DE3003301A1

DE3003301A1 - Verfahren zur bestimmung von mit tumoren vorkommenden glykolbindungen enthaltende substanzen und testmittel zur durchfuehrung des verfahrens

Info

Publication number: DE3003301A1
Application number: DE19803003301
Authority: DE
Inventors: Masakazu Adachi
Original assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1979-01-30
Filing date: 1980-01-30
Publication date: 1980-07-31
Also published as: ES488747A0; IT8047743A0; US4389392A; DE3003301C2; IT8047743A1; SE451508B; NL8000536A; IT1165552B; SE8000705L; FR2461256B1; FR2461256A1; DK36980A; ES8102679A1; GB2043890A; CH645728A5; GB2043890B

Description

Die Erfindung betrifft den Nachweis der Menge von tumorassoziierten Glykolbindungenen enthaltenden Substanzen, z.B. zuckerähnlichen Substanzen, einschliesslich Glykoproteinen, Glykopeptiden, Glykclipiden und Zuckern (nachfolgend TAG genannt) in Körperflüssigkeitsproben von Säugern und insbesondere von solchen TAG, die in Form von indifferenten Zellen sich vermehren, insbesondere Tumoroder Krebszellenwucherungen. Die Erfindung betrifft auch

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die Diagnose von Krebs, bezogen auf solche Untersuchungen.

Die Bestimmung der Menge von spezifischen Glykoproteineri in Körperflüssigkeitsproben von Krebskranken ist bekannt. Bei diesem Verfahren macht man von der Antigenität hauptsächlich des Proteinteils von Glykoproteinen Gebrauch. Zum Beispiel bestimmt man cO -Foetoproteinmengen und die Mengen an karzinoembryonalem Antigen (nachfolgend als VEA bezeichnet) zur Bestimmung von primären Häpatomen und von Krebs der Verdauungsorgane, insbesondere Rektunkrebs und dergleichen (siehe Igaku no Ayumi, Bd. 106, Nr. 5, Fifth Saturday Special Issue. S. 235-250 (1978)). Diese Verfahren sind jedoch nicht befriedigend, weil sie nur für bestimmte Krebs- und Tumortypen anwendbar sind.

Andererseits ist bisher keine Diagnosemethode bekannt, bei welcher man Bindungsspezifität von Zuckerresten an TAG anwendet.

Es besteht seit langem ein Bedürfnis nach einer einfachen billigen, quantitativen Methode zur Bestimmung von TAG-Niveaus in Körperflüssigkeiten, die auf einem weiten Gebiet angewendet werden kann.

Unter Berücksichtigung der Tatsache, dass in den Körperflüssigkeiten von Individien oder Patienten, die unter Krebs leiden, TAG vorhanden ist, das durch indifferente Zellen (hauptsächlich Krebszellen) gebildet wird und in die Körperflüssigkeit abgegeben wird, und dass TAG sich hinsichtlich der chemischen Struktur der Zuckerkette, der Länge und der Zusammensetzung des Zuckerrestes grundlegend von Glykolbindungen enthaltenden Substanzen unterscheidet,

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ÖR/GfNAl

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die durch differenzierbare Zellen (hauptsächlich normale Zellen) gebildet und in die Körperflüssigkeit abgegeben, werden, sind gründliche Untersuchungen durchgeführt worden, die zur Entdeckung führten, dass TAG eine Galactose-(BI-* 3 oder ß1 -^- 4) -N-acetylglucosamin-Endgruppe aufweist und sich spezifisch mit-Lectinen bindet, und dass das TAG-Niveau in einer Körperflüssigkeitsprobe dadurch bestimmt werden kann, dass man TAG mit einem Lectin urasetzt. Das TAG-Niveau zeigt die Anwesenheit oder Abwesenheit von Krebszellen, den Grad der Wucherung und den Anstieg oder Abfall davon an und ermöglicht eine erfolgreiche Diagnose verschiedener Krebs- oder Tumorarten. Die vorliegende Erfindung baut auf dieser Entdeckung auf.

Die Erfindung stellt ein Verfahren zum Nachweis von TAG-Niveaus in einer Körperflüssigkeitsprobe zur Verfügung, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man TAG in einer Körperflüssigkeitsprobe mit einem Lectin unter Bildung eines TAG-Lectin-Komplexes umsetzt und dass man die Menge des TAG-Lectin-Komplexes oder an nicht-umgesetztem Lectin misst. Die Erfindung betrifft auch einen Diagnoseset zur Anwendung dieser Methode.

Fig. 1 ist eine grafische Darstellung der Menge an TAG, bestimmt gemäss Beispiel 1, und

Fig. 2 ist eine grafische Darstellung der TAG-Menge, bestimmt gemäss Beispiel 2.

Für die vorliegende Erfindung können verschiedene Körperflüssigkeiten verwendet werden. Geeignete Körperflüssigkeinen sind z.B. Blut, Gewebeflüssigkeiten, Lymphe, Hydrotorax, Ascites, amniotische Flüssigkeiten, Magensaft, Urin, Pankreassaft, cerebrospinale Flüssigkeiten, Speichel und dergleichen. Besonders bevorzugt, insbesondere in Form

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von Serum oder Plasma, ist Blut.

Die Menge der für die Proben verwendete Körperflüssigkeit liegt im allgemeinen bei 1 bis etwa 10 ml, vorzugsweise 2 bis 5 ml.

