FR2559267A1

FR2559267A1 - Procede pour la determination de la teneur en glucose de proteines glycosylees non-enzymatiquement et un kit de reactifs pour la realisation de ce procede

Info

Publication number: FR2559267A1
Application number: FR8401745A
Authority: FR
Inventors: Bela Szajani; Judit Szelenyi; Janos Foldi; Margit Horanyi
Original assignee: Reanal Finomvegyszergyar Rt
Current assignee: Reanal Finomvegyszergyar Rt
Priority date: 1982-10-01
Filing date: 1984-02-06
Publication date: 1985-08-09
Also published as: CH663094A5; HU32919A; HU186976B; FR2559267B1; RO90093A; DE3414379A1

Abstract

LA PRESENTE INVENTION EST RELATIVE A UN PROCEDE POUR LA DETERMINATION DE LA TENEUR EN GLUCOSE DE PROTEINES GLYCOSYLEES. CE PROCEDE SE CARACTERISE EN CE QU'ON MET EN SOLUTION DES PROTEINES QUI SONT INCLUSES DANS DES CELLULES OU INSOLUBLES DANS L'EAU, A L'AIDE D'UN DETERGENT IONIQUE OU NON IONIQUE, ON DETACHE LE GLUCOSE SOUS LA FORME DE 5-HYDROXYMETHYL-FURFURAL SOUS UNE SURPRESSION EN UTILISANT UN ACIDE AU MOINS 1N, ON DEPROTEINISE LE MELANGE REACTIONNEL, ON CONDENSE LE 5-HYDROXYMETHYL-FURFURAL AVEC UN COMPOSE ORGANIQUE QUI FORME UN PRODUIT COLORE AVEC L'ALDEHYDE ET ENFIN, ON DETERMINE SPECTROPHOTOMETRIQUEMENT LA CONCENTRATION DU PRODUIT AINSI OBTENU. APPLICATION A LA DETERMINATION SPECTROPHOTOMETRIQUE DE LA TENEUR EN GLUCOSE DE PROTEINES GLYCOSYLEES NON ENZYMATIQUEMENT.

Description

La présente invention est relative a un procédé pour la détermination spectrophotométrique de la teneur en glucose de protéines glycosylées non-enzymatiquement et à un kit de réactifs pour la réalisation de ce procédé.

En fonction de la teneur en glucose du milieu de l'environnement, des protéines fixent de façon aspécifique, des quantités plus petites ou plus grandes de glucose sur leurs groupes réactifs - en particulier par le groupe amino du N-terminal et le groupe s-amino des chaînes lisyle. Cette procédure qui a lieu à la fois in vivo et in vitro, est très importante parce que certaines propriétés des protéines glycosylées (par exemple, l'activité fonctionnelle, des caractéristiques immunologiques et la stabilité) peuvent changer. L'importance de la procédure in vivo est due principalement à la glycosylation non-enzymatique augmentée, apparaissant dans le Diabetes mellitus, qui joue un rôle important dans la formation des complications lors de l'étape ultérieure de cette maladie.La vérification de la procédure in vitro est aussi importante du point de vue du stockage et de la réutilisation des liquides d'origine biologique (par exemple, du sang, du lait, etc..).

Lors du traitement d'individus souffrant du Diabetes mellitus et dans la prophylaxie des complications chroniques de cette maladie, le controle du degré d'ajustement du métabolisme des hydrates de carbone est d'importance fondamentale.

La mesure du taux reel du sucre dans le sang, est en fait fortement influencée par le metabolisme quotidien des hydrates de carbone et cette méthode de détermination ne donne donc pas d'informations sures concernant le métabolisme des hydrates de carbone de l'organisme. La méthode ne fournit pas de données sur les caractéristiques de la période précédant le test non plus. Depuis plusieurs années, on. a accepté comme étant une méthode de contrôle convenable, la détermination de la quantité d'hémoglobine glycosylee sur un certain site (le N-terminal de la chaîne ss) c'est-à-dire l'hémoglobine AIc (dénommée ensuite HbAIc) - ou la détermination de la quantité des composants de l'hémoglobine dits rapides.

