DE2804940A1 - Verfahren zur herstellung antigener substanzen und nachweismaterial - Google Patents
Verfahren zur herstellung antigener substanzen und nachweismaterialInfo
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Description
Verfahren zur Herstellung antigener Substanzen und Nachweismaterial
Prof. Dr. Hidematsu Hirai
First biochemistry class of Medical Department in Hokkaido University
Kita 15-jo Nishi 7-chome, Kita-ku
Sapporo-Shi, Hokkaido (Japan)
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein neues Verfahren
zur Feststellung antigener Substanz mittels einer Immunodiffusion unter Verwendung einer nachzuweisenden antigenen Substanz,
verbunden mit einem chromogenen Enzym, und auch auf ein Nachweismaterial, welches direkt für die Feststellung antigener
Substanz verwendet wird. Genauer angegeben betrifft die vorliegende
Erfindung ein Verfahren zur Feststellung antigener Substanzen, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß eine Testprobe,
die eine nachzuweisende antigene Substanz enthält, und ein Material, das eine nachzuweisende antigene Substanz,versehen mit
einem chromogenen Enzym, auf ein Trägermaterial, welches gleichförmig darin den Antikörper oder das Antiserum gegen die nachzuweisende
antigene Substanz enthältfzugefügt wird,eiriei· Immunoreaktion(oder
Antigen-Antikörperreaktion) unterworfen wird, um einen Antigen - Antikörperkomplex zu bilden, Durchführen einer
Farbreaktion durch das chromogene Enzym in dem Komplex und Messen des Diffusionsgrades des Enzyms in dem Komplex.
Weiterhin bezieht sich die Erfindung auch auf ein Nachweismaterial zum Nachweis antigener Substanzen aus einem Trägermaterial,
welches den Antikörper oder das Antiserum einer nachzuweisenden antigenen Substanz gleichförmig enthält, und ein Material, welches
eine nachzuweisende antigene Substanz, versehen mit einem chromogenen Enzym, enthält.
8jyb.32/089ö
Der in dieser Erfindung verwendete Ausdruck "antigene Substanz" bedeutet nicht nur die sogenannten kompletten Antigene, die immunogene
Reaktivität besitzen, sondern auch Haptene, die keine
Immunogenicität besitzen, jedoch antigene Reaktivität aufweisen.
Daher schließt der Ausdruck verschiedene Antigene, beispielsweise Serumproteinantigene, wie z.B.CL -Fetoprotein,^-Globulin G,
-^-Globulin E.. etc., ein; Proteinantigene z.B. ein Enzymantigen,
Toxinantigen etc.; Lipidantigen z.B. Glyco aryx (Zellwandpolysaccharid),
Dextran und Levan, andere Polysaccharidantigene aus Sacchariden, Phospho ipiden, Lipopolysacchariden, neutralen Lipiden
etc.; Haptenantigenen wie Azoprotein, sulfurosierte Substanz,
2,4-Dinitrophenolprotein, Steroidprotein, Penicillinproteinkomplex,
synthetisches Polypeptid etc., antinucleide Säure antikörperproduzierende nucleide Säureantigene wie z.B» ribosomale
Nucleare und Phagen-Antigene wie auch DNA, RNA, synthetische.Polynucleotide,
Proteinkonjugat einer Komponente, die Nucleinsäure bildet etc.; und Blutgruppenantigene wie ABO-Antigen,
Lewis-Antigen, Forssman-Antigen, MN-Antigen,.RH-Antigen etc.
Der qualitative oder quantitative Nachweis von verschiedenen antigenen Substanzen ist nicht nur für die Prophylaxe und
Diagnose von verschiedenen Erkrankungen und physiologischen Abnormitäten, die mit diesen Substanzen in Beziehung stehen,
nützlich, sondern wird auch in einigen anderen Forschungsgebieten, z.B. zu der Bestimmung des Molekulargewichtes der Proteine,
verwendet.
Beispielsweise, wenn die quantitative Bestimmung einer sehr kleinen Menge an Human-*trFetoprotein möglich ist, ist dies für
die Diagnose von Lebertumoren verwendbar. Der quantitative Nachweis einer sehr kleinen Menge an Human-^-Globulin G oder
Human->^-Globulin E ist für die Diagnose von Erkrankungen, die
auf immunologischer Unordnung beruhen, gleichermaßen nützlich.
Bisher sind als Methode zum Nachweis antigener Substanzen beispielsweise
ein Verfahren unter Verwendung einer Antigen-
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Antikörper-Fällungsreaktion oder ein Verfahren unter Verwendung
einer Hämagglutination oder einer Komplementbindungsreaktion bekannt. Das Verfahren unter Verwendung einer Hämagglutination
oder einer Komplementbindungsreaktion ist eine indirekte Methode und bei solchen Methoden ist die Arbeitsweise kompliziert und
ihre quantitative Durchführung bringt häufig Schwierigkeiten mit sich.
Als Methoden unter Verwendung der Fällungsreaktion sind eine
Immunodiffusionsmethode bekannt, wobei der Grad der Diffusion des Antigen-Antikörperkomplexes, der durch eine Fällungsreaktion,
wie eine Antigen-Antikörper-Reaktion etc., gebildet wird, ohne
Isolierung des Antigen-Antikörperkomplexes gemessen wird und ein Verfahren, bei dem der durch eine Fällungsreaktion erhaltene
Antigen-Antikörperkomplex mit Zentrifugalfällung, Adsorption, Gelfiltration etc. abgetrennt wird, und danach der Gehalt des
nicht in Reaktion getretenen Antigens oder des gebildeten Antigen-Antikörperkomplexes gemessen wird. Die vorstehend genannte
Immunodiffusionsmethode wird nach der Art der Diffusion, · beispielsweise in eine einfache radiale Diffusion, eine
doppelte Diffusion und Immunoelektrophorese (sogenannte Trägerelektrophorese) eingeteilt. Yfeiterhin gibt es eine Immunodiffusionsmethode
unter Verwendung von Färbungen und eine Immunodiffusionsmethode unter Verwendung einer radioisotop-markierten
Verbindung. Diese Immunodiffusionsmethoden sind einfach in ihrer
Arbeitsweise durchzuführen, jedoch sind sie gewöhnlich für eine quantitative Bestimmungsmethode für sehr kleine Mengen eines
Antigens aufgrund ihrer geringen Nachweisempfindlichkeit nicht
geeignet.