Erfindungsgemäss kann die Bestimmung von TAG-Niveaus in einer Körperflüssigkeitsprobe entweder dadurch durchgeführt werden, dass man TAG entweder isoliert oder abtrennt aus der Körperflüssigkeit durch Umsetzung desselben mit einem Lectin unter Bildung eines TAG-Lectin-Komplexes, und dass man die Menge des TAG-Lectin-Komplexes oder an nicht-umgesetztem Lectin nach dessen Abtrennung misst, oder indem man ein markiertes Lectin direkt einer Körperflüssigkeitsprobe zugibt unter Bildung eines markierten TAG-Lectin-Komplexes, worauf man den markierten TAG-Lectin-Komplex oder das nicht-umgesetzte markierte Lectin abtrennt und dessen Menge bestimmt.

Zum Abtrennen der TAG-Fraktion aus der Körperflüssigkeitsprobe können übliche Extraktions- oder Trennverfahren für Glykolbindungen enthaltende Substanzen angewendet werden, z.B. Aussalzen, Ausfällen, Lösungsmittelextraktion, Zentrifugieren, Dialyse, Molekularsiebe, enzymatische Inaktivierung und dergleichen, oder eine Kombination von einem oder mehreren dieser Verfahren. Zum Beispiel kann man eine TAG-Fraktion durch Zugabe einer die Ausfällung oder die Denaturierung bewirkenden Menge von Sulfosalicylsäure, Trichloressigsäure oder Zinksulfat zu Blutserum oder -plasma oder durch Erhitzen von Blutserum oder -plasma unter Ausfällung von Albumin, Immunoglobulin und dergleichen gewinnen, worauf man die ausgefällten Proteine durch Filtrieren

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abtrennt und das Filtrat dialysiert.

Wendet man ein markiertes Lectin an, so können Körperflüssigkeiten, diemicht Blut sind, gesammelt und als Testprobe (nachfolgend als Probe bezeichnet) verwendet werden. Vorzugsweise gibt man jedoch ein Protein mit einem niedrigen Zuckergehalt, wie Rinderserumalbumin (BSA) und dergleichen als Schutzprotein zu, um eine Denaturierung der Probe zu vermeiden und gleichzeitig die Umsetzung mit Lectin zu beschleunigen. Insbesondere gibt man vorzugsweise eine ausreichende Menge des Schutzproteins zu der Probe, nachdem man Albumine, Immunoglobuline und dergleichen aus der Probe entfernt hat, weil dies die Bestimmung unter kontrollierteren Bedingungen ermöglicht.

Bei der Verwendung von Blutproben kann man als Probe Blutserum, das durch übliche Blutserum-Sammelmethoden gewonnen wurde, oder Blutplasma, das durch übliche Blutplasma-Sammelmethoden gewonnen wurde, unter Verwendung eines AntikoagulationsmittelSf wie Häparin, EDTA, Zitronensäure und dergleichen, wobei man vorzugsweise Blutplasma, das unter Verwendung von Häparin als Antikoagulationsmittel gesammelt wurde, verwendet. Die Proben können gegebenenfalls, sofern erwünscht, mit Wasser oder geeigneten wässrigen Pufferlösungen verdünnt werden, z.B. in solchen Fällen, in denen das TAG-Niveau verhältnismässig hoch ist, wie in Asciten und dergleichen.

Erfindungsgemäss können solche Lectine, die sich spezifisch mit Galactose-(ß1- 3 oder ß1- 4)-N-acetylglucosamin, beschrieben in J.B.C, 250, 8518-8523 (1975); Biochem. Biophys. Res. Conim. ^2, 144 (1975); Z. Immunitaetsforch. , 138, 423-433 (1969);Br. J. Exp. Pathol. -T7, 228-236 (1946); Proc.

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Natl. Acad. Sei. USA, ]5_, Nr. 5, S. 2215-2219 (1978); Biochemistry J_3, 196-204 (1974); etc., z.B. Ernudsslectin, Ricinuslectin und dergleichen, verwendet werden.

Substanzen, die zum Markieren der Lectine verwendet werden können, um sie dadurch durch Radiometrie, Fluorimetrie, Colorimetrie und dergleichen nachweisbar zu machen, sind Enzyme, fluoreszierende Substanzen und radioaktive Substanzen. Geeignete Enzyme sind z.B. Glukoamylase, Glukoseoxidase, Peroxidase, Alkaliphosphatase, Hämoctapeptide und dergleichen und deren aktive Fragmente. Beispiele für geeignete fluoreszierende Substanzen sind Fluoreszein, Fluoreszeinisothiocyanat, Rhodamin, Dansylchlorid (d.h. 5-Dimethylamino-1-naphthalinsulfonylchlorid) und dergleichen. Beispiele für geeignete radioaktive Substanzen sind radioaktives Jod, Tritium und dergleichen. Um Lectine mit den vorerwähnten Markierungssubstanzen zu markieren, können alle üblichen Methoden zum Markieren von Proteinen, wie Antigenen und Antikörpern, mit Enzymen, Fluoreszierungsmittel und radioaktive Substanzen verwendet werden. Beispielsweise kann man Lectine mit radioaktiven Isotopen nach dem von Kazuo Shizunome und Yuichi Kumahara beschriebenen Verfahren: "Radioimmunoassay", S. 45-56 (1978), veröffentlicht von der Asakura Publishing Co., Tokyo, markieren.

