FR2461256A1 - Procede et necessaire de diagnostic du cancer par determination des liaisons glucosidiques associees aux tumeurs - Google Patents

Abstract

L'INVENTION CONCERNE UN PROCEDE DE DIAGNOSTIC DU CANCER PAR DETERMINATION DE LA TENEUR EN SUBSTANCE CONTENANT DES LIAISONS GLUCOSIDIQUES ASSOCIEES AUX TUMEUR (TAG) DANS UN ECHANTILLON D'HUMEUR DE L'ORGANISME, ET UN NECESSAIRE POUR SA MISE EN OEUVRE. SELON L'INVENTION, ON FAIT REAGIR LES TAG DANS UN ECHANTILLON DE L'HUMEUR DE L'ORGANISME AVEC UNE LECTINE POUR FORMER UN COMPLEXE TAG-LECTRINE ET ON MESURE LA QUANTITE DE COMPLEXE TAG-LECTINE OU LA LECTINE N'AYANT PAS REAGI.

Description

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Procédé et nécessaire de diagnostic du cancer par détermination des

liaisons glucosidiques associées aux tumeurs.

La présente invention concerne la détermination de la teneur en substances contenant des liaisons glucosidiques associées aux tumeurs, c'est-à-dire des substances apparentées au

sucre, y compris les glucoprotéines, les glucopeptides, les gluco-

lipides et les sucres (ci-après dénommées en abrégé TAG) dans un

échantillon d'humeurs de l'organisme chez les mammifères, plus par-

ticulièrement les TAG qui augmentent à mesure que les cellules indif-

férenciées, en particulier les cellules tumorales ou cancéreuses, prolifèrent,et un procédé de diagnostic du cancer reposant sur cette

détermination.

On a utilisé jusqu'à présent un procédé de détermi-

nation de la teneur en glucoprotéines spécifiques dans un échantillon

d'humeur de l'organisme chez les patients atteints de cancer. Ce pro-

cédé utilise le caractère d'antigène que possède principalement la

portion protéine des glucoprotéines. Par exemple, la teneur en a1-

foetoprotéine et la teneur en antigène carcinoembryonique (ci-après

dénommé CEA) sont déterminées pour le diagnostic de l'hépatome pri-

maire et des cancers des organes digestifs, en particulier le cancer du rectum, etc. (voir Igaku no Ayumi, volume 106, n0 5, 5e édition spéciale du samedi, pages 235-250 (1978)). Cependant, ces procédés ne sont pas satisfaisants, car leur application est limitée à certains

types de cancers et de tumeurs.

Par con tre, on ne connaît pas actuellement de méthode de diagnostic utilisant la spécificité de liaison du reste

sucre des TAG.

On a besoin depuis longtemps d'une méthodologie quantitative peu coûteuse et simple pour déterminer les teneurs en TAG dans les humeurs de l'organisme, pouvant avoir des applications étendues.

En tenant compte du fait que les humeurs de l'orga-

nisme des individus ou patients atteints de cancer contiennent des TAG produites par des cellules indifférenciées (le plus souvent des cellules cancéreuses) et libérées dans les humeurs de l'organisme et que les TAG sont extrêmement différentes des substances contenant des liaisons glucosidiques produites par les cellules différenciées (le plus souvent

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des cellules normales) et libérées dans les humeurs de l'organisme dans la structure chimique de la chaîne de sucre, sa longueur et la composition des résidus de sucre, la demanderesse a effectué des recherches approfondies qui ont abouti à la découverte que les TAC possèdent un reste galactose-(Pl--3 ou P1-3l 4)-N-acétylglucosamine terminal et se fixent de manière spécifique aux lectines, et que la teneur en TAG dans un échantillon d'humeur de l'organisme peut être déterminée par réaction desTAG avec une lectine. La terneur en TAG indique la présence ou l'absence de cellules cancéreurses, leur degré de prolifération et leur accroissement ou leur diminution et permet d'établir avec succès le diagnostic des divers cancers ou

tumeurs. L'invention repose sur la découverte ci-dessus.

L'invention a donc pour objet un.procédé pour dé-

terminer la teneur en TAG d'un échantillon d'humeur de l'organisme, qui consiste à faire réagir les TAG présentes dans un échantillon d'humeur de l'organisme avec une lectine pour former un complexe TAG-lectine et à mesurer la quantité du complexe TAG-lectine ou de lectine non transformée, et un nécessaire pour l'utilisation dans ce procédé. L'invention sera mieux comprise à la lecture de

la description qui va suivre en référence aux figures des dessins

annexés dans lesquels: - la figure 1 représente graphiquement les quantités de TAG déterminées selon l'exemple 1; et - la figure 2 représente graphiquement les quantités

de TAG déterminées selon l'exemple 2.