Selbst bei der Immunodiffusionsmethode mit zusätzlicher Färbemethode
liegt der quantitativ bestimmbare Bereich meietens um
etwa 10 pg/ml. Auch die Immunadiffusionsmethode unter Verwendung
einer radioisotop-markierten Verbindung ist bei dem Arbeitsablauf unvorteilhaft aufgrund des ZeitVerbrauchs bis das Resultat
vorliegt und durch das Erfordernis an spezifischen Reagenzien und der Apparatur aufgrund der radioaktiven Substanz. Bei
NACHGSREiOHT
der zuletzt genannten kethode, bei der der gebildete xiiitikörperkoKiplex abgetrennt wird, gibt es verschiedene bekannte Verfahren wie eine Lethode unter Verwendung eines radioisotop-markierten
Antigens (Radioimmungehalt), eine Kethode
unter Verwendung eines enzym-markier ten Antigens (Enzyminiiiiungehalt)
etc. Unter diesen Verfahren ist die Radioinmungehaltr,-I-.ethode
häufig verwendet xrorden, denn die Lethode gestattet,
'.juantitativ eine sehr kleine Ilenge an Antigen nachzuweisen. Jedoch
sind diese Kethoden kompliziert in ihrer Durchführung, denn es ist unvermeidlich bei diesen tiethoden, den durch eine
Fällung gebildeten Antigen-Antikörperkomplex von dem nicht umgesetzten Antigen abzutrennen. Da weiterhin bei der Radioimmungehalts-Kethode
erforderlich ist, spezifische Reagenzien und Apparaturen zu verwenden - aufgrund der Verwendung von
radioaktiven Substanzen - besitzt diese Methode Ilaehteile und zwar, daß der Arbeitsablauf Schwierigkeiten mit sich bringt,
einen langen Zeitabschnitt benötigt, um das Ergebnis zu erhalten, und die Kosten sehr hoch liegen.
Als Ergebnis verschiedener Untersuchungen bei diesem Stand der
Technik hat der Erfinder gefunden, daß durch Verwendung einer gewöhnlichen oder Elektrophorese-Typ Iranunodiffusion unter
Vervrendung einer nachzuweisenden antigenen Substanz, versehen
]?it einem chromogenen Enzym, eine sehr kleine kerige einer
antigenen Substanz durch ein einfaches Arbeitsverfahren nachgewiesen
werden kann tind die Kachweismaterialien sehr einfach
und zu niedrigen Kosten hergestellt werden können, l-.it dem in
dieser Erfindung benutzten Ausdruck "Immunodiffusion" werden
eine Immunoelektrophorese unter Verwendung der Elektrophorese und eine gewöhnliche Immunodiffusion, wie eine einfache radiale
Diffusion, doppelte Diffusion etc. verstanden.
Dies bedeutet, wenn eine Immunodif fusion durch Ir.onuno elektrophorese
(sogenannte Trägerelektrophorese) gemäß dieser Erfindung dtirchgeführt wird, besitzt die Immunodif fusion eine ausgeze-ichnete
Empfindlichkeit - v.-ie bei der Raciioii.momgehalts-I-iethode
- und dadurch kann eine sehr kleine Menge einer anti-
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— ν —
genen Substanz quantitativ in einer sehr kurzen Zeit in einfacher
V/eise bestimmt werden. Ebenso wird die Immunodiffusion durch eine gewöhnliche Immunodiffusion wie eine einfache radiale
Diffusion und doppelte Diffusion gemäß einer anderen Ausführungsform dieser Erfindung durchgeführt. Die Nachweisempfindlichkeit
ist beträchtlich erhöht und« dadurch kann eine sehr kleine Menge einer antigenen Substanz ebenfalls quantitativ
in sehr einfacher Weise bestimmt werden. Außerdem können die für diese Methoden benötigten Nachweismaterialien sehr leicht
zu niedrigen Kosten hergestellt werden.
Beispielsweise, wenn Bovin-3erum-Albumin (3SA) als Standardantigene
Substanz verwendet wird, beträgt die Nachweisempfindlichkeit
für das Antigen meist etwa lO^g/ml gemäß den herkömmlichen
Immunodiffusionsmethoden. Jedoch, wenn die Immunodiffusion
mittels Immunoelektrophorese gemäß dieser Erfindung
durchgeführt wird, kann das Antigen mit einer Nachweisempfindlichkeit
von 125 ng/ml nachgewiesen werden. Dies bedeutet, daß
die Nachweisempfindlichkeit gegenüber den herkömmlichen Immunodif fusionsmethoden um das ÖOfache gesteigert vorliegt. Selbst
wenn die Immunodiffusion durch eine einfache radiale Diffusion gemäß einer anderen Ausführungsform dieser Erfindung ausgeführt
wird, kann das Antigen quantitativ mit einer Nachweisempfindlichkeit
von 500 ng/ml bestimmt werden; dies bedeutet gegenüber
den vergleichbaren herkömmlichen Methoden eine 20fache Steigerung der Nachweisempfindlichkeit, wie dies im Beispiel 1 dieser
Erfindung nachgewiesen wird. Deshalb ist es ohne weiteres ersichtlich, daß die Nachweisempfindlichkeit für antigene Substanzen
durch diese Erfindung beträchtlich erhöht x/ird im Vergleich
mit herkömmlichen Methoden. Insbesondere, wenn die Immunoelektrophorese für den Nachweis von <C-Fetoprotein gemäß dieser
Erfindung angewandt vri.rd, kann das Antigen quantitativ mit einer
Nachweisempfindlichkeit von 10 ng/ml bestimmt werden. Dies bedeutet
eine 1000 fache Steigerung der Nachweisempfindlichkeit gegenüber den herkömmlichen Methoden, wie dies durch das Beispiel
2 dieser Erfindung verdeutlicht wird.
8uy832/Ö89fl
Nachfolgend wird die Nachweismethode dieser Erfindung ijtncnjiY
zusammen mit den bei der Methode verwendeten Ilachweismaterialien beschrieben werden. Bei der Nachweismethode dieser Erfindung
wird zur quantitativen Bestimmung ein Testmaterial tropfenweise in Löcher im Nachweismaterial eingebracht, welches den nachzuweisenden
Antikörper oder das Antiserum einer antigenen Substanz und ein Material, welches eine nachzuweisende antigene Substanz,
versehen mit einem chromogenen Enzym, enthält. Beispielsweise wird eine antigenhaltige Standardlösung mit einer vorgegebenen
Menge einer antigenen Substanz als eine Standardtestprobe einer einfachen radialen Immunodiffusion oder einer Immunoelektrophorese
unterworfen und dann \ri.rd eine Färbung durch das im Immunkomplex
anwesende Enzym entwickelt.
Der bei dieser Erfindung verwendete Antikörper ist nicht unbedingt
ein gereinigter Antikörper und wenn die Spezifität des Antikörpers genügend hoch ist, kann ein ungereinigtes Antiserum
verwendet werden, ohne irgend einen Einfluß auf die Nachweisbarkeit bei dieser Erfindung auszuüben, welches eine der ausgezeichneten
Vorteile dieser Erfindung ist.