L'HbAIC et les autres hémoglobines glycosylées sont formées pendant la glycosylation post-synthétique ; leur quantité est proportionnelle à la teneur en glucose du sang.

Ces composants sont constamment formés pendant la durée de vie des érythrocytes et leur quantité reflète ainsi la valeur moyenne du métabolisme des hydrates de carbone d'environ trois mois. Cette dernière constitue le principal intérêt diagnostique du test de détermination.

Les méthodes connues sont basées particulièrement sur la détermination des composants d'hémoglobine glycosylée, comprenant HbAIc et elles ne conviennent pas pour la détermination d'autres protéines glycosylées (L.A.

Trivelli, H.M. Ranny, H.T. Lai : The England Jour. of Med.

1971, Volume 284, page 353). La majorité de ces méthodes consiste en la séparation chromatographique de l'hémoglobine glycosylée et pour cette raison, ce n'est pas la quantité totale du glucose fixé à l'hémoglobine qui est donnée, mais plutôt la valeur en pourcentage, étalonnée pour l'hémoglobine uniquement glycosylée sur le groupe amino du
N-terminal de la chaine ss (HbAIC) qui est indiquée. Les kits de réactifs disponibles industriellement ne conviennent également que pour l'objet spécial ci-dessus, c'est-à-dire pour la détermination de l'HbAic et ils sont très sensibles à certains effets de l'environnement (par exemple, la température du laboratoire).La méthode calorimétrique mise au point par Flückiger et Winterhalter n EBS Letters 71, 356 (1976)i est plus simple que les méthodes chromatographiques et elle peut être utilisée pour faire une série de mesures. L'essence de cette méthode est que le glucose fixé sur les groupes aminés des protéines par une réaction de condensation et soumis à un réarrangement d'Amadori,est détaché sous la forme de 5-hydroxyméthyl-furfural par un traitement thermique acide et que le 5-hydroxyméthyl-furfural ainsi formé est déterminé par de l'acide thiobarbiturique. Dans cette forme, la méthode ne convient que pour la détermination du glucose attaché aux protéines solubles dans l'eau.Dans le procédé d'origine, la détermination est étalonnée en fonction du résultat du procédé chromatographique et il a donc exclusivement pour but la détermination d'HbAIC. On a constaté de façon surprenante, que cette méthode peut être étendue à des protéines qui sont incluses dans les cellules, ou bien insolubles dans l'eau, si les protéines sont préalablement mises en solution avec l'aide d'un détergent dilué, ionique ou non-ionique.

Cette constatation ci-dessus permet la détermination de la teneur en glucose de protéines glycosylées autres que l'hémoglobine.

De plus, l'évaluation du procédé conforme à la présente invention n'est pas relative à l'HbAIC chromatographique, mais exclusivement le coefficient d'extinction et le rapport de la formation et de la décomposition de 1; teneur en glucose sont pris en considération, quelle que soit la protéine. Le procédé peut donc être étendu à toutes les protéines et la quantité du glucose total fixé à la protéine est déterminée.

Conformément un autre aspect de la présente invention, on utilise une concentration d'acide supérieure a la valeur maximum habituelle de 0,6 molaire, en association avec un traitement thermique effectué sous une surpression.

Une hydrolyse acide peut être réalisée à laide d un acide ou d'un mélange d'acides organiques ou minéraux, éventuellement en présence d'un catalyseur. En tant qu'acide, on peut utiliser de préférence l'acide oxalique, bien qusen tant que mélange d'acides, un mélange d'acide oxalique et d'acide acétique ou un mélange d'acide oxalique et d'acide sulfurique puissent être employés. Comme catalyseur de l'hydro- lyse, on peut utiliser, par exemple, gC92- Cet aspect, d'un côté raccourcit la durée de la détermination et d'un autre coté, fournit des résultats facilement reproductibles.