Beim erfindungsgemässen Verfahren werden markierte oder unmarkierte Lectine vorzugsweise in Mischung mit geeigneten Lösungsmitteln verwendet. Alle Lösungsmittel, welche markierte oder nicht-markierte Lectine nicht denaturieren, z.B. physiologische Kochsalzlösung, Wasser, 0,1 m Tris-HCl-PufferlÖsung (pH etwa 7,5), 0,1 m Phosphatpufferlösung

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(pH etwa 7,4) , Minnen verwendet werden. Die Menge des in dem Lösungsmittel oder Verdünnungsmittel enthaltenen Lectins kann je nach den Agglutinationswerten (die durch die End- oder Maximalverdünnung von Serien-zweifachverdünnten -Proben definiert wird),der Art der Markierung oder der nachzuweisenden Substanzen gewählt werden und liegt im allgemeinen bei etwa 0,01 bis etwa 100 ug/ml , vorzugsweise 0,03 bis 40ug/ml. Die vorerwähnten markierten oder unmarkierten Lectinlösungen können weiter verdünnt werden.

Zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens wird eine vorbestimmte Menge einer TAG-Fraktion oder einer Körperflüssigkeit per se mit einer gegebenen Menge des Lectins oder des markierten Lectins vermischt und die erhaltene Mischung lässt man bei etwa 45°C oder darunter, vorzugsweise etwa 4 bis 40 C und insbesondere detwa 20 bis 40⁰C, zum Reagieren stehen. Der TAG-nicht-markiertes oder -markiertes-Lectin-Komplex oder das nicht-umgesetzte nicht-markierte oder markierte Lectin können von dem Reaktionsgemisch in üblicher Weise abgetrennt werden, z.B. chromatografisch, elektrophoretisch, durch Aussalzen, durch Fraktionieren, Dialyse, Gelfiltration oder durch Absorption oder durch eine Kombination dieser Trennverfahren, oder mittels einer Trennmethode unter Anwendung von Agargel, Agarosegel oder Polyacrylamidgel.

Zur Abtrennung des nicht-umgesetzten markierten oder unmarkierten Lectins aus dem Reaktionsgemisch wird eine geeignete Menge des Fällungsmittels für den TAG-Lectin-Komplex zu der obigen Reaktionsmischung zugegeben und der entstandene Komplex kann z.B.durch Zentrifugieren

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abgetrennt werden, wobei man die nicht-umgesetzte markierte oder nicht-markierte Lectinfraktion als überstehende Flüssigkeit erhält. Typische Ausfällmittel sind PoIyäthylenglykol, Ammoniumsulfat (bis zur Sättigung), Rivanol (Acrinol) und dergleichen. Die Zentrifugierbedingungen können je nach der Art des verwendeten Ausfällmittels gewählt werden. Wird z.B. Polyäthylenglykol als Fällungsmittel verwendet, so wird die Zentrifugierung vorzugsweise bei etwa 1000 G etwa 30 bis 60 Minuten durchgeführt.

In den Fällen, in denen der TAG-markiertes oder unmarkiertes Lectin-Komplex von dem nicht-umgesetzten Lectin abgetrennt wird, erfolgt die Abtrennung des Komplexes von dem nichtumgesetzten Lectin einfach, indem man von dem Unterschied in der Diffusionsgeschwindigkeit des Komplexes und dem nichtumgesetzten Lectin in Agargel, Agarosegel oder Polyacrylamidgel Gebrauch macht. Gibt man die Reaktionsmischung zu einem Gel in einem Gefäss, so diffundiert nicht-umgesetztes Lectin in das Gel, während der TAG-Lectin-Komplex auf dem Gel verbleibt, d.h. ausserhalb des Gels, ohne dass er eindiffundiert. Deshalb können beide voneinander in üblicher Weise einfach getrennt werden. Hinsichtlich der Zubereitung der Gele liegen keine Beschränkungen vor und die üblichen Verfahren können für diesen Zweck angev/endet werden. z.B. kann man eine bestimmte Menge Agar, Agarose oder Polyacrylamid zu einem Verdünnungsmittel, welches die Proteine nicht denaturiert, geben, beispielsweise destilliertes Wasser, Zitrat oder Tris-HCl-Pufferlösung (pH etwa 7,5) und anschliessend unter schwachem Rühren auf 60 bis 80OC zum Zwecke der Auflösung erwärmen und dann die Lösung in ein geeignetes Gefäss, wie ein Reagenzglas, giessen und dort abkühlen lassen, wobei sie wie Gelee erstarrt. Man

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wählt die Konzentration des Gels in Abhängigkeit von der Dimension (d.h. dem Molekulargewicht, der Stereostruktur und dergleichen) der Markierungssubstanz und des TAG-markiertes Lectin-Komplexes. Erfindungsgemäss verwendet man im allgemeinen Gele von etwa 0,4 bis 2,0 Gew.%, vorzugsweise 0,7 bis 1,0 Gew.%. Erforderlichenfalls kann das gebildete Gel ein Konservierungsmittel enthalten. Die Oberfläche des so hergestellten Gels kann flach oder konkav sein, wobei man die letztere Form bevorzugt, weil die gebildeten Komplexe nicht an den Wandungen des Gefässes anhaften.

Die Menge an TAG-markiertem oder unmarkiertem-Lectin-Komplex oder an nicht-umgesetztem markierten oder unmarkierten Lectin, misst man in üblicher Weise und das TAG-Niveau in der Körperflüssigkeit kann man dann aus dem erhaltenen Wert berechnen.