Gelartige Träger werden bevorzugt als Träger flir die Nachweismaterialien
dieser Erfindung verwendet und Beispiele für solche gelartigen Träger sind Gelatine, Pektine, Silikagel, Stärke,
Polysaccharide, erhalten aus untergetauchten Heerespflanzen, wie
Agar, Algenin, Carrageen etc. und synthetische Polymere, wie
vernetztes Polyacrylamidgel, wie dies in der US-PS 3 046 201
beschrieben ist, denaturierte Cellulose, wie diese in der ÜS-PS 3 36Ο 440 beschrieben sind.
Besonders bevorzugte Beispiele für das bei dieser Erfindung benutzte
Trägermaterial sind Agar oder Agarose,(gereinigtes Agar, das weiche und nichtpolare Gele bildet und vorzugsweise für die
Gel-Elektrophorese verwendet wird),auch Materialien, die leicht
in Wasser dispergierbar sind, ausreichende Steifheit besitzen,so
daß die Platte des gelartigen Materials gedreht werden kann, ohne daß eine Abtrennung des Gels von der Platte erfolgt,und zur Bildung
von transparenten Hydrogelen fähig sind, können bevorzugt bei dieser Erfindung verwendet werden.
8u3*32/0
Die antigene Substanz, versehen mit einem chromogenen Enzym, die
bei dieser Erfindung Anwendung findet, wird durch Kombinieren einer nachzuweisenden antigenen Substanz mit einem Enzym hergestellt,
welches die Farbreaktion eines Chromophors durch anschließende Behandlung katalysieren kann. Die antigene Substanz,
die in diesem Falle verwendet wird, ist die bei der Nachweismethode der Erfindung zu bestimmende Substanz und besitzt die
Fähigkeit der Kombination mit dem bei dieser Erfindung
benutzten Enzym. Das in diesem Falle benutzte Enzym besitzt die Fähigkeit, die Farbreaktion eines Chromophors zu katalysieren
und die Eigenschaft, mit der vorstehend genannten antigenen Substanz kombiniert vorzuliegen. Alle antigenen Substanzen und
Enzyme, die die vorstehend beschriebenen Eigenschaften besitzen, können in diesem Fall der Erfindung verwendet werden. Es wird
bevorzugt, daß sie vor der Verwendung gereinigt werden. Die Reinigung der antigenen Substanzen und Enzyme kann nach den ganz
allgemein bekannten Arbeitsweisen auf diesem Gebiet erfolgen. Beispiele für die besonders bevorzugten Enzyme, die in dieser
Erfindung verwendet werden, sind Oxidations-Reduktionsenzyme
(oder Oxidoreduktasen) wie Peroxidase, Katalase, Oxidase, verschiedene Dehydrogenasen etc.
Die Kombinationsreaktion des Antigens und des Enzyms wird entsprechend
der Art des Antigens und der Art des Enzyms ausgewählt. Es wird bevorzugt, um die Aktivität des Enzyms aufrechtzuerhalten,
die aktive Seite des Enzyms durch eine Schutzgruppe in der Kombinationsreaktion zu schützen. In diesem Falle der
Verwendung eines Qxydations-Reduktions-Enzyms, wie z.B. Peroxidase,
wird die Kombinationsreaktion In folgender Weise durchgeführt: Nach dem Schützen der Aminogruppe an der aktiven Seite des
Enzyms unter Verwendung einer Schutzgruppe, wie 1-Fluor-2,4-dinitrobenzol,
und dann der Aldehydbildung an der Saccharosehälfte des Enzyms durch Verwenden eines oxidativen Aufspaltungsmittels an der Seite der Glykolhälfte, wie z,B, Natriumperjodat,
wird das Enzym mit dem Antigen kombiniert.
Die Reinigung des erhaltenen, mit dem Enzym versehenen Antigens
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* -s.'. . . ·\ 2804340
- ίο -
wird in der üblichen Weise auf diesem Gebiet vorgenommen z.B·
Extraktion, Dialyse, verschiedene Chromatographie-Verfahren. Die besonders bevorzugte Reinigungsmethode besteht aus einer Säu-.!eng&Lfiltration
mit Molekularsieben. Es ist erforderlich, daß das mit Enzym versehene Antigen sowohl die Aktivität des Enzyme,
. wie auch die Aktivität des Antigens behält und deshalb im Falle der Wiedergewinnung des mit Enzym versehenen Antigens in ihrar
Reinigungsstufe die aktiven Fraktionen unter Bestätigung jeder Aktivität gesammelt.werden.
Die Herstellung eines gereinigten Antikörpers und/oder gerei-•
nigten Antiserums kann nach üblichen Verfahren erfolgen·
• Der gereinigte.Antikörper, gereinigtes Antiserum oder so hergestelltes
Enzym-versehenes-Antigen wird dann mit einer geeig-
. neten Menge des schon vorstehend genannten Trägermaterials, wie
z.B. Agar und Agarose, vermischt und das Gemisch wird über eine flache Platte verteilt. Beim Vermischen der vorstehend genannten
Komponenten wird es bevorzugt, eine Pufferlösung mit einem bestimmten pH und bestimmter Ionenstärke zu verwenden. Tris-ChlorwasserstofTsäurelösung,
enthaltend Natriumchlorid, Amlnosäurepufferlösung,
Phosphorsäurepufferlösung, Borsäurepufferlösung, Kohlensäurepuff er lösung und Barbitursäurepuff erlösung sind
beispielhafte Angaben für solche Pufferlösungen. Ein möglicher
••••pH-Bereich liegt zwischen 5}0 bis 9,5· Gewöhnlich wird der pH-Wert
auf 7,2 - Ö,Ö eingestellt. Weiterhin ist es günstig,-die
,'vorstehend genannten Komponenten im Temperaturbereich von 40 60°
G zu mischen. Die Mengen des mit Enzym versehenen Antigens
und der Antikörper können in geeigneter Weise ausgewählt werden, gemäß der Art der zu bestimmenden Substanz und der Trägermaterialien.
Als flache Platte, über die das vorstehend erläuterte Gemisch . ausgebreitet wird, wird vorzugsweise eine Glasplatte oder eine
transparente Kunststoffplatte verwendet und zwar in einer Größe, die geeignet für den angewendeten Nachweis ist. Das Naohweismaterial
für die Immunoelektrophorese ist zusammengesetzt aus
.· 8U9 8 32/08 90 original inspected
den separaten Teilen, die gleichförmig den Antikörper und beziehungsweise
das mit Enzym-versehene Antigen auf einer flachen
Platte, wie vorstehend schon beschrieben, enthalten» Dann werden Löcher für die Testprobe auf dem oberen Teil des letzten
Teils, der das mit Enzym-versehene Antigen enthält, angefertigt. In diesem Falle besteht keinerlei Beschränkung über die Anzahl
der Löcher* Andererseits wird das Nachweismaterial für die einfache radiale Diffusion auf einer flachen Platte aus dem
Trägermaterial hergestellt, das gleichförmig den Antikörper und die Löcher für die Testprobe enthält. Es gibt hierbei ebenfalls
keine Beschränkungen über die Anzahl der Löcher.
