computeranalyse dieser Serie von 2D-Proteinprofilen wurde eingesetzt,
um zusätzliche
potentielle Marker für
eine Abstoßung
zu finden.
-
Chemische Charakterisierung
potentieller Marker für
eine Abstoßung
-
Wie
oben beschrieben hob die Computeranalyse Herzproteine hervor, die
potentielle Marker für
eine akute Abstoßung
darstellen. Die besten Kandidaten für diagnostische/prognostische
nicht-invasive Marker (d. h. die im Blut detektierbar sind) sind
jene Proteine, deren Spiegel in Zusammenhang mit einer Abstoßung ansteigen.
Besonderer Wert wurde auf die chemische Charakterisierung dieser
Proteine gelegt, damit das Verfahren zur Entwicklung von ELISA-Tests
zur Bestimmung, ob diese Proteine im Serum von Patienten, bei denen
eine akute Abstoßung
vorliegt, detektiert werden kann, in Gang gesetzt werden kann. Bisher
wurden 50 Protein-Spots aus den 2D-Gelen einer Proteincharakterisierung
unter Einsatz einer Kombination von Peptid-Massenfingerprinting
mittels MALDI-MS und Proteinsequenzieren mittels ESI-MS/MS zur Charakterisierung
dieser Proteine unterzogen. Bisher liegen für 13 Proteine definitive Identifikationen
vor (1, Tabelle 2).
-
Detektion von Anti-Herz-Antikörper-reaktiven
Proteinen
-
Ein
komplementärer
Ansatz wurde dann eingesetzt, um potentielle Marker für akute
Abstoßungen
zu detektieren und zu identifizieren. Durch die folgenden Experimente
wurde das Serum und menschliches Herzgewebe aus dem linken Ventrikel
eines Patienten, der ein Transplantat erhalten hatte, in Bezug auf
potentielle Marker für
die Abstoßung
von Herztransplantaten untersucht. In diesen Versuchen wurde die
Wirksamkeit eines modifizierten Serumsolubilisierungspuffers untersucht,
und Serum von transplantierten Patienten wurde eingesetzt, um Anti-Herz-Antikörper (d.
h. Anti-Herzprotein-Antikörper), die
durch die Herztransplantationspatienten erzeugt wurden, zu detektieren
und Herzproteine im Serum der transplantierten Patienten zu detektieren.
-
Das
Vorhandensein von Anti-Herz-Antikörpern wurde durch das Sondieren
von Western-Blots von mittels 1D-SDS-PAGE abgetrennten menschlichen
Herzproteinen aus dem linken Ventrikel mit dem Serum des transplantierten
Patienten bewiesen. Serum von Abstoßungen vom Grad 3A (histologisch
bestätigt)
von zwei Patienten wurde verwendet, und das Vorhandensein von Antikörpern vom
IgM- und IgG-Typ wurde untersucht. Banden von einem nicht geblotteten
(CBBR-gefärbten)
1D-Gel aus menschlichen Herzproteinen aus dem linken Ventrikel,
die immunreaktiven Banden von Interesse auf den Western-Blots entsprachen,
wurden exzidiert und einer Massenspektrometrie unterzogen, um potentielle
Antigene zu identifizieren. Jede Proteinbande wurde unter Verwendung
von Trypsin enzymatisch verdaut. Die auf diese Weise erzeugte Peptidsammlung
wurde mittels Umkehrphasenchromatographie unter Verwendung einer
75-μm-ID-Picofrit-Säule getrennt
und direkt in die an einem Q-Tof-Massenspektrometer
angebrachte Elektrosprayionisations-(ESI-)Quelle eluiert. Das Q-Tof-Massenspektrometer
wurde auf datenabhängige
Weise betätigt,
wobei das Instrument so eingestellt wurde, dass es für jedes
eluierende Peptid, das in den Kontrollscans vorhanden ist, MS/MS-Spektren
erlangt. Die vollständigen
MS/MS-Datensätze für jede Bande
wurden dem MASCOT-Algorithmus (von Matrix Science Ltd. erworben)
für Datenbanksuchen
zur Identifizierung des vorhandenen Proteins/der vorhandenen Proteine unterzogen.
Es wurde festgestellt, dass mehrere 1D-Banden auf Western-Blots bei beiden
Patienten immunreaktiv waren (sowohl IgM als auch IgG). Die Analyse
der entsprechenden Banden auf dem Gel mittels Massenspektrometrie
stellte die Identität
mehrerer in jeder Bande vorhandenen Proteine bereit. Diese Experimente zeigten
insbesondere drei Proteine, die auf eine Abstoßung reagierten und in Tabelle
2 detailliert aufgelistet sind: α-Crystallin-b-Kette
(SWISS-PROT P02511), Tropomyosin-α-Kette
(SWISS-PROT P09443), Myosin-Leichtkette-1
(SWISS-PROT P08590).