On peut utiliser dans l'invention diverses humeurs de l'organisme. Des exemples d'humeurs appropriées comprennent le sang, les humeurs des tissus, la lymphe, l'hydrothorax, les ascites, le liquide amniotique, le suc gastrique, l'urine, le suc pancréatique, le liquide cérébrospinal, la salive, etc. Parmi ceux-ci, on préfère le

sang, en particulier sous forme de sérum ou de plasma.

La quantité de l'humeur de l'organisme pour les échantillons est ordinairement d'environ 1 à 10 ml, de préférence de

2 à 5 ml.

Selon l'invention, la détermination de la teneur en TAG dans un échantillon d'humeur de l'organisme peut être effectuée soit en isolant, soit en séparant les TAG de l'humeur de l'organisme,

en les faisant réagir avec une lectine pour former un complexe TAC-

lectine et en mesurant la quantité du complexe TAG-lectine ou de lectine non transformée après séparation, soit en ajoutant une lectine marquée à l'échantillon d'humeur de l'organisme directement pour

former un complexe 'AG-lectine marquée, en séparant le complexe résul-

tant ou la lectine marquée non transformée et en mesurant sa quantité.

Pour séparer la fraction de TAG d'un échantillon d'humeur de l'organisme, on peut utiliser des techniques classiques

pour l'extraction ou la séparation des substances contenant des liai-

sons glucosidiques, telles que relargage, précipitation, extraction

par des solvants, centrifugation, dialyse, tamis moléculaires, inacti-

vation enzymatique, etc., ou une combinaison de deux ou plusieurs

d'entre elles. Par exemple, on peut obtenir la fraction de TAG en-

ajoutant une quantité,efficace pour la précipitation ou la dénatura-

tion,d'acide sulfosalicylique, d'acide trichloroacétique ou de sulfate de zinc à du sérum ou du plasma sanguin, ou en chauffant le sérum ou le plasma sanguin pour précipiter l'albumine, l'immunoglobuline, etc., en séparant par filtration les protéines précipitées et en dialysant

le filtrat.

Dans les cas o l'on utilise une lectine marquée, on peut utiliser telles quelles les humeurs de l'organisme autres que

le sang comme échantillon d'essai (ci-après "échantillon"). On pré-

fère cepenlant ajouter une protéine ayant une faible teneur en sucre telle que la sérum-albumine de boeuf (BSA), etc., comme protéine protectrice pour éviter la dénaturation de l'échantillon et déclencher en même temps la réaction avec la lectine. En particulier, on ajoute une quantité appropriée de la protéine protectrice à des échantillons après séparation des albumines, immunoglobulines, etc., puisque ceci permet la détermination dans des conditions plus contrôlées. Lorsqu'on utilise des échantillons de sang, on peut utiliser comme échantillon le sérum sanguin obtenu par la technique classique pour recueillir

du sérum sanguin, ou du plasma sanguin obtenu par la technique clas-

sique pour recueillir du plasma sanguin au moyen d'un anticoagulant tel que l'héparine, 1EDTA, l'acide citrique, etc.; on préfère le

plasma sanguin recueilli en utilisant l'héparine comme anticoagulant.

Les échantillons peuvent être dilués par l'eau ou par des solutions

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aqueuses tamponnées convenables, si nécessaire ou si on le désire, par exemple lorsque la teneur en TAG est relativement élevée, comme dans les ascites, etc. Selon l'invention, on peut utiliser des lectines qui peuvent se combiner spécifiquement avec la galactose- (Pl- 3 ou P14 4)-Nacétylglucosamine comme décrit dans J.B.C., 250, pages 8518-8523 (1975); Biochem. Biophys. Res. Comm. 62, page 144

(1975); Z. Immunitaetsforch, 138, pages 423-433 (1969); Br. J. Exp.

Pathol. 27, pages 228- 236 (1946); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, n 5, pages 2215-2219 (1978); Biochemistry 13, pages 196-204 (1974), etc., par exemple la lectine d'arachide, la lectine de ricin (Ricinus communis), etc. Les substances que l'on peut utiliser pour marquer les lectines et qui permettent donc de les déceler par des

techniques radiométriques, fluorométriques, colorimétriques et ana-

logues sont les enzymes, les substances fluorescentes et les substances radioactives. A titre d'exemples d'enzymes appropriées, on peut citer la glucoamylase, la glucose-oxydase, la peroxydase, la phosphatase alcaline, la P-galactosidase, l'héméoctapeptide, etc., et leurs fragments actifs. Des exemples de substances fluorescentes

convenables comprennent la fluorescéine, l'isothiocyanate de fluores-

céine, la rhodamiae, le chlorure de dansyle (chlorure de 5-diméthyl-

amino-l-naphtalènesulfonyle), etc. Des exemples de substaces radio-

actives convenables comprennent l'iode radioactif, le tritium, etc. Pour marquer les lectines avec les substances de marquage décrites ci-dessus, on peut utiliser n'importe quelle technique classique utilisée pour marquer les protéines connues telles que les antigènes et les

anticorps avec des enzymes, des substances fluorescentes et des subs-

tances radioactives. Par exemple, on peut marquer les lectines avec des isotopes radioactifs selon la méthode décrite par Kazuo Shizunome et Yuichi Kumahara dans "Radioimmunoassay" pages 45-56 (1978), publiée

par Asakura Publishing Co., Tokyo.