Im Falle der Verwendung des Nachweismaterials für die Immunoelektrophorese
wird ein Standard-Antigen oder ein Testmaterial
in die Löcher für die Testprobe eingebracht. Nach dieser Ausführung auf der flachen Platte wird die Immunoelektrophorese
durchgeführt.
In diesem Falle werden die Bedingungen für den elektrischen Strom, Potential, Wanderungszeit etc. in geeigneter Weise ausgewählt
und eingesetzt, wobei die Wanderungsdistanz berücksichtigt wird. Die Elektrophorese wird unter Verwendung einer
Elektrophorese-Pufferlösung mit vorbestimmtem pH und Ionenstärke
durchgeführt. In diesem Falle werden als Elektrophorese-Puffer-Lösung Pufferlösungen verwendet, die gewöhnlich für die Elektrophorese
Anwendung finden, wie z.B. Natriumchlorid zugegebene tris-Pufferlösung, Aminosäurepufferlösung, Phosphorsäurepufferlösung,
Borsäurepufferlösung, Kohlensäurepufferlösung und BarbiturSäurepufferlösung
sind geeignet. Der pH-Bereich zwischen 5-9 ist brauchbar, aber die Pufferlösung wird gewöhnlich auf
pH 7,2 - Ö,Ö eingestellt.
Es wird auch bevorzugt, die Elektrophorese unter Kühlung auszuführen.
Durch die Anwendung der Elektrophorese bildet die antigene Substanz Niederschläge (einen Antigen-Antikörperkomplex)
mit dem Antikörper durch die Immunioreaktion (Antigen-Antikörperreaktion)
und der Niederschlag wandert so lange als
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die Menge des anwesenden Antigens überschüssig vorliegt. Die so erhaltenen Niederschläge werden wie oben sichtbar gemacht und
die Gipfel dieser Niederschläge, die proportional zu der Konzentration des Antigens sind, werden bestimmt.
Andererseits, im Falle der Anwendung des Nachweismaterials für die einfache radiale Diffusion, werden das mit Enzym versehene
Antigen und eine antigen-enthaltende Standardlösung oder ein Testmaterial in die Löcher des Nachweismaterials dieser Erfindung
eingebracht, welches auf einer flachen Platte, wie vorstehend beschrieben, gebildet vorliegt, um eine einfache radiale-Diffusion
auszuführen. In diesem Falle werden die Bedingungen der Diffusionszeit etc. unter Berücksichtigung der Diffusionedistanz
ausgewählt.
Die Immunodiffusion wird gewöhnlich bei Raumtemperatur ausgeführt.
Durch die Anwendung der einfachen radialen Diffusion bildet die antigene Substanz Niederschläge (Antigen-Antikörperkomplex) durch die Immunoreaktion mit dem Antikörper. Der Durchmesser
des so gebildeten Niederschlagsringes ist proportional zu der Konzentration des Antigens.
Dann werden in jedem Falle die Niederschläge durch das mit Enzym-verbundene Antigen in Kombination mit dem Chromophor an die
Enzyme entsprechend gekuppelt.
Wenn besonders bevorzugte Oxidations-Reduktions-Enzyme# wie z.B.
Peroxidase, Katalase, Ox.idase, verschiedene Dehydrogenasen etc.
verwendet werden, werden Azoverbindungen, wie 3|3t-Diaminobenzidin
etc, Flavin, verschiedene Cytochrome etc.>als Chromophor
benutzt. Als Entwicklungsmittel werden bei dieser Erfindung verschiedene oxidierende Mittel und reduzierende Kittel verwendet
z.B. Peroximaterialien, wie z.B. Wasserstoffperoxid, Ozon
etc., Sauerstoff, NADH1 Nicotmsäureamid-adenin-dinucleotid, FAD,
Thiolverb indungen und Metallverbindungen, wie z.B. Eisen-, Kupfer
etc., sind geeignet. Durch ihre Kombination kann eine besonders bevorzugte Farbreaktion angewendet werden.
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In dem Fall des Einsetzens eines Systems unter Anwendung von Peroxidase, Benzidin und Wasserstoffperoxid beträgt die Reaktionsablaufzeit
vorzugsweise von etwa 30 Minuten bis etwa 2 Stunden in Abhängigkeit von der Deutlichkeit, Möglichkeit der Farbreaktion.
Die Reaktionstemperatur liegt gewöhnlich bei der Zimmertemperatur.
Die Reaktionstemperatur liegt gewöhnlich bei der Zimmertemperatur.
Wenn die quantitative Analyse der Testprobe durch Vergleichen des Grades der Diffusion des so als Antigen-Antikörperkomplex sichtbar
gemachten Standardantigens und dea Antikörpers von jeder Konzentration durchgeführt wird, wird die Höhe der Niederschläge
bei der Immunoelektrophorese oder der Durchmesser des Niederschlagringes im Falle der Immunodiffusion ausgewertet.
Die Nachweismethode dieser^ Erfindung kann auch in Form der doppelten
radialen Diffusion 'etc. ausgeführt werden, wie dies in den Fällen der vorstehend beschriebenen Anwendungen bei der
Immunoelektrophorese und der einfachen radialen Diffusion geschieht.
Ebenso kann jede Diffusionsmethode in der jeweils spezifischen Weise durchgeführt werden.
Bovin-Serum-Albumin (BSA):
(a) Herstellung des mit Enzym versehenen Antigens:
Zu 1 ml einer 0,5/^igen Peroxidase-Lösung, aufgelöst in 0,3
ruol Natriumhydrogencarbonatlösung (pH #,1), wurde 0,1 ml einer
1$öigen 1-Fluor-2,4-dinitrobenzollösung, in 100'/iigem Äthanol gelöst,
hinzugegeben. Dann wurde das Gemisch bei Zimmertemperatur gerührt, um die Aminogruppe zu blockieren.
Nach Zugabe von 1,0 ml von 0,04-0,00 mol Natriumperjodatlösung
wurde das Gemisch langsam bei Zimmertemperatur für etwa 30 Mnuten
durchgerührt bis die Lösung gelb-grün mit dem Fortschritt der Reaktion mit der Saccharosehälfte gefärbt wurde. Dann wurde 1,0
ml von 0,16 mol Äthylenglykollösung zu der Lösung hinzugefügt,
und die Lösung wurde etwa eine Stunde bei Raumtemperatur durchgerührt. Danach wurde die Dialyse über Nacht bei 4° C gegen
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0,01 mol Natriumcarbonatpuff er lösung (pH 9,5) durchgeführt, urn
überschüssiges Natriumperjodat zu entfernen.
Zu 3 ml der vorstehend hergestellten Lösung wurde 1 ml einer
Natriumcarbonatpufferlösung (pH 9,5), die 0,1-0,5 mg gereinigtes
Bovin-Serum-Albumin (BSA) enthielt, hinzugefügt. Das Gemisch
wurde 2-3 Stunden bei Raumtemperatur durchgerührt.