On a aussi constaté que l'acide trichloroacétique, jusqu'à maintenant uniquement utilisé dans les méthodes connues pour effectuer la déprotéination, peut être de préférence remplacé par l'acide sulfosalicylique. Ce réactif peut être plus facilement manipulé et son utilisation présente donc également des avantages technologiques.

On a aussi constaté que l'acide thiobarbiturique, qui est exclusivement utilisé comme réactif dans les déterminations colorimétriques connues, peut être remplacé par un quelconque composé aromatique qui est capable de se condenser avec le groupe aldéhyde du 5-hydroxy-méthylfurfural formé par la décomposition acide et fournit ainsi un produit coloré en formant un système à double liaison prolongé (électrons-n délocalisés). L'acide barbiturique se révèle le plus favorable.

On a constaté également que, dans le cas ou la révélation est effectuée avec l'acide thiobarbiturique, la précision de la mesure peut être accrue par l'accomplissement de l'évaluation à 360 nm.

Conformément à la présente invention, on fournit un procédé convenable pour la détermination en série de la teneur totale en glucose fixé sur une quelconque protéine glycosylée non-enzymatiquement. Conformément à la présente invention, des protéines incluses dans des cellules ou insolubles dans l'eau, sont mises en solution à l'aide d'un détergent ionique ou non-ionique, le glucose est éliminé à partir des protéines dissoutes par une hydrolyse acide sous une surpression, sous la forme de 5-hydroxyméthyifurfural, après déprotéination, l'aldéhyde est converti en un produit coloré par condensation avec un composé organique convenable et la concentration de produit coloré est déterminée de façon spectrophotométrique.

Conformément à un autre aspect de la présente invention, elle fournit un kit qui permet la détermination en série, avec une précision toujours identique.

La composition des kits conformes à la présente invention est variable, parce que la même reaction chimique peut être effectué avec différents réactifs également.

Au cours de ses expériences, la demanderesse a étudié d'abord l'efficacité de la réaction, 11 aptitude des réactifs à être maniés et les facteurs économiques ont aussi été pris en considération.

On a ainsi constaté qu'un kit convenable pour une détermination, comprend 2 mi de dodécylsulfate de sodium à 0,1 t comme détergent, 1 ml d'acide oxalique 1 N comme agent hydrolysant, 1 ml d'acide sulfosalicylique comme agent deprotéinisant et 0,5 ml d'acide barbiturique 0,5 molaire comme composé formant un produit coloré.

Le meilleur mode de réalisation du kit conforme à la presente invention comprend, pour 50 mesures
100 ml de dodécylsulfate de sodium à 0,1 %,
50 ml d'acide oxalique 1N,
. 50 ml d'acide sulfosalicylique à 20 %,
. 25 ml d'acide barbiturique 0,05 molaire.

La solution hémolysante utilisée dans le kit peut comprendre, à la place du dodécylsulfate de sodium, d'autres détergents également (par exemple, du Triton X 100)
L'acide oxalique peut être remplacé par de l'acide acétique, sulfurique et d'autres acides organiques 2 N. La protéine peut être éliminée par l'acide trichloroacétique. Dans la reaction colorée, l'acide barbiturique peut être remplacé par l'acide thiobarbiturique ou d'autres composés qui sont capables de former un produit coloré avec l'hydroxyméthyl-furfural.

Dans le kit conforme à la présente invention, présentant la composition la plus avantageuse, le rapport des réactifs requis pour la détermination de la liaison glucose à la protéine est le suivant, par rapport à une partie de protéine dodécylsulfate de sodium : acide oxalique : acide sulfosalicylique : acide barbiturique = 0,02 : 0,9 : 2,00 : 0,04.

Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre.

L'invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention.

I1 doit être bien entendu, toutefois, que ces exemoles de mise en oeuvre sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.