Dans le procédé de l'invention, on utilise de préféren ce les lectines marquées ou non marquées en mélange avec des solvants convenables. On peut utiliser n'importe quelssolvants

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qui ne dénaturent pas les lectines marquées ou non marquées, par exemple solution saline physiologique, solution tampon tris-HOl 0,1M (pH environ 7,5), solution tampon au phosphate 0,lM (pH environ 7,4), etc. La quantité de lectine contenue dans le solvant ou diluant peut être choisie selon l'indice d'agglutination (qui est défini par la dilution finale ou maximale d'échantillons dilués en série dans le rapport Z), le type de substance de marquage ou les substances à déterminer, etc., et elle est ordinairement d'environ 0,01 à 100 Y/ml, de préférence de 0,03 à 40 7/ml. Les solutions de lectine marquée

ou non marquée ci-dessus peuvent être encore diluées.

Pour mettre en oeuvre le procédé de l'inven-

tion, on mélange une quantité prédéterminée de la fraction de TAG ou de l'humeur de.l'organisme elle-même avec une quantité donnée de lectine ou de lectine marquée, respectivement, et on laisse reposer le mélange résultant pour le laisser réagir à environ 450C ou moins, de préférence environ 4 à 40C, plus particulièrement environ 20 à 400C. On peut séparer du mélange de réaction le complexe TAG-lectine non marquée ou marquée ou la lectine non marquée ou marquée n'ayant pas réagi, par n'importe quelle technique classique de séparation,

par exemple chromatographie, électrophorèse, relargage, fractionne-

ment, dialyse, filtration sur gel, adsorption, ou une combinaison de ces techniques ou une méthode de séparation utilisant un gel de gélose,

d'agarose ou de polyacrylamide.

Plus précisément, pour séparer la lectine marquée ou non marquée non transformée du mélange réactionnel, on peut ajouter au mélange de réaction ci-dessus une quantité convenable d'un agent précipitant du complexe TAG-lectine et séparer le complexe résultant,par exemple par centrifugation, et l'on obtient ainsi la fraction de lectine marquée ou non marquée non transformée comme liquide surnageant. Des exemples caractéristiques de précipitants sont le.polyéthylèneglycol, le sulfate d'ammoniumn (saturé), le lactate

d'éthacridine monohydraté (acrinol), etc. Les conditions de centri-

fugation peuvent être choisies de manière convenable selon les pré-

cipitants utilisés. Par exemple, lorsqu'on utilise le polyéthylène-

glycol comme précipitant, on préfère effectuer la centrifugation à environ 1000 G pendant environ 30 à 60 min. Dans les cas o l'on isole le complexe TAG-lectine marquée ou non marquée de la lectine n'ayant pas réagi, on peut séparer facilement le complexe de la lectine non transformée en utilisant la différence de vitesses de diffusion du complexe et de la lectine non transformée sur gel de gélose, d'agarose ou de polyacrylamide. Plus particulièrement, lorsque l'on dépose le mélange de réaction sur le gel dans un récipient, la lectine non transformée diffuse dans le gel,tandis que le complexe TAG-lectine reste sur le gel, c'est-à-dire à l'extérieur du gel,sans diffuser. Ainsi, donc,

on peut les séparer l'un de l'autre facilement de manière classique.

Il n'y a pas de limitation dans la préparation des gels et l'on peut

utiliser à cet effet les techniques utilisées de manière classique.

Par exemple, on ajoute une certaine quantité de gélose, d'agarose ou de polyacrylamide à un diluant qui ne provoque pas la dénaturation des protéines, tel qu'eau distillée, solution tampon de citrate ou de trisHCl (pH environ 7,5), etc., puis on chauffe à 60-800C en agitant doucement pour dissoudre et l'on verse la solution dans un récipient convenable, tel qu'un tube à essais, et on laisse refroidir pour que le mélange prenne en gelée. La concentration du gel est

choisie selon la dimension (par exemple poids moléculaire, stéréo-

structure, etc.) de la substance de marquage et du complexe TAG-

lectine marquée. On utilise ordinairement dans l'invention des gels

à environ 0,4 à 2,0 % en poids, de préférence de 0,7 à 1,0 % en poids.

Le gel résultant peut contenir un conservateur, si nécessaire ou si on le désire. La surface du gel ainsi préparée peut être plane ou concave, cette dernière forme étant préférée,puisque les complexes à

former n'adhèrent pas sur la paroi du récipient.

La quantité de complexe TAG-lectine marquée ou non marquée ou de lectir.e marquée ou non marquée non transformée est mesurée par la technique classique et on peut calculer à partir

de ia valeur obtenue la teneur en TAG dans l'humeur de l'organisme.