Dann wurde nach Zugabe von 1-5 mg Natriumborhydrid zu der vorstehend
hergestellten Lösung das Gemisch langer als 3 Stunden bei 4° G stehen gelassen.
Nach dem Stoppen der Reaktion wurde das Produkt bei 4° C gegen
Phosphatpufferlösung, die Natriumchlorid (PBS) enthielt, dialysiert.
Die gebildete kleine Menge an Niederschlagen wurde durch Zentrifugieren entfernt.
Dann wurde die überstehende Lösung in eine Säule mit der Abmessung
35 χ 1,5 cm mit einer Füllung eines Molekularsiebes,
wie z.B. Sephadex G 100 oder G 200, die zuvor mit PBS-Lösung
gewaschen wurde, einer Gelfiltration und einer Durchflußrate von 10 ml/Stunde unterworfen.
Dann wurden die so erhaltenen Fraktionen aus Peroxidase-Aktivität
und die BSA-Antigen-Aktivität untersucht. 25 ml der Fraktionen, die beide Aktivitäten aufwiesen, wurden gesammelt, um
eine mit Peroxidase versehene Bovin-Serum-Albumin-Stammlösung
zu erhalten. Durch das Verfahren wurden mehr als 50$ der Total-Peroxidase-Aktivitäten
in den Fraktionen erhalten.
(b) Herstellung der Nachweisplatte:
i) Nachweisplatte für die Immun.oelektrophorese:
Unter Verwendung von Agarosegelen, von denen jedes 0,01$
(Gew./Vol.) Anti-Bovin-Serum-Albumin (Anti-BSA) oder etwa %
(Vol./Vol.) Peroxidase-versehene-BSA-Stammlösung enthielt, verdünnt
mit 0,05 mol Diäthylbarbitursäurepufferlösung (pH 0,6)
bei 46-40° C, wurde der Antikörper-enthaltende Teil und der mit
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Peroxidase-versehene Antigen-enthaltende Teil separat in einer
Dicke von etwa 2 mm auf eine Glasplatte mit der Abmessung 70 mm
χ 200 mm aufgetragen. Dann wurden Löcher für die Probe in dem oberen Teil des mit Peroxidase-versehenen Antigen-enthaltenden
Teils nach der üblichen Arbeitsweise hergestellt. ii) Nachweisplatte für einfache radiale Diffusion:
Unter Verwendung des Agarosegels, hergestellt zum Beispiel aus O,O1<£ (Gew./Vol.) Bovin-Antiserum-Albumin (Anti-BSA) zu einer
0,05 mol Diäthylbarbitursäurepufferlösung (pH 0,6) bei 46-4Ö0 C1
wurde der Antikörper-enthaltende Teil in einer Schichtdicke von etwa 2 mm auf einer Glasplatte mit der Abmessung 15° mm χ 150 mm
aufgebracht. Dann wurden Löcher in den den Antikörper-enthaltenden
Teil nach einem bekannten Verfahren angebracht.
(c) Nachweis von BSA:
i) Immunoelektrophorese:
In jedes Loch, welches in das Nachweismaterial eingebracht war (flache Platte des Agarosegels), hergestellt in Stufe
(b)-ij, wurde 10^x1 eines Standard-Serums, enthaltend BSA, so
eingestellt, um jeweils verschiedene Konzentrationen (125-1000 ng/ml) oder eine Testprobe vorzuliegen zu haben, eingebracht.
Dann wurde die Elektrophorese mit 2 mA/cm während 4 Stunden unter Kühlung und Verwendung einer Elektrophoresepufferlösung
von 0,05 mol Diäthylbarbitursäurepufferlösung (pH 0,6) durchgeführt.
Dann wurde das Nachweismaterial in eine 0,05 mol tris-Chlorwasserstoffsäurepufferlösung
(pH 7,6), die 0,025/' (Vol./Vol.) 3,3'-Diaminobenzidin (DAB.4 HCl, DOTITE) und 0,005$ (Vol./Vol.)
Wasserstoffperoxid enthält, eingetaucht, wodurch ein Wanderungsdiagramm erhalten wird, in dem der Peroxidase-aktive Teil braun
gefärbt wurde. Eine Standardkurve wurde durch Messung der Höhe
ihres Peaks und der Konzentration an BSA von dieser Standardkurve bestimmt. In diesem Beispiel konnten selbst 125 ng/ml BSA
bestimmt werden.
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ii) Einfache radiale Diffusion:
In jedes Loch, welches in dem Nachweismaterial (Agarose Flachplatte) eingebracht war, hergestellt in Stufe (b)-ii),
wurde die mit Peroxidase-versehene-BSA auf eine solche Konzentration
eingestellt, beispielsweise 5$ (Vol./Vol.) Stammlösung
eines BSA-Standards, daß jedes Loch eine verschiedene Konzentration
(höher als 0,5 ug/ml) oder Testprobe aufwies, um die
Immunodiffusion 4$ Stunden durchzuführen. Dann wurde das Nachweismaterial
in eine 0,05 mol tris-Chlorwasserstoffsäurepufferlösung
(ph 7,6L die 0,025$ (Vol./Vol.) 3,3f-Diaminobenzidin (DAB.
4 HCl, DOTITEf und 0,005$ (Vol./Vol.) Wasserstoffperoxid enthielt,
für eine Stunde bei Raumtemperatur eingetaucht, wodurch die Niederschläge als Ring erhalten wurden, worin der Peroxidaseaktive-Teil
braun angefärbt erhalten wurde. Eine Standardkurve wurde durch Messen des Durchmessers des Ringes hergestellttund
die Konzentration an BSA wurde unter Verwendung der Standardkurve bestimmt. In dieser Versuchsanordnung konnten noch 500 ng/
ml BSA nachgewiesen werden.
Human- 0^ -Fetoprotein:
(a) Herstellung von mit Enzym-versehenem Antigen:
Zu 1 ml 0,5$iger (Gew./Vol.) Lösung von Peroxidaae,gelöst in
0,3 mol Natriumhydrogencarbonatlösung (pH 8,1), wurde 0,1 ml !folge Lösung von 1-Fluor-2,4-dinitrobenzol, in 100$igem Äthanol
gelöst, zugegeben. Dann wurde das Gemisch bei Raumtemperatur durchgerührt, um die Aminogruppe zu blockieren. Danach wurde
1,0 ml einer 0,04-0,00 mol Natriumperjodatlösung zu dem Reaktionsgemisch
hinzugefügt. Das erhaltene Gemisch wurde langsam etwa 30 Minuten bei Raumtemperatur durchgerührt bis die Lösung
gelb-grün mit dem Fortschritt der Reaktion an der Saccharosehälfte gefärbt wurde. Dann wurde nach Zugabe von 1,0 ml
einer 0,16 mol Äthylenglykollösung das Gemisch für eine Stunde
bei Raumtemperatur durchgerührt. Die Dialyse wurde über Nacht bei 4° C gegen 0,01 mol Natriumcarbonatpufferlösung (pH 9,5)
durchgeführt, um überschüssiges Natriumperjodat zu entfernen.