Exemple 1
Détermination de la teneur en glucose de l'hémo- globine glycosylée non-enzymatiquement.

a) 3 ml de sang hépariné sont lavés à trois reprises avec des portions de 10 ml de solution de chlorure de sodium physiologique, puis, 1.ml des erythrocytes lavés est additioné de 2 ml d'une solution de dodécylsulfate de sodium à 0,1 %. La concentration en hémoglobine du produit hémolysé ainsi obtenu, est déterminé, puis 2 ml de celui-ci sont additionnés de 1 ml d'acide oxalique 1 N et le melange est soumis à un traitement thermique à 112-1150C, sous 1,6 atm,, pendant 2,5 heures. On ajoute goutte à goutte au produit hydrolysé, 1 ml d'une solution d'acide sulfosalicylique à 20 % (température de 400C! sous agitation vigoureuse, puis la suspension formée est centrifugée.L'extinction du surnageant est lue à 398 nm (valeur E1), puis 2 ml de celui-ci sont additionnés de 0,5 ml d'une solution d'acide barbiturique 0,05 molaire et le mélange est incubé à 400C pendant 40 minutes.

Le mélange est refroidi et l'extinction est lue dans les 10 minutes à 398 nm par rapport à une solution témoin préparée sans hémolysat (valeur E2).

La teneur en glucose (G) est calculée par la formule suivante
E2(398) - 0,8 E1(398) - 0,20
G = 2,40 - x 10-2 mole de glu
(F) cose/100 ml d'hé-
moglobine.

(F) est la concentration d'hémoglobine en mole/P. le constant comprend le coefficient d'extinction molaire de l'acide barbiturique, le facteur de correction de la perte de 5-hydroxyméthyl-furfural apparaissant par suite de la décomposition acide et aussi la dilution.

Si la concentration d'hémoglobine est déterminée par la méthode de Drabkin par addition de 0,02 ml d'hémo- lysat à 5 ml de réactif et mesure de l'extinction a 540 nm (E540), la formule est la suivante
E2(398) - 0,8 E1(398) - 0,20
G = 4,53 - mole de glucose/
(E540) 100 ml d'hémoglobine
Dans le cas de l'hémoglobine, la valeur moyenne s'élève à 7,5-12, moles de glucose/100 mi d'hémoglobine.

b) On répète le procédé a), sau que pour déterminer le glucose, on utilise de l'acide thiobarbitu- rique 0,05 molaire et qe i on suit la réaction à 443 nm.

Les formules suivantes sont utilisées pour l'évaluation
E2(443) - 0,8 E,(4A3) - 0,14
G = 1,5 x 10-2 mole de glu
(F) cose/100 ml
d'hémoglobine
E2(443) - 0,8 E1(443) - 0,14
G = 2,83 mole de glucose/
(E540) 100 mole d'hémo-
globine
c) On répète le procédé a), sauf qu'on suit la réaction à la valeur plus sensible de 360 nm.

Dans ce cas, les deux formules suivantes sont utilisées
E2(360) - 0,8 E1(360) - 0,14
G = 1,05 x 10 -mole de glu-
(F) cose/100 mole
d'hémoglobine ou E2(360) @@@ E1(360) - 0,14
G = 1,98 mole de glucose/
(E540) 100 mole d'hémoglo
hine
Comme la teneur totale en glucose fixé à l'hémoglobine est déterminée conformément à la méthode cidessus, la valeur obtenue est supérieure à la valeur d'HbAIc utilisée à l'échelle internationale recalculée ou déterminée de façon chromatographique. Le facteur de transposition entre les deux méthodes, est le suivant
G/HbAIc = 1,8
Exemple 2
Détermination des protéines glycosylées nonenzymatiquement de la membrane d'érythrocyte.

a) On lave à trois reprises 10 ml de sang hépariné avec 50 ml d'une solution de chlorure de sodium physiologique, puis on secoue le produit précipité avec un volume huit fois plus grand de solution hémolysante glacée et on laisse reposer pendant 5 minutes. La suspension est centrifugée, le surnageant est décanté et les fractions résiduelles de membrane sont lavées à quatre reprises. La solution hémolysante et la solution de lavage sont préparées selon la procédure décrite dans J. Physiol. 235, 551 (1973).