Pour la mesure de la quantité de lectine non marquée résiduelle, on peut utiliser diverses techniques. On préfère cependant ajouter aux échantillons une substance capable de réagir spécifiquement avec la lectine pour l'agglutiner ou la précipiter et observer visuellement le changement, ou bien en

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mesurantpar exemple,la densité optique en utilisant une analyse optique. Des exemples de substances appropriées agglutinant la

lectine comprennent les glucoprotéines ayant un reste galactose-

(tl-> 3 ou Pl-+4)-N-acétylglucosamine terminal, par exemple érythrocytesde lapin, érythrocytesde mouton traités par la neura- minidase, etc., "Sephadex" , billes de verre, etc., revêtus par

les glucoprotéines décrites ci-dessus.

Dans la pratique, ce procédé peut être mis en oeuvre de la manière suivante. Le mélange de réaction décrit ci-dessus est dilué en série avec une dilution 2X au moyen d'un diluant, par exemple solution tampon au phosphate 0,15M, solution de sérum physiologique, etc., et on place des parties aliquotes de la solution diluée sur des plaques en V ou en U ou sur des plaques de verre ou dans de petits tubes à essais ou analogues, et on mélange chaque échantillon avec une substance capable d'agglutiner spécifiquement la lectine en agitant et on laisse reposer les plaques ou analogues portant le mélange à 45WC ou moins, de préférence 4 à 400Ca pendant 30 min ou plus, de préférence 60 à 90 min, pour observer la dilution finale ou maximale à laquelle l'agglutination se produit

encore. Cette dilution maximale est définie comme l'indice d'agglu-

tination. Les lectines qui peuvent être utilisées dans l'invention

présentent sensiblement le même indice d'agglutination.

Dans les cas o l'on utilise des lectines marquées, la détermination de la teneur en TAG peut être effectuée par une méthode appropriée pour la mesure de substances marquées

pour les lectines. Par exemple, après séparation du complexe TAC-

lectine et de la lectine marquée non transformée, on peut déterminer la quantité de complexe TAC-lectine marquée ou de lectine marquée non transformée en choisissant un support approprié pour une enzyme, ce support pouvant être analysé par une méthode calorimétrique ou fluorimétrique et en déterminant l'activité de l'enzyme lorsque la lectine est marquée avec celle-ci; en déterminant l'intensité de fluorescence lorsque la lectine est marquée avec une substance fluorescente;ou en déterminant la radioactivité lorsque la lectine est marquée au moyen d'une substance radioactive. Par exemple, lorsque l'on utilise pour marquer la lectine une enzyme, par exemple une * t2(dextranne réticulé commercialisé par la Société PHARMACIA A.B.)

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peroxydase, on ajoute goutte à goutte une quantité prédéterminée du mélange de réaction sur la surface du gel dans un tube à essai et on laisse reposer au voisinage de la température ambiante, de préférence à 4250C, pendant 1 à 48 h. On ajoute ensuite au mélange de réaction ainsi traité une quantité donnée d'un substrat convenable pour l'enzyme (par exemple peroxyde d'hydrogène) pour effectuer la réaction enzymatique, puis on l'arrête après une durée appropriée et on mesure la densité optique du mélange résultant, si nécessaire,

en utilisant un colorant ou un composé chromogène (par exemple o-

phénylènediamine). Ou bien,lorsque l'on utilise une substance

fluorescente pour marquer la lectine, on ajoute une quantité pré-

déterminée de diluant, tel qu'une solution tampon, au mélange de réaction sur le gel après incubation et on mesure l'intensité de

fluorescence du mélange résultant.

Un mode opératoire particulièrement convenable pour mettre en oeuvre le procédé de l'invention utilise un nécessaire pour la détermination des TAG dans une humeur de l'organisme, telle

que plasma ou sérum. Ce nécessaire peut comprendre un réactif conte-

nant une lectine végétaletelle qu'un agent agglutinant spécifique des TAG. Le réactif lectine peut également contenir un stabilisant et/ou un agent conservateur pour la lectine, tel que des protéines ayant

une faible teneur en sucre, par exemple la sérum-albumine de boeuf.

Dans un mode de mise en oeuvre préféré, cette lectine végétale peut être lyophilisée et le nécessaire peut également comporter un réactif de reconstitution contenant un solvant aqueux ou miscible avec l'eau (pH environ 6 à 7,8, de préférence 7 à 7,2). Lés réactifs peuvent facultativement contenir aussi des substances tampons pour maintenir le système réactif reconstitué à un pH réglé et/ou des stabilisants pour éviter la détérioration de la substance avant l'emploi. Bien

que les substances tampons ne soient pas considérées comme un compo-

sant essentiel des réactifs du nécessaire, on utilise de préférence un pH d'environ 6 à 7,8, en particulier de 7 à 7,2 dans la mise en oeuvre du procédé de l'invention. Le réactif de reconstitution peut de préférence contenir de l'eau comme solvant. Par exemple, on peut

utiliser comme agent de reconstitution une solution de sérum physio-

logique, une solution tampo n au phosphate, etc. En outre, on peut

ajouter un solvant miscible avec l'eau qui ne gêne pas la réaction.