Zum Messen der Menge an restlichem, nicht-markierten Lectin, sind verschiedene Methoden geeignet. Vorzugsweise gibt man jedoch zu den Proben eine Substanz, die in der Lage ist, mit dem Lectin spezifisch unter Agglutination oder Ausfällung zu reagieren, wobei man dann die Änderung visuell oder durch Messen mittels optischer Analyse, z.B. der optischen Dichte, beobachtet. Beispiele für geeignete lectinagglutinierende Substanzen sind Glykoproteine mit einer Galactose- (ß1 -* 3 oder ß1-> 4)-N-acetylglukosamin-Endgruppe, z.B. Kaninchenerythrocyten, Erythrociten von Neuraminidase-behandelten Schafen und dergleichen, sowie Sephadex, Glasperlen und dergleichen, die mit den vorerwähnten Glykoproteinen bedeckt sind.

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In der Praxis kann man das Verfahren in der nachfolgenden Weise anwenden. Die vorerwähnte Reaktionsmischung wird serienmässig mit jeweils zweifacher Verdünnung mit einem Verdünnungsmittel verdünnt, z.B. 0,15 m Phosphatpufferlösung, physiologische Kochsalzlösung und dergleichen, lind Aliquote der Verdünnung werden auf V- oder U-förmige Platten oder Objektträger oder kleine Reagenzgläser und dergleichen gegeben und jeder Aliquot wird mit einer Substanz, die fähig ist, das Lectin spezifisch unter Rühren zu agglutinieren, vermischt und die Platten oder anderen Träger, welche die Mischung enthalten, lässt man dann bei 45°C oder weniger, vorzugsweise 4 bis 40⁰C, während 30 Minuten oder mehr, vorzugsweise 60 bis 90 Minuten, stehen, um die End- oder MaximalVerdünnung, bei welcher eine Agglutination noch stattfindet, zu beobachten. Diese Maximalverdünnung wird als Agglutinationswert bezeichnet. Die bei der Erfindung verwendbaren Lectine weisen im wesentlichen den gleichen Agglutinationswert auf.

Bei der Verwendung von markierten Lectinen kann die Bestimmung des TAG-Niveaus vorgenommen werden, indem man markierte Substanzen für Lectine misst. Zum Beispiel kann man nach der Trennung von TAG-Lectin-Komplex und nichtreagiertem markierten Lectin voneinander die Menge des TAG-markierten Lectin-Komplexes oder nicht-umgesetztes marbiertes Lectin durch Auswahl eines geeigneten Substrates für ein Enzym bestimmen, welches colorimetrisch oder fluorimetrisch analysiert werden kann und dadurch die Aktivität des Enzyms bestimmen, wenn das Lectin damit markiert ist; indem man die Intensität oder Fluoreszenz bestimmmt, wenn das Lectin mit einer fluoreszierenden Substanz markiert ist, oder indem man die Radioaktivität

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bestimmt, wenn das Lectin mit einer radioaktiven Substanz markiert ist. Wird z.B. ein Enzym (wie Peroxidase) zum Markieren des Lectins verwendet, so wird eine vorbestimmte Menge des Reaktionsgemisches auf die Oberfläche des Gels in einem Reagenzglas getropft und dort bei etwa Raumtemperatur, vorzugsweise bei 4 bis 25°C, 1 bis 48 Stunden stehen gelassen. Dann gibt man eine gegebene Menge eines geeigneten Substrats für das Enzym (z.B. Wasserstoffperoxid) zu dem Reaktionsgemisch, bei dem durch diese Behandlung eine Enzymreaktion bewirkt wird, und stoppt diese dann nach einer geeigneten Zeit ab und misst die optische Dichte der erhaltenen Mischung, falls erforderlich, unter Verwendung eines Farbstoffs oder Farbbildners (z.B. o-Phenylendiamin). Wird eine fluoreszierende Substanzen zur Markierung des Lectins verwendet, so wird eine vorbestimmte Menge eines Verdünnungsmittels, wie eine Pufferlösung, zu dem Reaktionsgemisch auf dem Gel nach der Inkubierung gegeben und die Intensität der Fluoreszenz der erhaltenen Mischung wird gemessen.

Ein besonders geeignetes Verfahren zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens wird mit einem Set für die Bestimmung von TAG in einer Körperflüssigkeit, wie Plasma oder Serum, durchgeführt. Ein solcher Set kann ein Reagenz, enthaltend ein Pflanzenlectin, als spezifisches Agglutinationsmittel für TAG enthalten. Das Lectinreagenz kann auch einen Stabilisator und/oder ein Konservierungsmittel für das Lectin, wie ein Protein mit niedrigem Zuckergehalt, z.B. Rinderserumalbumin, enthalten. Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform kann das Pflanzenlectinreagenz gefriergetrocknet sein und in dem Set kann auch ein Rekonstituierungsmittel, enthaltend

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ein auf Wasser aufgebautes oder mit Wasser mischbares Lösungsmittel (pH etwa 6 bis 7,8, vorzugsweise 7 bis 7,2) enthalten sein. Gewünschtenfalls kann das Reagenz auch Puffer zur Aufrechterhaltung eines bestimmten pH-Wertes in dem rekonstituierten Reagenzsystem und Konservierungsmittel und/oder Stabilisatoren, die einen Abbau des Materials vor der Anwendung verhindern, enthalten. Obwohl Puffer kein wesentlicher Bestandteil des Reagenzsets sind, würde ein pH von etwa 6 bis 7,8, insbesondere ein pH von 7 bis 7,2, angewendet werden, um das erfindungs-· gemässe Verfahren durchzuführen. Das Rekonstituierungsmittel kann vorzugsweise Wasser als Lösungsmittel enthalten und kann z.B. eine physiologische Kochsalzlösung, Phosphatpufferlösung und dergleichen sein. Ein wassermischbares Lösungsmittel, das die Reaktion nicht beeinträchtigt, kann ebenfalls zugegeben werden.

