DK159174B - Fremgangsmaade til bestemmelse af direkte og samlet bilirubin samt et hertil egnet middel - Google Patents
Fremgangsmaade til bestemmelse af direkte og samlet bilirubin samt et hertil egnet middel Download PDFInfo
- Publication number
- DK159174B DK159174B DK312883A DK312883A DK159174B DK 159174 B DK159174 B DK 159174B DK 312883 A DK312883 A DK 312883A DK 312883 A DK312883 A DK 312883A DK 159174 B DK159174 B DK 159174B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- bilirubin
- determination
- direct
- solution
- buffer
- Prior art date
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/72—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood pigments, e.g. haemoglobin, bilirubin or other porphyrins; involving occult blood
- G01N33/728—Bilirubin; including biliverdin
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/903—Diazo reactions
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
- Y10T436/145555—Hetero-N
- Y10T436/146666—Bile pigment
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)
- Investigating Or Analyzing Non-Biological Materials By The Use Of Chemical Means (AREA)
- Steering Control In Accordance With Driving Conditions (AREA)
Description
j DK 159174B
Opfindelsen angår en fremgangsmåde til bestemmelse af direkte og samlet bilirubin i legemsvæsker ved at bilirubinet kobles med et diazoniumsalt, og den derved opståede ekstinktionsændring måles på kendt måde og et hertil egnet middel.
5 Bilirubin forekommer i den menneskelige organisme hovedsagelig som vigtigste nedbrydningsprodukt af hæmoglobin. I leveren konjugeres bilirubin delvis med glukuronsyre. Det glu-kuronerede bilirubin betegnes som "direkte" bilirubin. Den med glukuronsyre ikke "konjugerede del benævnes "indirekte" 10 bilirubin. Normalt befinder der sig kun ringe mængder bilirubin i blodet. Normalkoncentrationerne andrager: for direkte bilirubin: indtil 0,25 mg/100 ml serum (- 4,3 ymol/l), 15 . for indirekte bilirubin: indtil 0,75 mg/100 ml serum C - 12,7 ymol/l).
I den sunde organisme udskilles bilirubin fra galden sammen med galdevæsken i tarmen. Denne mekanisme forstyrres ved for-20 skellige sygdomme. Således kan f.eks. glukuronideringssystemet overbelastes ved forøget hæmoglobinnedbrydning, så at forholdet direkte/indirekte bilirubin ændres. Også hos nyfødte er glu-kuronideringskapaciteten underudviklet, hvilket eventuelt fører til forskydninger i forholdet mellem direkte og indirekte 25 bilirubin. Ved levercellebeskadigelser, forstyrrelser ved udstrømning i galdekapillarerne eller ved galdegangslukningen er udskillelsen af bilirubin via galden til tarmen mindsket eller fuldstændigt blokeret. Dette fører til forhøjet bili-rubinkoncentration i blodet. Derved kan såvel den absolutte 30 bilirubinkoncentration som forholdet direkte/indirekte bilirubin påvirkes. Ud fra måling af begge værdier kan man således drage vigtige diagnostiske slutninger om arten og lokalisering af bestemte sygdomme i lever-galde-tarm-kanalen. Bestemmelsen af begge bilirubinfraktioner har derfor fået en særlig be-35 tydning i den medicinske diagnostik. Hertil bestemmes på sædvanlig måde yderligere den samlede mængde bilirubin. Derpå måles det direkte bilirubinindhold. Den indirekte bilirubin-andel viser sig ved forskellen mellem de to værdier.
DK 159174 B
2
De hyppigst udførte bilirubinpåvisningsreaktioner beror på kobling af bilirubin med diazoniumsalte. Ifølge Jendrassik og Cleghorn (Biochem. Z. 289 (1937), side 1) behandles til bestemmelse af det direkte bilirubin 1 ml serum med 0,3 ml af en diazoblanding, som består af 5 g sulfanylsyre, 15 ml koncentreret saltsyre og 0,25 ml 0,5%'ig natriumnitritopløs-5 ning i vand. Det er især ved denne bestemmelsesmetode en u- lempe, at reaktionen skal gennemføres i stærkt surt miljø.
Til bestemmelse af den samlede mængde bilirubin tilsættes prøven til at begynde med med koffein og natriumbenzoat, og først derpå bliver den koblet med diazoteret sulfanylsyre.