Comme indiqué précédemment, on peut déter-

miner avantageusement selon l'invention la teneur en TAG dans un échantillon d'humeur de l'organisme. En outre, l'invention qui permet de reconnaître les liaisons glucosidiques associées aux tumeurs peut être largement appliquée à divers cancers ou tumeurs, par rapport aux procédés ou systèmes classiques utilisant l'antigénicité

et reconnaissant principalement la portion protéine des glucopro-

téines telles que CEA, i1-foetoprotéine, etc., et peut s'appliquer avec facilité au diagnostic de n'importe quels cancers ou tumeurs, tels que cancer de l'estomac, cancer du sein, cancer du côlon, cancer du rectum, cancer de l'ovaire, cancer de la cavité buccale, cancer de la langue, cancer du larynx, cancer de la prostate, liposarcome,

mélanome malin, lymphome malin, sarcome primaire de l'estomac, hépa-

tome, etc., dans leurs stades préliminaires ou avancés, et l'invention est donc très utile pour la déction des cancers à leurs stades initiaux. Les exemples suivants illustrent l'invention

sans toutefois en limiter la portée.

Dans ces exemples, les parties et pourcentages

s'entendent tous en poids sauf indication contraire.

EXEMPLE 1

Détermination utilisant la réaction d'inhibition de l'agglutination des cellules sanguines (i) Pré2aration de l'échantillon d'essai On recueille du sang chez chacun de sept patients atteints de cancer de l'estomac, quatre patients atteints de cancer du poumon, trois patientes atteintes de cancer du sein et des malades ayant chacun un cancer du côlon, un cancer du rectum, un cancer de l'ovaire, un cancer de la cavité buccale, un cancer de la langue, un cancer du larynx, un cancer de l'utérus, un cancer de la prostate, un mélanome malin, un liposarcome, un lymphome malin et un sarcome primaire

de l 'estomac, respectivement, 7 personnes saines et on prépare des échan-

tillons de la manière classique. On ajoute par portions aux échantillons

de plasma une solution aqueuse à 6% d'acide sulfosalicylique en agi-

tant jusqu'à ce que la proportion de l'additif au plasma soit de l:1en

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volume. Après avoir agité suffisamment, on centrifuge le mélange à 30003500 tr/min pendant 10 min et on dialyse le liquide surnageant avec l'eau et une solution tampon au phosphate 0315M pendant 24 h pour préparer l'échantillon d'essai; (ii) DéterminatiQn A chacun des échantillons d'essai obtenus en (i) ci-dessus, on ajoute un égal volume d'une solution tampon au

phosphate 0,15M contenant en dissolution 0,8 y/ml de lectine d'ara-

chide (produite par la société E.Y. LABORATORIES Inc.) et on fait réagir le mélange en agitant à 20-370C pendant 30 min. On dilue le mélange de réaction par une solution tampon au phosphate 0,15M pour obtenir une série de dilutions doubles que l'on place chacune sur

une plaque en V à raison de 50 él et on mélange avec 50 p1 d'érythro-

cytes de lapin (1.10 à 2.108 cellules/ml) en agitant. Après avoir

laissé la dilution reposer à 37oC pendant 1 h. on observe l'agglutina-

tion des érythrocytes dans chaque dilution. La valeur de la dilution maximale à laquelle l'agglutination se produit encore est définie

comme indice d'agglutination et Vrévaluation est effectuée en uti-

lisant cette valeur. Les résutats obtenus sont indiqués dans le

tableau ci-après.

(iii) Observations Comme il ressort clairement des résultats

indiqués dans le tableau ci-après, toutes les personnes saines pré-

sentent un indice d'agglutination de 128 ou plus, tandis que les patients atteints de cancer présentent un indice'd'agglutination beaucoup plus faible que les patients sains. Six des sept patients atteints de cancer de l'estomac présentent un indice d'agglutination de 8 ou moins et le reste un indice de 32. Lesquatre patients ayant un cancer du poumon présentent un indice d'agglutination de 1. En ce qui concerne les autres cancers, presque tous les patients ont des indices d'agglutination de 8 ou moins à l'exception d'un indice de 32 observé chez une patiente atteinte de cancer de l'utérus et un patient

ai-teint de sarcome primaire de l'estomac.

Comme indiqué ci-dessus, l'indice d'agglutina-

tion observé chez les patients ayant une tumeur maligne ou un cancer est toujours de 32 ou moins, tandis que celui des personnes saines est

de i28 ou plus.

Le procédé de l'invention est donc efficace pour déterminer la teneur en TAG dans un échantillon d'humeur de l'organisme à l'extérieur de l'organisme et peut être utile pour le

diagnostic de tumeurs malignes ou cancers divers.