Dans la membrane dépourvue d'hémoglobine ainsi obtenue, on détermine les protéines et l'on ajuste la concentration de la suspension de membrane à une valeur correspondant à 2,5 mg/ml de protéines. Ensuite, 2,5 ml de fraction de membrane sont additionnés de 2 ml de dodécylsulfate de sodium à 1,0 t et de 1 ml d'acide oxalique 1 N et le melange est soumis à un traitement thermique à 112-1150C, sous pression, pendant 2,5 heures.L'hydrolysat est additionné de 1 ml d'acide sulfosalicylique à 20 % ayant une température de 400C, la suspension ainsi formée est centrifugée, l'extinction du surnageant est lue à 398 nm (valeur E1), puis 2ml de celui-ci sont additionnés de 0,5 mi d'une solution 6,05 molaire d'acide barbiturique et le mélange est incubé pendant 40 minutes, à 40 C. Le mélange est refroidi et llextinc- tion est lue à 398 nm, par rapport à une solution témoin préparée sans fraction de membrane (valeur E2). La teneur en glucose (G) est calculée à l'aide de la formule suivante
E2(398) - 0,8 E1(398) 0,20
G = 2,40 x x 10 mole de
(F) glucose/100 mg
de protéines (F) est la concentration des protéines de la membrane (mg/ml).La constante comprend le coefficient d'extinction molaire du dérivé d'acide barbiturique, le facteur de correction de la perte de 5-hydroxyméthyl-furfural apparaissant par suite de la decomposition acide et aussi la dilution.

b) Les protéines sont traitées et le glucosest déterminé selon la méthode qui est décrite dans la méthode a), sauf que l'on utilise 0,5 ml d'un acide thiobarbiturique 0,05 molaire pour la détermination du dérivé du sucre. La réaction est suivie à 360 et 443 nm, respectivement.

Les formules suivantes sont utilisées pour l'évaluation de la mesure, en fonction de la longueur d'onde
E2(360) - 0,5 E1(360) - 0,14
G = 1,05 x 10 2 mole de
(F) glucose/100 mg de
protéines.

ou
E2 (443) - 0,5 E1(443) - 0,14
G = 1,50 x 10 2 mole de
(F) glucose/100 mg
de protéines.

Exemple 3
Détermination de la glycosylation des protéines du plasma.

Le plasma est séparé du sang. La teneur en protéines du plasma sanguin est déterminée et la concentration en protéines est ajustée à la valeur de 10 mg/ml.

2 ml du mélange sont additionnés de 1 ml d'acide oxalique 1 N et le mélange est soumis à un traitement thermique à 1121150C sous pression, pendant 2,5 heures. L'hydrolysat est additionné de 1 ml d'une solution aqueuse 0,6 molaire d'acide trichloroacétique. La suspension ainsi formée est centrifugée, l'extinction du surnageant est lue à 398 nm (valeur E1), puis 2ml de celui-ci sont additionnés de 0,5 ml d'une solution 0,05 molaire d'acide barbiturique et le mélange est incubé à 400C pendant 40 minutes. Le mélange est refroidi et 11 extinction est lue dans les 10 minutes, à 398 nm, par rapport à une solution témoin préparée sans protéines du plasma (valeur E2).

La teneur en glucose (G) est calculée selon la façon qui est décrite dans l'exemble 1 a).

Par la détermination des protéines du plasma, le dérivé du glucose détaché peut aussi être déterminé à l'aide de la réaction avec de l'acide thiobarbiturique.

Dans ce cas, on ajoute 0,5 ml d'acide thiobarbiturique 0,05 molaire à 2 mi du surnageant. Pour l'évaluation, les valeurs d'extinction sont lues à n43 nm et les formules précédentes sont utilisées.