10 Tilsætning af koffein og natriumbenzoat har det formål at løsne indirekte bilirubin fra dets binding til albumin og at udelukke forstyrrelser på grund af en uden disse tilsætninger optrædende udfældning af æggehvidestof.
Med disse tilsætningsstoffer kan bestemmelsesreaktionen dog 15 ikke foretages i stærkt surt miljø som ved bestemmelse af det direkte bilirubin, men der må arbejdes i neutralt eller svagt surt miljø. Disse reaktionsbetingelser har dog den ulempe, at der derved med andre, indeholdte stoffer i prøven (f.eks. med phenoler) opstår brunligt farvede biprodukter, der i talrige 20 tilfælde forstyrrer prøven. Også selve reagensopløsningen er ikke stabil over længere tid. Også uden prøve opstår et materiale, der ganske vist er farveløst i surt miljø, men allerede i neutrale omgivelser er gult og i alkaliske rødt.
For at mindske fejl, der kan opstå på grund af disse forstyr-25 reiser, foreslås undertiden meget indviklede skridt. F.eks.
arbejder man ifølge Jendrassik og Cleghorn ved to forskellige bølgelængder, eller det bliver efter afslutning af diazoter-ingsreaktionen overført i svagt sure henholdsvis neutrale omgivelser forud for den egentlige måling af prøvepræparatet 30 i det alkaliske miljø (Jendrassik og Grof, Biochem. Z. 297 (1938), side 81-89).
Alle disse bestemmelsesmetoder er ved udførelsen ubehagelige og upraktiske. Derudover er de på grund af deres talrige trin stadigvæk behæftet med stor unøjagtighed og fejl. Det har 3 derfor ikke manglet på forsøg på at forbedre bestemmelsesmetoderne for direkte og samlet bilirubin.
Det blev f.eks. forsøgt også at overføre bestemmelsen af samlet bilirubin til det stærkt sure miljø. Hertil var det frem 5 for alt nødvendigt at søge efter hjælpestoffer, som er i stand til at nedbryde proteinbindingen i stærkt surt miljø. Således tilsættes f.eks. ifølge Barteis og Boehmer, Z. Clin. Chem. Clin. Biochem. 7 (1969), side 444, dispergeringsmidler og ifølge Winsten og'Cehelyk, Clin. Chem. Acta 23 (1969), side 10 441, dimethylsulfoxid som "o’pløsningsfremmende middel" til det indirekte bilirubin for derpå at kunne gennemføre en bestemmelse af en samlet bilirubin i stærkt surt miljø på tilsvarende måde som af det direkte bilirubin.
På trods af talrige varianter kan de i litteraturen hidtil 15 beskrevne prøvemetoder til direkte og samlet bilirubin stadig ikke tilfredsstille fagfolk, såsom den dårlige overensstemmelse mellem forskellige metoder viser (Jacobs et al., Clin.
Chem. 10 (1964), side 433-439). Frem for alt er det stærkt sure aggressive miljø, hvori de hidtil kendte bestemmelses-20 metoder skal gennemføres for at opnå en nogenlunde praktika bel differentiering (loc. cit.), ufordelagtig for den praktiske gennemførelse af prøven.
Det var derfor den foreliggende opfindelses formål at tilvejebringe en bestemmelsesmetode til direkte og til samlet bili-25 rubin, som kan gennemføres i det svagt sure til omtrent neu trale pH-områder, er enkel og let at gennemføre og tilveje-bringer pålidelige værdier.
Det har overraskende vist sig, at bestemmelse af direkte bilirubin og samlet bilirubin er mulig i svagt sure til omtrent 30 neutrale omgivelser, når der på bestemt måde anvendes substi tuerede diazoniumsalte, f.eks. diazoterede 2-amino-5-chlor-toluen (Fast Red TR) eller diazoterede 2-methoxy-5-chlorani-
DK 159174 B
4 lin (Fast Red RC),
Opfindelsen angår derfor en fremgangsmåde til bestemmelse af direkte og samlet bilirubin i legemsvæsker, ved at bili-rubinet kobles med et diazoniumsalt, og den derved opståede 5 ekstinktionsændring måles på kendt måde, der er ejendommelig ved, at koblingen gennemføres i nærværelse af en puffer, som indstiller prøveopløsningen på en pH-værdi fra 3,5 til 8, og at der som koblingekomponent anvendes et diazoniumsalt med den almene formel I: ri ~~^\jy^N' ^ 10 R2 hvori
Ri betyder hydrogen, halogen, en laver alkyl-, en lavere al-koxy- eller en benzoy.laminogruppe, R2 betyder hydrogen, en lavere alkyl- eller lavere alkoxygrup-
Pe, 15 R3 betyder hydrogen, halogen, en lavere alkyl- eller en lavere alkoxygruppe, hvorhos Ri og R3 ikke samtidigt må være halogen, og X betyder en anion, der danner et lagringsstabilt salt med di-azoni umkationen.