EXEMPLE 2

Détermination utilisant le complexe enzyme-lectine marquee Etape de référence: (i) Activation de la peroxydase

A 1 ml d'une solution aqueuse d'hydrogéno-

carbonate de sodium 0,3M dans laquelle on a dissous 5 mg de peroxydase dérivée du raifort, on ajoute 0,1 ml de solution éthanolique de fluorodinitrobenzène O, 1M et on agite doucement le mélange pendant 1 h à la température ambiante. On ajoute ensuite 1 ml de solution aqueuse de NaIO4 0,06M au mélange que l'on agite doucement à la

température ambiante pendant 30 min. On agite encore le mélange résul-

tant avec 1 ml de solution aqueuse d'éthylêneglycol O,1M et on agite doucement à la température ambiante pendant 1 h, puis on dialyse le

mélange de réaction avec une solution tampon acide carbonique-hydro-

génocarbonate de sodium O,lM (pH 9,5) à 4 C pendant un jour, pour

obtenir une préparation de peroxydase activée.

(ii) Maruagede la lectine.yar la.peroxydase On dissout 5 mg de lectine (lectine d'arachide) dans 3 ml de la préparation de peroxydase obtenue en (i) ci-dessus et on agite doucement le mélange à la température ambiante pendant 2 à 3 h pour le laisser réagir. Après addition de 5 mg de NaBH4, on laisse reposer le mélange de réaction à 4 C pendant 3 h et on dialyse la solution résultante avec une-solution au tampon tris-HCl O,1M (pH 7,4) pendant un jour, puis on la soumet à la filtration sur gel en utilisant

la chromatographie sur colonne de gel de Sephadex G 150 (éluant: solu-

tion tampon tris-HCl 0,1M à pH 7,4). On mesure les densités optiques

(D280 et D403) de chaque fraction obtenue et on recueille les frac-

tions dont les pics de D280 et D403 se chevauchent.

(iii) Prga ration.du.sel.d'agaro se On met en suspension de l'agarose (produite

par la socidté Iwai Kagaku Co., Ltd.) dans une solution tampon tris-

HCOl O,01M (pH 7,5) a raison de 1 % en poids et on chauffe la suspen-

sion à- 70-80 C pour la dissoudre, On ajoute à cette solution 0,01% en volume de thimérosal et on verse la solution résultante dans des tubes à essais à raison de i ml par tube, puis on laisse reposer à

la température ambiante pour préparer un gel d'agarose à 1 % en poids.

EXEMPLE 2-1

Méthode au polyéthylèneglycol (i) Pré2aration de l'échantillon d'essai

On prélève 5 ml de sang chez chacun de vingt-

cinq patients atteints de cancer, deux patients atteints de maladies autresque le cancer et vingt-trois personnes saines, en utilisant une seringue traitée à l'héparine(500 unités), et on centrifuge à 2000tr/min

pendant 10 min. On utilise comme échantillon d'essai le liquide sur-

nageant résultant (plasma).

(ii) Détermination On place l'échantillon d'essai préparé en (i) cidessus dans deux tubes à essais à raison de 200 P 1 par tube et on ajoute à chacun 50 ml de la préparation de lectine marquée à la peroxydase contenant 3,5 y/ml de lectine dans une solution tampon tris-HCl (pHli environ 7,5) préparée dans l'étape de référence de l'exemple 2. Après avoir agité légèrement, on laisse reposer le mélange à 20-30 C pendant 1 h pour le laisser réagir. On ajoute ensuite à l'un des tubes à essaYs250 /ul d'une solution de polyéthylèneglycol (poids moléculaire 6000) a 8 % en poids par volume dans une solution tampon tris-HCl 0,lM et on agite doucement le mélange pour former

l'échantillon A, et on ajoute à l'autre tube à essais 250 /ul de solu-

tion tampon tris-HCl à 0,1 M et on agite doucement le mélange pour former l'échantillon B. On centrifuge les deux échantillons A et B pendant 40 à 60 min en utilisant un rotor du type "swing" à 1000 G après avoir laissé reposer l'échantillon à 20-30 C pendant 30 t 60 min pour laisser réagir. On recueille 50 /ul du liquide surnageant résul-

tant et on ajoute à 2 ml de solution de sérum physiologique préparée précédemment. Apres avoir agité suffisamment, on mélange avec 500 1ul d'une solution de substrat consistant en solution de tampon au citrate 0, IM, orthophénylènediamine (concentration finale 6 % en poids) et 0,1 % en poids de peroxyde d'hydrogène et on fait réagir à 20-30'C pendant 30 min à l'obscurité. La solution de substrat est préparée au

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préalable et sotockée à 4 C, ce qui est préférable. Ensuite, on ajoute 1 ml d'acide chlorhydrique 2N au mélange de réaction pour arrêter

la réaction et on mesure la couleur de l'échantillon par spectrophoto-

métrie et on l'exprime par sa densité optique à 492 nm.