Exemple 4
Détermination de la teneur en glucose de l'albumine glycosylée non-enzymatiquement.

On sépare le plasma du sang par centrifugation.

Le pH du plasma est ajusté à 6,9 par addition dwune solution 2 molaire d'acide chlorhydrique. Ensuite, on ajoute goutte à goutte, 15 % d'une solution aqueuse à 50 % de polyéthylène glycol et l'on agite le mélange pendant 20 minutes. La suspension est centrifugée, le pH du surnageant est ajusté à 4,6. On ajoute encore 9 % de polyéthylène glycol solide en l'espace d'une heure et l'on agite le mélange pendant 30 minutes supplémentaires. Le produit précipité est séparé par centrifugation et dissous dans quelques gouttes deeau distillée. La solution est appliquée sur une colonne QAL
Sephadex de 20 x 1,6 cm, équilibrée avec un tampon d'acétate (pH 5,2).Le polyéthylène glycol est éliminé par lavage et l'albumine est éluée avec un tampon d'acétate ayant un pH de 4,8. La teneur en protéines de la solution d'albumine est déterminée et 2 mi de celle-ci sont additionnés de 1 ml d'une solution d'acide oxalique 1 N. Le mélange est soumis à un traitement thermique à 112-1150C sous pression, pendant 2,5 heures. L'hydrolysat est additionné de 1 ml d'une solution à 20 % d'acide sulfosalicylique (400C) la suspension ainsi obtenue est centrifugée, l'extinction du surnageant est lue à 398 nm (valeur E1), puis 2 ml de celui-ci sont additionnés de 0,5 ml d'une solution 0,05 molaire d'acide barbiturique et incubés à 40 C pendant 40 minutes.Le mélange est refroidi et l'extinction est lue dans les 10 minutes, par rapport à une solution témoin préparée sans albumine (valeur E2).

La teneur en glucose (G) est calculée avec la formule suivante
E2(398) - 0,8 E1(398) - 0,2
G = 2,40 - x 10- mole de glucose/
(A) 100 mg d'albumine (A) est la concentration d'albumine (en mg/ml).

La constante comprend le coefficient d'extinction molaire du dérivé d'acide barbiturique, le facteur de correction des pertes de 5-hydroxyméthyl-furfural apparaissant par suite de la décomposition acide, ainsi que la dilution.

Exemple 5
Détermination de la glycosylation d'immunoglobulines.

On élimine le plasma à partir du sang dont la coagulation a été inhibée, puis on fait précipiter les immunoglobulines avec du rivanol et on les- purifie par chromatographie sur une colonne QAE-Sephadex.

Dans 2 ml d'une solution à 5 % d'immunoglobulines, on ajoute 1 ml d'un mélange d'acides (acide oxalique 1 N + acide acétique 1 N ou acide oxalique 1 N + acide sulfurique 1 N). L'hydrolyse est effectuée à 1000C pendant une heure et les protéines sont précipitées par addition de 1 ml d'acide sulfosalicylique 0,6 molaire. Le produit précipité ainsi formé est centrifugé à 1500 tpm et 2 ml du surnageant sont additionnés de 0,5 ml de solution, de résorcine 0,054 molaire, de CuSO4, 2.10 3 molaire. (L'extinction de départ du surnageant est déterminée à 405 nm avant addition des réactifs (E1), Le mélange réactionnel est chauffé à 1000C pendant 15 minutes Après refroidissement, l'extinction est à nouveau mesurée à 405 nm (E2).

Teneur en glucose (G) = 37,6 (E2-E1-0,1) mole/ 100 moles.

Exemple 6
Détermination de la glycosylation de l'hémoglobine.

Dans 1 ml d'érythrocytes lavés avec une solution physiologique saline, on ajoute 2 mi de dodécylsulfate de sodium à 0,1 t. La concentration de l'hémolysat est déterminée (Hb), puis 2 ml de celui-ci sont additionnés de 1 mi d'une solution d'acide oxalique 1 N - HgCl2 10 4 molaire et le mélange est laissé reposer à 1000C pendant une heure.