20
Som lavere alkyl- eller lavere alkoxygrupper i definitionen af substituenterne R ^, R2 og R ^ forstås grupper med 1-5, fortrinsvis 1-3 C-atomer. Særligt foretrukket er methyl- og ethyl- eller methoxy- og ethoxygrupperne.
DK 159174 B
5
Ved halogen skal forstås fluor, chlor, brom og jod, hvor chlor og brom især foretrækkes.
Som en anion, der med diåzoniumkationen danner et lagerstabilt salt, kommer fortrinsvis tetrafluorborat eller tetrachlor-5 zinkat på tale.
De ifølge opfindelsen anvendte diazoniumsalte er kendte forbindelser eller kan let fremstilles analogt med kendte forbindelser. Disse diazoniumsalte er til dels også allerede blevet anvendt til bestemmelse af bilirubin i stærkt surt 10 medium. For fagmanden var det dog overraskende, at der finder en kobling sted mellem bilirubin og diazoniumsaltene med den almene formel I, selv i svagt surt til omtrent neutralt miljø.
I Z.Clin.Chem. Clin.Biochem. 9 (1971), side 273 omtales f.eks. udtrykkeligt, at et ifølge den foreliggende opfindelse særligt 15 foretrukket diazoniumsalt, det diazotierede 2-amino-5-chlorto- luen (Fast Red TR), ikke reagerer med bilirubin ved en pH-værdi på 5,2.
Opfindelsen angår endvidere et middel til gennemførelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen til bestemmelse af direkte og samlet bilirubin, som indeholder de til bestemmelsen nød-20 vendige bestanddele, diazoniumsalt og puffer, i form af en opløsning, en pulverblanding, en reagenstablet, et lyofilisat eller en dermed imprægneret sugedygtig bærer. Midlet ifølge opfindelsen er ejendommeligt ved det krav 6's kendtegnende del anførte.
Til bestemmelse af det samlede bilirubin og det direkte bili-25 rubin, kan midlet yderligere indeholde et middel til fremme af opløseligheden.
Ifølge opfindelsen tilsættes fordelagtigt en puffer, der indstiller prøveopløsningen på en pH-værdi i området fra 3,5-8,0. Til bestemmelse af det direkte bilirubin anvendes fortrinsvis 30 en puffer, der er virksom i pH-intervallet 3,5-6,0, fortrins vis 4,3-5,7. Til bestemmelse af det samlede bilirubin anvendes
DK 159174 B
6 fortrinsvis en i pH-intervallet fra 5,5-8, fortrinsvis 6-7, virksom puffer.
Som puffer kan anvendes sådanne, som har tilstrækkelig puffer-kapacitet i det omtalte pH-interval. Til bestemmelse af direk-5 te bilirubin drejer det sig især om puffersystemer,såsom f.eks.
citronsyre/tris-(hydroxymethy!)-aminomethan, citronsyre/natron-lud, eddikesyre/natronlud, kaliumhydrogenphthalat/natronlud eller phosphatpuffer, hvorhos de tre førstnævnte puffersystemer foretrækkes ganske særligt. Til bestemmelse af samlet bi-10 lirubin foretrækkes især citronsyre/tris-(hydroxymethyl)-ami- nomethan, saltsyre/tris-(hydroxymethyl)-aminomethan. Saltsyre/ imidazol-puffer kan også anvendes.
Til bestemmelse af det samlede bilirubin og det direkte bilirubin kan yderligere et middel til fremme af opløseligheden 15 tilsættes. Til dette formål har dimethylformamid, dimethyl- sulfoxid, tetrahydrofuran, dioxan eller forskellige glycoler vist sig særligt egnede. Dimethylformamid. er særligt foretrukket. Til bestemmelse af direkte bilirubin kan en ikke-ionisk detergent, fortrinsvis "Triton X" 100 (Rohm & Haas, Philadel-20 phia) tilsættes, hvor koncentrationen af "Triton X" 100 andrager ca. 0,1-1,0?i. Yderligere eksempler på ikke-ioniske detergenter er "Tween" 21 eller "Tween" 40 (fremstillet af ICI),
Tergitol 15-S-12 (Union Carbide Corporation), BRIJ 78 (ICI).