BU9832./0890
2804340;
Zu 3 ml der vorstehend hergestellten Lösung wurde 1 ml einer Natriumcarbonatpufferlösung
(pH 9,5) f die 0,1-0,5 rag Human-«^Fetoprotein,
gereinigt nach Nishi's Methode (Biochim. Biophys. Acta.;
22i, 293 (1972)), enthielt, hinzugefügt. Das Gemisch wurde 2-3
Stunden bei Kaumtemperatur durchgerührt, um die Reaktion durchzuführen.
Dann wurde zu der vorstehend genannten Lösung 1-5 mg Natriumborhydrid hinzugegeben, und das Gemisch wurde länger
als 3 Stunden bei 4° C stehen gelassen. Dann wurde die Reaktion gestoppt und gegen eine Phosphatpuffernatriumchloridlösung (PBS)
bei 4° C dialysiert und eine kleine Menge an gebildeten Niederschlägen
wurde durch Zentrifugieren entfernt.
Dann wurde die überstehende Lösung in eine Säule mit der Abmessung
Ö5 χ ) t5 cm mit einer Füllung Molekularsieben, wie Sephadex
G 100 oder G 200, die zuvor mit PBS gewaschen worden war, gefüllt und der Gelfiltration mit einer Durchflußrate von 10 ml/
Stunde unterworfen.
Die Peroxidase-Aktivität und die Human-^-Fetoprotein-Antigen-Aktivitat
jeder Fraktion wurde auf ihre enzymatische Aktivität
untersucht, und nach der Ouchterlony-Methode wurden annähernd
25 ml der Fraktionen, die beide Aktivitäten aufwiesen, gesammelt, um die mit Peroxidase-versehene-Human- <C-Fetoprotein Stammlösung
zu erhalten. Durch diese Arbeitsweise wurden mehr als 15$ der
Total-Peroxidase-Aktivitäten in den Fraktionen wiedergefunden.
(b) Herstellung einer Nachweisplatte:
i) Nachweisplatte für eine Immunoelektrophorese:
Unter Verwendung der Agarosegele mit einem Gehalt an Q*.Q1^
(YoI./Vol.)Anti-Human-o^-Fetoprotein oder etwa 5$(Vol,/Vbl.) Per*·
oxidase-verbundene-Human-cC-Fetoprotein-enthaltende Stammlösung,
verdünnt mit 0,05 mol Diäthylbarbitursäurepufferlösung (pH 0,6)
bei einer Temperatur bei 46-4$° (^wurden der Antikörper-enthaltende
Teil und der mit Peroxidase-verbundene -Antigen-enthaltende
Teil separat in einer Dicke von etwa 2 mm auf einer Glasplatte in einer Abmessung von 70 mm χ 200 mm ausgebreitet. Danach
wurden Löcher für die Probe im oberen Teil des mit.
- ιβ -
Peroxidase-versehenen Antigen-enthaltenden Teils eingebracht,
welcher auf die Glasplatte in einer üblichen V/eise aufgebracht wurde.
ii) Nachweisplatte für einfache radiale Diffusion:
Unter Verwendung des Agarosegels mit einem Gehalt von z.B. 0,01^ (Vol./Vol.) Anti-Human-0C -Fetoprotein, eingestellt mit
0,05 mol Diäthylbarbitursäurepufferlösung (pH 0,6) bei 46-48° C,
wurde das Antikörper-enthaltende Gel in einer Schichtdicke von etwa 2 mm auf eine Glasplatte in der Abmessung 150 x 150 mm
aufgebracht. Dann wurden Löcher in die so auf einer flachen Glasplatte gebildeten Gelplatte in üblicher Weise angebracht.
(c) Nachweis von Human-°i -Fetoprotein:
i) Immunoelektrophorese:
In jedes Loch des Nachweismaterials(flache Platte des Agarosegels)
,hergestellt in Stufe (b)-i),wurde 10 ,ul eines Standardserums
von Human-<ÄrFetoprotein zugefügt, eingestellt, um jeweils
eine verschiedene Konzentration (10-300 ng/ml) oder eine Testprobe
zu haben. Die Elektrophorese wurde mit 2 mA/cra 4 Stunden
unter Verwendung einer Diäthylbarbitursäurepufferlö3ung (pH 0,6) als Elektrophoresepuffer durchgeführt.
Dann wurde das Nachweismaterial in eine 0,05 ..mol tris-Chlorwasserstoffsäurepufferlösung
(pH 7j6) mit einem Gehalt an
O,OO25£ (Vol./Vol.) 3,3'-Diaminobenzidin (DAB·4 HCl, DOTITE) und
0,005£ (Vol./Vol.) Wasserstoffperoxid für eine Stunde bei Raumtemperatur
eingetaucht, wobei ein Wanderungsdiagramm erhalten wurde, in dem der Peroxidase-aktive Teil braun gefärbt war. Eine
Standardkurve wurde durch Messen der Höhe des Peaks erhalten und die Konzentration an <-Fetoprotein wurde unter Verwendung
der Standardkurve bestimmt. Durch die Versuchsanordnung konnten 10 ng/ml Human-°t-Fetoprotein nachgewiesen werden,
ii) Einfache radiale Diffusion:
In jedes Loch des Nachweismaterials (flache Platte des
Agarosegels), hergestellt in Stufe (b)-ii), wurden mit Peroxidase-versehenes-Human-^C-Fetoprotein
und ein Standardserum von Human-öC -Fetoprotein, jeweils in verschiedene Konzentrationen
eingestellt (25.B. 7$ ng/ml bis 2,5 ug/ml), oder eine Testprobe
hinzugefügt, um die Immunodiffusion in 4# Stunden durchzuführen.
Dann wurde das Nachweismaterial in 0,05 mol tris-Chlorwasserstoffsäurepufferlösung
(pH 7,6) enthaltend 0,025$C (Vol./Vol.)
3,3f-Diaminobenzidin (DAB»4 HCl, DOTITE) und 0,005?* (Vol./Vol.)
Wasserstoffperoxid für eine Stunde bei Raumtemperatur untergetaucht, wobei Niederschlagsringe erhalten wurden, in denen der
Peroxidase-aktive Teil braun gefärbt wurde. Eine Standardkurve wurde durch Messen des Durchmessers der braunen Niederschlagsringe
hergestellt und die Konzentration an Human- c( -Fetoprotein wurde unter Verwendung der Standardkurve bestimmt. Durch diese
Versuchsanordnung konnten noch 156 ng/ml Human-«(-Fetoprotein
nachgewiesen werden.