On fait précipiter les protéines avec 1 ml d'acide sulfosalicylique à 20 % et on les élimine par centrifugation.

L'extinction du surnageant est déterminée à 443 nm (E1) 2 ml de celui-ci sont additionnés de 0,5 ml d'acide thiobarbiturique 0,05 molaire. Après incubation à 400C pendant 40 minutes, l'extinction est à nouveau déterminée (E2).

E2-E1 x 0,8-0,1
G = x 10-2 mole/100 moles
Hb (mole/l)
Exemple 7
Procédé rapide pour la détermination de la teneur en glucose d'hémoglobine glycosylée non-enzymatiquement, à basse température.

Du sang dont la coagulation est inhibée est lavé par une solution physiologique saline, jusqu'à ce que le surnageant soit débarassé de protéines. On lave à deux reprises 1 ml du surnageant lavé avec des portions de 2 mi de solution de dodécylsulfate de sodium à 0,1 % et on laisse le mélange se réchauffer. La concentration de la solution d'hémoglobine est déterminée, puis 2 ml de cette solution sont additionnés de 1 ml d'acide sulfurique 0,3 N et de 0,1 ml d'une solution 10 4 molaire de HgC12 et le mélange est laissé reposer à 400C pendant 30 minutes.La teneur en protéines de la solution est précipitée avec 1 ml d'acide sulfosalicylique 0,6 molaire, le produit précipité est séparé par centrifugation à 1500 tpm pendant 10 minutes.

L'extinction du surnageant clair est déterminée à 443 nm (E1). Dans 2 ml de cette solution, on ajoute 0,5 ml d'une solution thiobarbiturique 0,05 molaire et on laisse reposer la solution à 400C pendant 40 minutes. L'extinction est à nouveau déterminée à 443 nm, dans les 10 minutes, après refroidissement de la solution (E2).

La teneur en glucose est calculée à l'aide de la formule suivante
E2 - E1 x 0,8 - 0,06
G = 1,38 10 mole de glucose/100
Hb (mole/l) moles d'Hb
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'^etre décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée de la présente invention.

Claims

REVENDICATIONS

1. Procédé pour la détermination de la teneur en glucose des protéines glycosylées non-enzymatiquement, caractérisé en ce qu'on met en solution des protéines qui sont incluses dans. des cellules ou insolubles dans l'eau, à l'aide d'un détergent ionique ou non-ionique, on détache le glucose sous la forme de 5-hydroxyméthyl-furfural sous une surpression en utilisant un acide au moins 1 N, on déprotéinise le mélange réactionnel, on condense le 5-hydroxyméthyl-furfural avec un composé organique qui forme un produit coloré avec l'aldéhyde et enfin, on détermine spectrophotométriquement la concentration du produit ainsi obtenu.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on utilise du dodécylsulfate de sodium comme détergent.

3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, carac terisé en ce qu'on effectue l'hydrolyse acide avec une solution d'acide oxalique, sous une pression entre 1,2 et 2,0, de préférence entre 1,5 et 1,7atm.

4. Procédé selon la revendication 1 ou 2, carac térisé en ce qu'on effectue l'hydrolyse acide en présence d'un catalyseur.

5. Procédé selon la revendication 1 ou 2, carac térisé en ce qu'on effectue l'hydrolyse acide avec un mélange d'acides.

6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'on utilise l'acide sulgosalicylique pour la déprotéinisation.

7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'on utilise l'acide barbiturique en tant que composé qui forme un produit coloré avec l'aldéhyde.

8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'on effectue la détermination spectrophotométrique à 398 nm.

9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'on utilise du dodécylsulfate de sodium, de l'acide sulfosalicylique et de l'acide barbiturique en un rapport de 0,02 : 0,90 : 2,0 : 0,04 par rapport à l'unité de protéine.