-
Entwicklung von Immuntests
-
Mono-
und/oder polyklonale Antikörper,
die für
die oben durch die Proteomanalyse identifizierten potentiellen Marker
für akute
Abstoßungen
spezifisch sind, wurden in empfindlichen ELISA-Immuntests verwendet,
um zu ermitteln, ob diese Proteine im Plasma von transplantierten
Patienten detektiert werden können. Diese
Proteine stellen dann potentielle Kandidaten für die Verwendung für nicht-invasive
diagnostische und/oder prognostische Tests für akute Abstoßungen nach
einer Herztransplantation dar.
-
Monoklonale
und polyklonale Antikörper,
die für
Tropomyosin, α-Crystallin-B-Kette
und Myosin-Leichtkette I spezifisch sind, wurden auf Protein-G-
und Protein-A-Säulen gereinigt
und in der Folge unter Einsatz von Centricon-Filtern konzentriert.
Die gereinigten Antikörper
wurden dann verwendet, um die kompetitiven ELISA-Tests zur Detektion dieser Proteine
im Serum von Herztransplantationspatienten zu entwickeln. Es wurde
festgestellt, dass die Empfindlichkeit dieser Tests durch die Anpassung
des ELISA-Tests in Kombination mit einem Chemilumineszenzdetektionssystem
signifikant anstieg. Die Tests weisen derzeit eine Empfindlichkeit von
annähernd
1 ng/ml auf.
-
Die
ELISA-Tests wurden eingesetzt, um sequenzielle Serumproben von REMAP-Patienten zu testen, um
zu ermitteln, ob diese Antigene (Tropomyosin, α-Crystallin-B-Kette und Myosin-Leichtkette I) nützliche nicht-invasive
Marker für
akute Abstoßungen
darstellen. Für
die α-Crystallin-B-Ketten-
bzw. Tropomyosin-Tests sind erste Beispiele für die Ergebnisse in 2 bzw. 3 angeführt. In
beiden Fällen
können
die Proteine von Interesse im Serum der Patienten bald nach der
Transplantation detektiert werden. Die Serumspiegel der Proteine
sind zu bestimmten Zeitpunkten erhöht, und es bestehen Hinweise
darauf, dass diese gesteigerten Spiegel mit Episoden akuter Abstoßungen in
Zusammenhang stehen.
-
Zusammenfassend
sind die von den Erfindern entwickelten ELISA-Tests in der Lage,
Antigene von Interesse im Serum von Patienten nach einer Herztransplantation
zu detektieren, und erste Daten weisen darauf hin, dass ein Zusammenhang
zwischen gesteigerten Serumspiegeln dieser Proteine und dem Auftreten
von Episoden akuter Abstoßungen
bestehen könnte.
Tabelle 2 Identitäten von potentiellen Markern
für akute
Abstoßungen
(siehe Fig. 1)
| SPOT Nr. | PROTEINNAME | SWISS-PROT ZUGANGSNR. | SWISS-PROT IDENTITÄT | EXPRESSION WÄHREND GERINGFÜGIGER AKUTER
ABSTOSSUNG |
| 1 | Myosin-Regulationsleichtkette
2, Ventrikel-/Herz-Isoform
(MLC2) | P
10916 | MLRV_HUMAN | 3facher
Anstieg
3facher Rückgang |
| 2 | Tropomyosin-α-Kette (TPM1)
(Fragment) | P09493 | TPM1_HUMAN | 3facher
Anstieg
3facher Rückgang |
| 3 | Troponin
C, langsamer Skelett- und Herzmuskel | P02590 | TPCC_HUMAN | 3facher
Anstieg
3facher Rückgang |
| 4 | Actin, α-Herz (Fragment) | P04270 | ACTC_HUMAN | 3facher
Anstieg |
| 5 | Actin, α-Herz (Fragment) | P04270 | ACTC_HUMAN | 3facher
Anstieg |
| 6 | Hitzeschockprotein
27 kDa (HSP27) | P04792 | HS27_HUMAN | 3facher
Anstieg |
| 7 | Myoglobin | P02144 | MYG_HUMAN | 3facher
Rückgang |
| 8 | Peroxisomale
Enoyl-CoA-Hydratase | Q13011 | ECH1_HUMAN | 3facher
Rückgang |
| 9 | Nicht
identifiziert | - | - | 3facher
Rückgang |
| 10 | Nicht
identifiziert | - | - | 3facher
Rückgang |
| 11 | Tropomyosin-α-Kette (TPM1) | P09443 | TMP1-HUMAN | 3facher
Anstieg |
| 12 | α-Crystallin-B-Kette | P02511 | CRAB_HUMAN | 3facher
Anstieg |
| 13 | Myosin-Leichtkette
1, Ventrikelisoform (MLC1) | P08590 | MLEV_HUMAN | 3facher
Rückgang |
-
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