Human- -^-Globulin G (HGG):
(a) Herstellung des mit Enzym-versehenen Antigens:
Es wird gemäß der im Beispiel 2 (a) angegebenen Arbeitsweise mit Peroxidase-versehenes-Human- ^--Globulin G hergestellt,
(b) Herstellung der Nachweisplatte:
i) Nachweisplatte für Immunoelektrophorese:
Unter Verwendung der Agarosegele mit einem Gehalt an 0,01. (Vol./Vol.) Anti-Human-^--Globulin G (Anti HGG oder etwa
5fo (Vol./Vol.) einer mit Peroxidase-versehenen-HGG-Stammlösung,
verdünnt mit 0,05 mol Diäthylbarbitursäurepufferlösung (pH 0,6)
bei 46-40° C, wurde der Antikörper-enthaltende Teil und der mit
Peroxidase-versehene Antigen-enthaltende Teil separat in einer
Dicke von etwa 2 mm auf eine Glasplatte mit der Abmessung 70 mm χ 200 mm aufgebracht. Dann wurden Löcher für die Probe in den
mit Peroxidase-versehenen.Antigenteil auf der Glasplatte nach
einem üblichen Verfahren eingebracht,
ii) Nachweisplatte für einfache radiale Diffusion:
Unter Verwendung des Agarosegels, enthaltend beispielsweise 0,01$ (Vol./Vol.) Anti-HGG in 0,05 mol Diäthylbarbitursäurepufferlösung
(pH 0,6) bei 46-4Ö0 C, wurde der Antikörperenthaltende
Teil in einer Schichtdicke von etwa 2 mm auf eine
»US'832/0890
Glasplatte mit der Abmessung 150 χ 150 mm aufgebracht. Dann
wurden Löcher für die Probe auf die flache Schicht des auf die Glasplatte aufgebrachten Gels in üblicher Weise angefertigt.
(c) Nachweis von HGG:
i) Immunoelektrophorese: In jedes Loch des Nachweismaterials (flache Platte oder Schicht des Agarosegels), hergestellt
in Stufe (b)-i) *wurden 10 ul eines Standardserums von HGG jeweils
auf verschiedene Konzentrationen (höher als 250 ng/ml)oder
eine Testprobe aufgebracht, und die Elektrophorese wurde während k Stunden unter Kühlung unter Verwendung von 0,05 mol Diäthylbarbitursäurepufferlösung
(pH 0,6) als Elektrophoresepuffer durchgeführt. Danach wurde der Arbeitsablauf|Wie im Beispiel 2
(c)-i) beschrieben, durchgeführt. Durch die Versuchsanordnung konnten noch 500 ng/ml HGG nachgewiesen werden.
ii) Einfache radiale Diffusion:
In jedes Loch des Nachweismaterials (flache Platte des Agarosegels), hergestellt in Stufe (b)-ii), wurden mit Peroxidase-versehenes
HGG, eingestellt auf 5f° (Vol./Vol.) Stammlösung,
und ein Standardserum von HGG, eingestellt auf jeweils verschiedene Konzentrationen (höher als 100 ng/ml), oder eine Testprobe
aufgetragen. Danach wurde die Immunodiffusion während 48 Stunden
durchgeführt· Danach wurde der Arbeitsablauf wie im Beispiel 2(c)-ii) durchgeführt. Durch die Versuchsanordnung konnten
noch 300 ng/ml HGG nachgewiesen werden.
Human--^-Globulin E (Human IgE):
(a) Herstellung des mit Enzym-versehenen-Antigens:
Es wurde das Verfahren wie im Beispiel 2(a) angegeben, ausgeführt,
und es wurde mit Peroxidase-versehenes-Human- X"-Globulin E erhalten.
(b) Herstellung der Nachweisplatte:
i) Nachweisplatte für Immunoelektrophorese:
Unter Verwendung der Agarosegele, von denen jedes 0,01$
(Vol./Vol.) Anti-Human-J^-Globulin E (Anti-Human IgE) oder etwa
H υ Bö 3 2/0890
5j»(Vol./Vol.) mit Peroxidase-versehene Human IgE Staimalösung,
verdünnt mit 0,05 mol Diathylbarbitur säurepuff er lösung (pH 0,6)
bei 46-40° C, ent hielt., wurde der Antikörper-enthaltende Teil und
der mit Peroxidase-versehene ,-Anti gen-ent halt ende -Teil separat
in einer Schichtdicke von etwa 2 mm auf eine Glasplatte mit einer Abmessung von 70 mm χ 200 mm aufgebracht. Dann wurden
Löcher für Proben in dem oberen Teil des mit Peroxidase-versehenan Antigen-enthaltenden Teils, der auf der Glasplatte gebildet
war, in üblicher Weise hergestellt.
ii) Kachweisplatte für einfache radiale Diffusion:
Unter Verwendung des Agarosegels mit einem Gehalt an 0,01^ (Vol./Vol.) Anti-Human.IgE in 0,05 mol Diäthylbarbitursäurepufferlösung
(pH 0,6) bei 46- 4#° C wurde das Antikörperenthaltende
Gel in einer Schichtdicke von etwa 2 mm auf eine Glasplatte mit der Abmessung 150 mm χ 140 mm aufgebracht. Dann
wurden Löcher in die Platte der auf der Glasplatte gebildeten Platte des Agarosegels in üblicher Weise hergestellt.
(c) Nachweis von Human IgE
i) Immunoelektrophorese:
In jedes Loch des Nachweismaterials (flache Platte des Agarosegels), hergestellt in Stufe (b)-i), wurden 10 ul des
Standardserums Human IgE, eingestellt in jeweils verschiedener
Konzentration, (höher als 250 ng/ml), oder eine Testprobe aufgebracht.
Die Elektrophorese wurde unter Verwendung einer 0,05 mol Diäthylbarbitursäurepufferlösung (pH 0,6) während 4 Stunden
unter Kühlung durchgeführt. Dann wurde das gleiche Verfahren, wie im Beispiel 2(c)-i) angegeben, angewendet. Durch die Versuchsanordnung
konnten noch 700 ng/ml Human IgS nachgewiesen werden.
ii) Einfache radiale Diffusion:
In jedes Loch des Nachweismaterials (flache Platte des
Agarosegels), hergestellt in Stufe (b)-i3), wurde die mit Peroxidase-versehene·
Human IgE 5fo (VoI,/Vol.) Stammlösung und ein
Standardserum von Human IgE jeweils auf verschiedene Konzentrationen eingestellt (höher als 100 ng/ml) oder eine Testprobe
aufgetragen. Es wurde die Immunodiffusion während 4Ö Stunden
8U3"832/0S90
ausgeführt. Dann wurde das gleiche Verfahren, wie im Beispiel 2 (c)-ii) angegeben, durchgeführt. Durch die Versuchsanordnung
konnten noch 350 ng/ml Human IgE nachgewiesen werden.