Wie bereits erwähnt, kann das TAG-Niveau in einer Probe der Körperflüssigkeit vorteilhaft gemäss der Erfindung bestimmt werden. Das erfindungsgemässe Verfahren, das die Erkennung von im Zusammenhang mit Tumoren vorkommenden Glykolbindungen ermöglicht, ist bei zahlreichen Krebs- und Tumorarten anwendbar, ganz im Gegensatz zu den üblichen Methoden oder Systemen, bei denen man die Antigenität anwendet und bei denen man hauptsächlich die Proteingruppe von Glykoproteinen, wie CEA, oC·. -Foetoprotein und dergleichen bestimmt- Die erfindungsgemässe Methode ist zur Diagnose aller Krebs- und Tumorarten, wie Magenkrebs, Brustkrebs, Dickdarmkrebs, Rektunkrebs, Eierstockkrebs, Mundhöhlenkrebs, Zungenkrebs, Luftröhrenkrebs, Prostatakrebs, Liposarkom, bösartiges Melanom, bösartiges Lymphom, primäres Magensarkom, Häpatom und dergleichen,

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in frühen oder späten Stadien anwendbar und deshalb ist die Erfindung äusserst geeignet zum Nachweis von Krebs im Frühstadium. Die Erfindung wird in den Beispielen näher erläutert. Wenn nicht anders angegeben, sind alle Teile oder Prozentsätze auf das Gewicht bezogen.

Beispiel 1

Bestimmun2_unter_Verwendung_der_Inhibierungsreaktion_von

(1) Herstellung der Testprobe:

Blut wurde von 7 Patienten mit Magenkrebs, 4 Patienten mit Lungenkrebs, 3 Patienten mit Brustkrebs und jeweils 1 Patienten mit Darmkrebs, Rektumkrebs, Eierstockkrebs, Mundhöhlenkrebs, Zungenkrebs, Luftröhrenkrebs, Gebärmutterkrebs, Prostatakrebs, bösartigem Melanom, Liposarkom, bösartigem Lymphom und primärem Magensarkom gesammelt und die Plasmaproben wurden in üblicher Weise zubereitet. Zu den Plasmaproben wurde eine 6 %-ige wässrige Sulfosalicylsäurelösung anteilartig unter Rühren zugegeben, bis das Verhältnis des Additivs zum Plasma 1:1 Vol.% betrug. Nach ausreichendem Rühren wurde die Mischung mit 3000 bis 3500 üpm während 10 Minuten zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit wurde mit Wasser und 0,15 m Phosphatpufferlösung während 24 Stunden unter Zubereitung der Testprobe dialysiert.

♦ sowie 7 gesunden Personen

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(2) Bestimmung5

Zu jeder der gemäss (1) erhaltenen Testproben wurde ein gleiches Volumen von 0,15 m Phosphatpufferlösung, in welcher O,8iig/ml Erdnusslectin gelöst waren, gegeben und die Mischung wurde 30 Minuten unter Rühren bei 20 bis 27°C umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde mit einer 0,15 ra Phosphatpufferlösung verdünnt unter Ausbildung einer Zweifach-Verdünnungsserie, von denen jede auf eine V-förmige Platte in einer Menge von 50 ul gegeben wurde und mit

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50 ul Kaninchenerythrocyten (1 χ 10 bis 2 χ 10 Zellen/ml) unter Rühren vermischt wurde. Nachdem man die Verdünnung bei 37°C während 1 Stunde behandelt hatte, wurde das Auftreten von Agglutination von Erythrocyten in jeder der Verdünnungen untersucht. Maximale Verdünnungswerte, bei denen noch eine Agglutination auftrat, wurden als Agglutinationswert bezeichnet und die Bestimmung wurde unter Anwendung dieses Wertes durchgeführt. Die erzielten Ergebnisse sind in Tabelle 1 angegeben.

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Tabelle

Agglutinationszahl

Krankheit
I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII XIV XV XVI

1024 512 256 128

32

Anmerkung:	gesunde Person	VII	Eierstockkrebs
I	Magenkrebs	VIII	Mundhöhlenkrebs
II	Brustkrebs	IX	Zungenkrebs
III	Lungenkrebs	X	Luftröhrenkrebs
IV	Colonkrebs	XI	Gebärmutterkrebs
V	Rektunkrebs	XII	Prostatakrebs
" VI

XIII Liposarkom

XIV bösartiges Melanom

XV bösartiges Lymphom

XVI primäres Magensarkom

(3) Beobachtung:

Aus den Ergebnissen in Tabelle 1 wird ersichtlich, dass alle gesunden Personen Agglutinationswerte von 128 oder darüber aufwiesen, während von Krebs befallene Patienten wesentlich geringere Agglutinationswerte hatten als die Gesunden: 6 von 7 Patienten mit Magenkrebs zeigten einen Agglutinationswert von 8 oder darunter, während der andere einen solchen von 32 zeigten. Alle 4 Patienten mit Lungenkrebs zeigten einen Agglutinationswert von 1. Hinsichtlich der anderen Krebsarten wiesen nahezu alle Patienten einen Agglutinationswert von 8 oder darunter auf, mit Ausnahme des Agglutinationswertes von 32 der bei einem Patienten mit Uteruskrebs und einem anderen mit primärem Magensarkom festgestellt wurde. Wie schon erwähnt, betrugen die Agglutinationswerte bei Patienten mit bösartigen Tumoren oder Krebs in allen Fällen 32 oder weniger, während gesunde Personen einen solchen von 128 oder darüber aufwiesen. Deshalb stellt dieses Verfahren eine wirksame Methode dar, um TAG-Niveaus in einer Probe der Körperflüssigkeit ausserhalb des Körpers zu bestimmen und kann vorteilhaft zur Diagnose verschiedener bösartiger Tumore oder Krebsarten angewendet werden.

Beispiel 2

Bestimmun2_unter_Verwendung_von_EnzYm-markiertem_Lectin (1) Aktivierung von Peroxidase:

Zu 1 ml einer 0,3 m wässrigen Natriumhydrogencarbonatlösung

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in welcher 5 mg Peroxidase aus Meerrettich gelöst waren, wurde 0,1 ml einer 0,1 m Fluorodinitrobenzoläthanol-. lösung gegeben und die Mischung wurde schwach während 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde zu der Mischung 1 ml einer 0,06 m wässrigen NaJO.-Lösung gegeben und die Lösung wurde während 30 Minuten schwach bei Raumtemperatur gerührt. Die erhaltene Mischung wurde dann mit 1 ml einer 0,1 m wässrigen Äthylenglykollösung vermischt und 1 Stunde schwach bei Raumtemperatur gerührt und anschliessend wurde die Reaktionsmischung mit 0,01 m Kohlensäure/Natriumhydrogencarbonat-Pufferlösung (pH 9,5) bei 4°C während eines Tages dialysiert unter Erhalt einer aktivierten Peroxidasezuberextung.

(2) Markierung von Lectin mit Peroxidase:

5 mg Lectin (Erdnusslectin) wurden in 3 ml der gemäss (1) zubereiteten Peroxidasezubereitung gelöst und die Mischung wurde während 2 bis 3 Stunden unter schwachem Rühren bei Raumtemperatur umgesetzt. Nach Zugabe von 5 mg NaBH, zum Reaktionsgemisch liess man dieses während 3 Stunden bei 4°C stehen und die erhaltene Lösung wurde mit 0,1 m Tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,4) 1 Tag lang dialysiert und anschliessend durch Sephadex G 150 Gel-Säulenchromatografie einer Gelfiltration unterworfen (Eluiermittel: 0,1 m Tris-HCl-Pufferlösung, pH 7,4). Die optischen Dichten (00™ und OD .__) jeder Fraktion wurden gemessen und die Fraktionen, bei denen sich die Peaks von O und O°4Q3 überlappten, wurden gesammelt.

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(3) Zubereitung von Agarosegel;

Agarose wurde in 0/01 m Tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,5) in einer Menge von 1 Vol.% suspendiert und die Suspension wurde unter Auflösung auf 70 bis 80°C erhitzt. Zu dieser Lösung wurden 0,01 w/v/ % Thimerosal gegeben und die erhaltene Lösung wurde in Reagenzgläser in einer Menge von 1 ml/Reagenzglas gegeben und anschliessend bei Raumtemperatur stehen gelassen, wobei man 1 w/w.% Agarosegel erhielt.

Beispiel 2-1

(1) Herstellung der Testprobe:

5 ml Blut wurden mittels einer mit Häparin (500 Einheiten) behandelten Blutentnahmevorrichtung jeweils von 25 Krebspatienten, 2 Patienten mit Krankheiten, die anders als Krebs waren, und 23 gesunden Personen entnommen und mit 2000 üpm während 10 Minuten zentrifugiert. Das überstehende Plasma wurde als Testprobe verwendet.

(2) Bestimmung:

Die gemäss (1) erhaltenen Testproben wurden in 2 Reagenz gläser in einer Menge von 200 «l/Reagenzglas gegeben und dazu wurden jeweils 50 ul der Peroxidase-markierten

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030^3 1/08° '■

Lectin-Zubereitung, enthaltend 3,5 zg/ml Lectin in Tris-HCl-Pufferlösung (pH etwa 7/5), hergestellt gemäss Beispiel 2, gegeben. Nach schwachem Rühren liess man die Mischung 1 Stunde bei 20 bis 3O°C zur Umsetzung stehen. Dann wurden zu einem der Reagenzgläser 25OuI einer Lösung von 8 % (w/v) Polyathylenglykol (Molekulargewicht: 6000) in 0,1 m Tris-HCl-Pufferlösung gegeben und die Mischung wurde schwach gerührt und stelle die Probe A dar, und 250 ul einer 0,1 m Tris-HCl-Pufferlösung wurde zu dem anderen Reagenzglas gegeben und die Mischung wurde schwach gerührt und bildete dann die Probe B. Beide Proben A und B wurden 30 bis 60 Minuten bei 20 bis 30⁰C umgesetzt und dann 40 bis 60 Minuten mit 1000 G auf einem Schwingrotor zentrifugiert. 50ul der überstehenden Flüssigkeit wurden gesammelt und dazu wurden 2 ml einer zuvor hergestellten physiologischen Kochsalzlösung gegeben. Nach ausreichendem Rühren wurde die Mischung mit 500 ul einer Substratlösung, enthaltend 0,1 m Zitrat-Pufferlösung, o-Phenylendiamin (Endkonzentration 6 Gew.%) und 0,1 Gew.% Wasserstoffperoxid vermischt und im Dunklen 30 Minuten bei 20 bis 30⁰C umgesetzt. Die Substratlösung war zuvor hergestellt und vorzugsweise, bei 4°C aufbewahrt worden. Anschliessend wurde 1 ml einer 2n Chlorwasserstoffsäure zu dem Reaktionsgemisch gegeben um die Umsetzung abzubrechen und die Farbe der Probe wurde spektrofotometrisch, ausgedrückt durch die optische Dichte bei 492 nm, bestimmt.