La figure 1 annexée représente la quantité de complexe TAG-lectine définie comme la différence (c) entre la densité optique (a) de l'échantillon A et la densité optique (b) de l'échantillon B, le symbole O présentant les personnes saines et les numéros (1) à (27) désignant les patients suivants: (1) et (18) cancer de l'estomac, (2), (6), (9), (16) et (17) cancer du poumon, (3), (5), (7), (8) et (13) cancer de l'estomac (stade préliminaire), (4) et (14) cancer progressif de l'estomac, (10) défaillance cardiaque, (11) lymphadénite, (12) cancer du côlon avec métastaseshépatiques,

(15) cancer de l'utérus avec métastases pulmonaires, (19) m81e hyda-

tiforme, (20) cancer du colon, (21) cancer de l'utérus, (22) et (26) cancer de l'ovaire, (23) cancer du rectum, (24) cancer de la prostate,

(25) cancer de l'urètre et (27) hépatome.

A partir des résultats indiqués dans la figure 1, on peut voir que les échantillons présentant une valeur (c) supérieure à celle observée dans les échantillons prélevés sur les personnes saines contiennent des quantités de TAG supérieures à celles des échantillons des personnes saines. Ceci suggère fortement que les

personnes ayant des valeurs (c) élevées présentent des cellules tumo-

rales ou cancéreuses.

EXEMPLE 2-2

Méthode par filtration sur gel (i) On recueille du sang chez quatorze patients

atteints de cancer et huit personnes saines et on prépare des échan-

tillon d'essai de la même manière qu'à l'exemple 2.

(ii) Détermination On mélange 5 /ul de dilution de l'échantillon d'essai qui a été préparé en (i) ci-dessus et dilué 104 fois par la solution H consistant en eau distillée contenant en dissolution 8 %

de chlorure de sodium, 0,4 % de chlorure de potassium, 0,05 % d'hydro-

génophosphate de sodium, 0,06 % de dihydrogénophosphate de potassium, 0, 05 % de sulfate de magnésium, 0,05 %7. de chlorure de magnésium, 0,1 % de chlorure de calcium et 0,1 % de glucose, avec 50 l1 de la préparation de lectine marquée à la peroxydase qui a été préparée à l'étape de référence de l'exemple 2, diluée 1OX par la solution

tampor- au phosphate O,IM (pH 7,4) et incubée pendant 15 min au bain-

marie à 23 C. On incube le mélange résultant pendant 15 min à 230C puis on l'applique doucement sur la surface d'un gel d'agarose préparé par la méthode de l'étape de référence de l'exemple 2. Après incubation du tube à essais contenant le gel dans un bain-marie à 230C pendant 1 h, on ajoute 2 ml de solution tampon au phosphate 0,1M (pH environ 7,4) au gel d'agarose que l'on agite ensuite. On transvase immédiatement le liquide surnageant dans un tube à essai propre auquel

on ajoute ensuite 400,ul de la solution de substrat pour la peroxy-

dase préparée dans l'étape de référence de l'exemple 2. Après avoir agité suffisamment, on laisse reposer le mélange à la température ambiante pendant 15 min pour le faire réagir. On arrête la réaction

enzymatique avec 1 ml d'acide chlorhydrique IN et on agite suffisam-

ment le mélange de réaction en utilisant un "thermomixeur" ou un dispositif analogue. On mesure la densité optique à 492 nm du mélange ainsi traité en utilisant un spectrophotomètre. On utilise cbmme témoin un mélange de 400 ml de la solution de substrat et 1 ml d'acide chlorhydrique IN. Les valeurs de densité optique obtenues sont traitées de la même manière qu'à l'exemple 2-1 et la quantité calculée de TAG- lectine est représentée à la figure 2 dans laquelle le symbole O représente les personnes saines et les numéros (1) à (10) indiquent

les patients suivants: (1) cancer de l'estomac, (2) môle hydati-

forme, (3) cancer du côlon, ( 4) cancer de l'utérus, (5) cancer de l'ovaire, (6) cancer du rectum, (7) cancer de la prostate, (8) cancer

de l'urètre, (9) hépatome et (10) cancer du sein.

Comme il ressort clairement des résultats indiqués à la figure 2, il y a une différence remarquable des teneurs de TAG dans les humeurs de l'organisme entre les personnes saines et

les patients atteints de divers cancers.

L'invention se prête à l'application pratique dans les laboratoires cliniques dans la détermination des teneurs en TAG dans les humeurs de l'organisme, telles que sérum sanguin ou plasma. Bien entendu, diverses modifications peuvent être apportées par l'homme de ltart aux procédds qui viennent d'être décrits à titre d'exemples nonlimitatifs, sans sortir du cadre de l'invention.