8U9'832/0890
Claims (10)
- D, Walter Niels* 280434°PatentanwaltSiriusweg 43,2000 Hamburg 65
Fernruf: 504165Patentansprüche:JVerfahren zum Nachweis antigener Substanzen, dadurch gekennzeichnet, daß eine Testprobe, die eine nachzuweisende antigene Substanz enthält, und ein Material, das eine nachzuweisende antigene.Substanz, versehen mit einem chromogenen Enzym, auf einem Trägermaterial gleichförmig darin den Antikörper oder das Antiserum gegen die nachzuweisende antigene Substanz enthält, aufgebracht wird, eine Immunareaktion (oder Antigen-Antikörperreaktion) durchgeführt wird, um einen Antigen-Antikörperkomplex zu bilden, dann eine Farbreaktion mittels des chroraogenen Enzyms in dem Komplex durchgeführt wird und der Diffusionsgrad des Enzyms in dem Komplex gemessen wird. - 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Immunodiffusion als Immunoelektrophorese durchgeführt wird·
- 3. Verfahren nach Anspruch T, dadurch gekennzeichnet, daß die Immunodiffusion als einfache radiale Diffusion durchgeführt wird,
- 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die nachzuweisende antigene Substanz aus Human-^-Fetoprotein, Human- /^Globulin G (HGG) oder Human- ^-Globulin E (Human-IgE) besteht.
- 5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als chromogenes Enzym Peroxidase eingesetzt wird.
- 6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Trägermaterial Agar oder Agaröse eingesetzt wird.ORIGINAL !NSF2EOTED
- 7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die zu bestimmende antigene Substanz aus Human-o^-Fetoprotein, Human-^"-Globulin G (HGG) oder Human- 3^-Glc-bulin E (Human IgE) besteht; als Trägermaterial Agar oder Agarose eingesetzt wird; als chromogenes Enzym Peroxidase verwendet wird; und die Immunodiffusion mittels Immunoelektrophorese oder als einfache radiale Diffusion ausgeführt wird.
- 8. Nachweismaterial zum Nachweis antigener Substanz aus einem Trägermaterial, welches Antikörper oder Antiserum gegen eine nachzuweisende antigene Substanz gleichförmig enthält, und ein Material, welches eine nachzuweisende antigene Substanz, versehen mit einem chromogenen Enzym, enthält·
- 9. Nachweismaterial zum Nachweis antigener Substanz durch Immunoelektrophorese mittels Elektrophorese aus einem Trägermaterial, welches gleichförmig Antikörper oder Antiserum gegen eine nachzuweisende antigene Substanz enthält, und ein Trägermaterial, welches gleichförmig ein Material enthält, das eine nachzuweisende antigene Substanz, die mit einem mogenen Enzym versehen ist,:enthält, und das Trägermaterial separat auf einer flachen Glas- oder Kunststoffplatte aufgebracht worden ist.
- 10. Nachweismaterial nach Anspruch δ oder 9, worin die nachzuweisende antigene Substanz aus Human-c^-Fetoprotein, Humane-Globulin G (HGG) oder Human-^-Globulin E (Human IgE) besteht.8 jyö.32/0890
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1986003839A1 (en) * | 1984-12-20 | 1986-07-03 | Cerny Erich H | Solid phase diffusion assay |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2036307B (en) * | 1977-07-14 | 1982-07-21 | Elwing H | Method for the determination of biological substances by diffusion in a porous matrix or by electrophoriesis |
| US4222744A (en) * | 1978-09-27 | 1980-09-16 | Becton Dickinson & Company | Assay for ligands |
| US4337131A (en) * | 1978-11-13 | 1982-06-29 | C. Desaga Gmbh Nachf. Erich Fecht | Process for electrophoresis |
| US4289748A (en) * | 1979-05-31 | 1981-09-15 | United States Of America | Ultrasensitive enzymatic radioimmunoassay method |
| US4306956A (en) * | 1980-11-10 | 1981-12-22 | Miles Laboratories, Inc. | Discontinuous gel electrophoresis process |
| DE3212658C3 (de) * | 1982-04-05 | 1993-08-19 | American Hospital Supply Corp | Verfahren zur antigen-bestimmung |
| US4469787A (en) * | 1982-05-14 | 1984-09-04 | Mallinckrodt Inc. | Immunoassay involving soluble complex of second antibody and labeled binding protein |
| JPS6110772A (ja) * | 1984-06-26 | 1986-01-18 | Kyowa Medetsukusu Kk | 生体成分の分析法 |
| US5958790A (en) * | 1984-12-20 | 1999-09-28 | Nycomed Imaging As | Solid phase transverse diffusion assay |
| DE3541978A1 (de) * | 1985-11-28 | 1987-06-04 | Behringwerke Ag | Mittel zur bestimmung von peroxidase-aktivitaet, verfahren zur herstellung und seine verwendung |
| ZA869297B (en) * | 1985-12-13 | 1987-11-25 | Scripps Clinic Res | Modulation of animal cellular responses with compositions containing isoxanthopterin-8-(1'-beta-aldoglycosidyl)derivatives |
| GB8909478D0 (en) * | 1989-04-26 | 1989-06-14 | Bradwell Arthur R | Radial immunodiffusion and like techniques |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL154600B (nl) * | 1971-02-10 | 1977-09-15 | Organon Nv | Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen. |
| NL154599B (nl) * | 1970-12-28 | 1977-09-15 | Organon Nv | Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen, alsmede testverpakking. |
| US3773625A (en) * | 1971-04-08 | 1973-11-20 | Us Army | Soluble antigen-antibody complexes |
| US3790447A (en) * | 1972-07-05 | 1974-02-05 | Abbott Lab | Streptococci diagnostic method |
| DE2406959C3 (de) * | 1974-02-14 | 1979-02-08 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Anordnung und Verfahren zur Bestimmung von Antigenen |
| FR2273280A1 (en) * | 1974-05-31 | 1975-12-26 | Anvar | Measurement of antigens and antibodies - in biological fluids by immuno diffusion techniques with antibodies marked with enzymes |
| US4018662A (en) * | 1975-01-03 | 1977-04-19 | Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. | Method and apparatus for simultaneous quantitative analysis of several constituents in a sample |
| US4067959A (en) * | 1976-05-10 | 1978-01-10 | International Diagnostic Technology, Inc. | Indirect solid surface test for antigens or antibodies |
| FR2353856A1 (fr) * | 1976-06-02 | 1977-12-30 | Chateau Guy | Ruban destine a servir de support a une reaction par exemple chimique ou biochimique, et procede d'analyse le mettant en oeuvre |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1986003839A1 (en) * | 1984-12-20 | 1986-07-03 | Cerny Erich H | Solid phase diffusion assay |
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| FR2380553B1 (de) | 1981-11-27 |
| GB1599543A (en) | 1981-10-07 |
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| US4200508A (en) | 1980-04-29 |
| JPS5399319A (en) | 1978-08-30 |
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