Die Menge an TAG-Lectin-Komplex, ausgedrückt als Differenz (c), erhalten durch Abziehen der optischen Dichte (a) von Probe Λ von der optischen Dichte (b) der Probe B, wurde in Fig. 1 aufgetragen, in welcher das Symbol 0 für gesunde

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Personen steht und die Ziffern (1)—(27) folgende Patienten bezeichnen: (1) und (18) Magenkrebs, (2), (6), (9), (16) und (17) Lungenkrebs, (3), (5), (7), (8), (13) Magenkrebs (Frühstadium) , (4) und (14) forgeschrittener Magenkrebs, (10) Herzversagen, (11) Lymphadenitis, (12) Dickdarmkrebs mit Lebermetastasen, (15) Gebärmutterkrebs mit Lungenmetastasen, (19) Hydatidenmole, (20) Dickdarmkrebs, (21) Gebärmutterkrebs, (22) und (26) Eileiterkrebs, (23) Rektalkrebs, (24) Prostatakrebs, (25) Harnröhrenkrebs, (17) Häpatom.

Aus den Ergebnissen, die in Fig. 1 gezeigt werden,ist ersichtlich, dass die Proben mit C-Werten höher als bei den Proben von gesunden Personen TAG in Mengen enthielten, die höher waren als bei den Proben der gesunden Personen. Daraus lässt sich mit grosser Wahrscheinlichkeit ableiten, dass die Personen mit hohen C-Werten Tumor- oder Krebszellen haben.

Beispiel 2-2

(1) Blut wurde von 14 Krebspatienten und 8 gesunden Personen gesammelt und die Testproben wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 2 behandelt.

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(2) Bestimmung:

5 ill einer Verdünnung der Testprobe, die gemäss (1) herge-

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stellt worden war und 10 -fach mit Η-Lösung, bestehend aus destilliertem Wasser mit darin gelöst 8 % Natriumchlorid, 0,4 % Kaliumchlorid, 0,05 % Natriumhydrogenphosphat, 0,06 % Kaliumdihydrogenphosphat, 0,05 % Magnesiumsulfat, 0,05 % Magnesiumchlorid, 0,1 % Kalziumchlorid und 1 % Glukose, verdünnt worden war, wurden mit 50 ul der gemäss Beispiel 2 hergestellten Peroxidase-markierten Lectin-Zubereitung, 100-fach verdünnt mit 0,1 m Phosphat-Pufferlösung (pH 7,4) versetzt und auf einem Wasserbad bei 23°C 15 Minuten inkubiert. Die inkubierte Mischung wurde dann vorsichtig auf die Oberfläche eines gemäss Beispiel 2 hergestellten Agarosegels gegeben. Nach Inkubierung des den Gel enthaltenden Reagenzglases auf einem Wasserbad von 23°C während 1 Stunde, wurden zu dem Agarosegel 2 ml einer 0,1 m Phosphat-Pufferlösung (pH etwa 7,4) gegeben und dabei gerührt. Die überstehende Flüssigkeit wurde unmittelbar darauf in ein sauberes Reagenzglas gegeben zu dem dann 400 ul der Substratlösung der Peroxidase-Zubereitung gemäss Beispiel 2 gegeben wurden. Nach ausreichendem Rühren liess man die Mischung 15 Minuten bei Raumtemperatur reagieren. Die Enzymreaktion wurde durch 1 ml 1 η Chlorwasserstoffsäure abgebrochen und das Reaktionsgemisch wurde in einem Thermomischer oder dergleichen ausreichend gerührt. Die optische Dichte der so behandelten Mischung wurde mit einem Spektrofotometer bei 492 nm gemessen. Als Blindprobe wurde eine Mischung aus 400 ml der Substratlösung und 1 ml einer 1 η Chlorwasserstoffsäure verwendet. Die gemessenen Werte der optischen Dichte wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 2-1 bewertet und die

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berechnete Menge von TAG-Lectin wurde in Fig. 2 aufgetragen, in welcher das Symbol O für gesunde Personen steht und die Zahlen (1) bis (1) folgende Patienten bedeuten:

(1) Magenkrebs, (2) Hydatidenmole, (3) Dickdarmkrebs, (4) Uteruskrebs, (5) Eierstockkrebs, (6) Rektalkrebs, (7) Prostatakrebs, (8) Harnröhrenkrebs, (9) Häpatom und (1) Brustkrebs.