TABLEAU

j Indice Les ions d'agglutination

I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII XIV XV XVI}

1024 ++

512 ++

128 Hi i

64 -------------- ---- ------------------------------ --------_ --....------------...------------

32 + + +

8 ++++i + + +

4 + +

1 111 + 111fi + + + + + + personne saine cancer de l'estomac cancer du sein cancer du poumon cancer du côlon VI cancer du rectum VII cancer de l'ovaire VIII cancer de la cavité buccale IX cancer de la langue X cancer du larynx XI cancer de l'utérus XII cancer de la prostate XIII liposarcome XIV mélanome malin XV lymphome malin XVI sarcome primaire de l'estomac Notes:I II III IV V o' u1 on o' as-

24 6 1256

R E V E N D I CATIONS

1. Procédé de diagnostic du cancer pa détermina-

tion de la teneur en substance contenant des liaisons glucosidiques

associées aux tumeurs (TAG) dans un échantillon d'humeur de l'orga-

nisme, caractérisé en ce que l'on fait réagir les TAG dans un échan-

tillon de l'humeur de l'organisme avec une lectine pour former un complexe TAG-lectine et on mesure la quantité de complexe TAG-lectine

ou la lectine n'ayant pas réagi.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en outre en ce que l'on sépare les TAG dudit échantillon d'humeur de

l'organisme et on fait réagir les TAG séparées avec ladite lectine.

3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé

en ce que l'on utilise une lectine marquée.

4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que ladite lectine marquée est une lectine marquée par une enzyme,

une substance fluorescente ou une substance radioactive.

5. Procédé selon la revendication 3, caractérisé

* en ce que l'on ajoute à ladite humeur de l'organisme une protéine pro-

tectrice. 6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé

en ce que ladite humeur de l'organisme est du sang, une humeur tissu-

laire, la lymphe, l'hydrothorax, un acide liquide amniotique, le suc gastrique, l'urine, le suc pancréatique, le liquide cérébrospinal ou

la salive.

7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que ladite humeur de l'organisme est le sérum sanguin ou le plat sanguin. 8. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la réaction est effectuée à 45 C ou moins pendant au moins min. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé

en ce que la réaction est effectuée à 4-40'C.

10. Procédé selon la revendication 8, caractérisé

en ce que la réaction est effectuée à environ 20-40 C.

11. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que la réaction est effectuée pendant 60 à 90 min. sma w 12. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite lectine est une lectine qui se fixe spécifiquement

sur la liaison galactose-(Pl---3 ou Pl--4)-N-acétylglucosamine.

13. Procédé selon la revendication 12, caracté-

risé en ce que ladite lectine est la lectine d'arachide ou la lectine

de graine de ricin.

14. Procédé selon la revendication 2, caractérisé

en ce que la quantité de ladite lectine n'ayant pas réagi est déter-

minée par agglutination de ladite lectine n'ayant pas réagi.

15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé

en ce que la lectine n'ayant pas réagi est agglutinée avec une gluco-

protéine contenant une liaison galactose-(l--/3 ou D1--4)-N-acétyl-

glucosamine terminale ou du Sephadex2oudes billes de verre revêtues

par ladite glucoprotéine.

16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que ladite glucoprotéine consiste en érythrocytes de lapin ou

en érythrocytes de mouton traités à la neuraminidase.

17. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que ladite enzyme est la glucoamylase, la glucose-oxydase, la peroxydase, la phosphatase alcaline ou l'héméoctapeptide ou un

fragment actif de celui-ci.

18. Procédé selon la revendication 4, caractérisé

en ce que ladite substance fluorescente est la fluorescéine, l'hydro-

génothiocyanate de fluorescéine ou le chlorure de dansyle.

19. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que ladite substance radioactive est l'iode radioactif ou le tritium. 20. Procédé selon la revendication 17, caractérisé

en ce que ladite enzyme est la peroxydase.

21. Procédé pour le diagnostic d'un cancer, carac-

térisé en ce que l'on détermine la teneur en TAG dans un échantillon d'humeur de l'organisme selon le procédé de la revendication 1, et on compare la teneur en TAG obtenue avec celle observée chez des personnes saines. (dextranne réticulé commercialisé par la Société PHARMACIA A.B.)

2 4 6 1 2 5 6

22, Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on sépare une fraction de TAG de l'humeur de l'organisme, on fait réagir l'humeur avec la lectine marquée ou non marquée, on sépare la lectine n'ayant pas réagi du mélange de réaction et on mesure la quantité de lectine n'ayant pas réagi ou de lectine ayant

réagi avec les TAG.

23. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on fait réagir une humeur de l'organisme avec la lectine marquée ou non marquée, on sépare la lectine ayant réagi de la lectine n'ayant pas réagi sur un gel, et on mesure la quantité de lectine a 'ant

réagi ou n'ayant pas réagi.

24. Nécessaire pour la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend une lectine

comme agent agglutinant spécifique du TAG.

25. Nécessaire selon la revendication 24, caracté-

risé en ce que ladite lectine a été lyophilisée et en ce qu'il contient en outre un réactif de reconstitution contenant un solvant aqueux ou

miscible à l'eau.

26. Nécessaire selon la revendication 24, caracté-

risé en ce que ladite lectine et une lectine d'arachide.