Aus den in Fig. 2 gezeigten Ergebnissen geht hervor, dass ein merklicher Unterschied im Niveau von TAG in der Körperflüssigkeit bei gesunden Personen und Patienten, dieunter verschiedenen Krebsarten leiden, besteht.

Das erfindungsgemässeVerfahren kann in klinischen Laboratorien zur Bestimmung von TAG-Niveaus in Körperflüssigkeiten, wie Blutserum oder Plasma, angewendet werden.

Für den Fachmann ist ersichtlich, dass zahlreiche Änderungen vorgenommen werden können, ohne vom Geist und Umfang der Erfindung abzuweichen.

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Claims

PATENTANSPRÜCHE

Verfahren zur Bestimmung des Niveaus einer bei Tumoren vorkommenden Glykolbindungen enthaltenden Substanz (TAG) in einer Körperflüssigkeit, dadurch gekennzeichnet , dass man die TAG in einer Probe der Körper,flüssigkeit mit einem Lectin umsetzt unter Bildung eines TAG-Lectin-Komplexes und die Menge des TAG-Lectin-Komplexes oder an nicht-reagiertem Lectin misst.
2. Verfahren gernäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass man das TJiG von der Körperflüssigkeitsprobe abtrennt und das abgetrennte TAG mit

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dem Lectin umsetzt.
3. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass man ein markiertes Lectin verwendet.
4. Verfahren gemäss Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet , dass das markierte Lectin ein mit einem Enzym, einer fluoreszierenden Substanz oder
einer radioaktiven Substanz markiertes Lectin ist.
5. Verfahren gemäss Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass zu der Körperflüssigkeit ein Schutzprotein gegeben wird.
6. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass die Körperflüssigkeit Blut, Gewebeflüssigkeit, Lymphe, Hydrotorax, Aszites, amniotische Flüssigkeit, Magensaft, Urin, Pankreassaft,
Rückenmarksflüssigkeit oder Speichel ist.
7. Verfahren gemäss Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet , dass die Körperflüssigkeit Blutserum oder Blutplasma ist.
8. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Umsetzung wenigstens 30 Minuten bei 45°C oder weniger vorgenommen wird.
9. Verfahren gemäss Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet , dass die Umsetzung bei 4 bis 4O°C durchgeführt wird.

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10. Verfahren gemäss Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet , dass die Umsetzung bei 20 bis 4O°C durchgeführt wird.
11. Verfahren gemäss Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet , dass die Umsetzung 60 bis 90 Minuten durchgeführt v/ird.
12. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass das Lectin ein Lectin ist, das sich spezifisch mit Galactose- (ß1 -> 3 oder ß1-> 4)-N-Acetylglucosamin-Bindungen bindet.
13. Verfahren gemäss Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet , dass das Lectin Erdnusslectin oder Castorbohnenlectin ist.
14. Verfahren gemäss Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , dass die Menge an nicht-umgesetztem Lectin durch Agglutination des nicht-umgesetzten Lectins bestimmt wird.
15. Verfahren gemäss Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet , dass das nicht-umgesetzte Lectin mit einer Galactose- (ß1-> 3 oder ß1 -> 4) -N-acetylglucosamin-Endgruppen enthaltendem Glykoprotein oder Sephadex oder Glasperlen, die damit beschichtet sind, agglutiniert wird.
16. Verfahren gemäss Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Glykoprotein Kaninchenerythrocyten oder mit Neuraminidase behandelte Schafserythrocyten ist.

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17. Verfahren gemäss Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym Glukoamylase, Glukooxidase, Peroxidase, Alkaliphosphotase oder Hämooctapeptid oder ein aktives Fragment davon ist.
18. Verfahren gemäss Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet , dass die fluoreszierende Substanz Fluoreszein, Fluoreszeinhydrogenthiocyanat oder Dansylchlorid ist.
19. Verfahren gemäss Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die radioaktive Substanz radioaktives Jod oder Tritium ist.
20. Verfahren gemäss Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym Peroxidase ist.
21. Verfahren zur Diagnose von Krebs, dadurch gekennzeichnet, dass man das Niveau an TAG in einer Kca-perflüssigkeitsprobe gemäss dem Verfahren nach Anspruch 1 bestimmt und das TAG-Niveau mit dem von gesunden Personen erhaltenen vergleicht.
22. Diagnoseset zur Bestimmung von TAG-Niveaus in einer Körperflüssigkeit, dadurch gekennzeichnet, dass es Lectin als spezifisches Agglutinierungsmittel für TAG enthält.
23. Diagnoseset gemäss Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass das Lectin lyophilisiert worden ist und dass der Set zusätzlich ein Rekonstituierungsmittel auf Basis eines wässrigen oder wassermischbaren Lösungsmittels enthält.

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24. Diagnoseset gemäss Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet , dass das Lectin Erdnusslectin ist.
25. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass man eine TAG-Fraktion aus der Körperflüssigkeit abtrennt, die Flüssigkeit mit einem markierten oder unmarkierten Lectii. umsetzt, dass man das nicht-umgesetzte Lectin aus dem Reaktionsgemisch abtrennt und die Menge an nicht-umgesetzem Lectin oder an mit TAG umgesetztem Lectin bestimmt.
26. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass man eine Körperflüssigkeit mit einem markierten oder unmarkierten Lectin umsetzt, das umgesetzte Lectin von dem nicht-umgesetzten Lectin auf einem Gel abtrennt und die Menge an umgesetztem oder nicht-umgesetztem Lectin bestimmt.

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