Til bestemmelse af direkte bilirubin og af samlet bilirubin 25 bringes prøven, der skal bestemmes, i kontakt med diazonium- saltet, pufferen og eventuelt med midler til forbedring af opløsningen. De tilsatte stoffer kan derved foreligge i form af en opløsning, som. pulverblanding, som reagenstabletter, som lyofilisat eller i form af en dermed imprægneret suge-30 dygtig bærer. Det er muligt at kombinere de forskellige former.
Således kan pufferen f.eks. tilsættes som opløsning i et egnet opløsningsmiddel, og diazoniumsaltet i form af en tablet.
DK 159174 B
7
Koncentrationen af bilirubinet, der skal måles i prøvetilsætningen, bør ligge mellem 0,5 og 25 mol/1. Eventuelt kan udgangsprøven fortyndes.
Den anvendte mængde diazoniumsalt, puffer og eventuelt opløs-5 ningsformidler vælges således,'at følgende koncentrationer opnås i prøveopløsningen:
Diazoniumsalt: mellem 0,5 og 30 mmol/1, fortrinsvis mellem 5' og 15 mmol/1, puffer: mellem 0,02 og 1,0 mol/1, fortrinsvis 10 0,05 og 0,3 mol/1, eventuelt tilsat opløsningsfremmende middel: mellem 0,1 og 4 mol/1, fortrinsvis mellem 1 og 3 mol/1 ved måling af det samlede bilirubin og 0,01-0,1 mol/1 ved måling af direkte bilirubin.
15 En væsentlig fordel ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen til bestemmelse af direkte og samlet bilirubin ligger deri, at de umiddelbare reaktionsbetingelser kun afviger ved ubetydelige forskelle i pH-værdier af prøveopløsningen. Begge bestemmelser kan således gennemføres sideordnet med i det 20 store og hele identiske reagenser. På fordelagtig måde an vendes det samme diazoniumsalt til bestemmelse af det direkte og det samlede bilirubin. Nødvendige forskellige pH-værdier opnås ved ringe variation i sammensætningen af pH-værdi-bestemmende puffersubstanser.
25 I praksis kan det foregå således, at separate reagenssammen sætninger til bestemmelsen af direkte og samlet bilirubin fremstilles, hvilke sammensætninger indeholder det samme diazoniumsalt, men forskellig sammensætning af pufferkomponenterne. Det kan også foregå ved, at der til de to bestemmelser 30 fremstilles en fælles reagenskombination, som indeholder di- azoniumsaltet og en puffer til indstilling af pH-værdien for den ene bestemmelsesparameter.
DK 159174 B
e pH-værdien til bestemmelse af den anden parameter indstilles ued tilsætning af yderligere egnede puffermaterialer.
Midlet ifølge opfindelsen til bestemmelse af direkte eller samlet bilirubin i form af en opløsning indeholder fortrins-5 vis samtlige til prøven nødvendige reagenser. Som opløsnings middel kommer vand eller blanding af vand med et vandopløseligt organisk opløsningsmiddel, såsom f.eks. methanol, ethanol, acetone eller dimethylformamid, på tale. Af holdbarheds-grunde kan det være fordelagtigt at fordele de til forsøgene 10 nødvendige reagenser på to eller flere opløsninger, som først kombineres ved den egentlige bestemmelse.
Midlet ifølge opfindelsen i form af pulverblandinger eller en reagenstablet kan fremstilles ved, at man behandler og granulerer de nødvendige bestanddele til prøven med sædvan-15 lige galeniske tilsætningsstoffer. Tilsætningsstoffer af den ne art er f.eks. hydrocarboner, såsom f.eks. mono-, oligo-eller polysaccharider, eller sukkeralkoholer, såsom f.eks. mannit, sorbit eller xylit, eller andre opløselige indifferente forbindelser, såsom polyethylenglycoler eller polyvi-20 nylpyrrolidon. Reagenstabletterne har sædvanligvis en slut- vægt på ca. 20-200 mg, fortrinsvis 50-80 mg.
Til fremstilling af lyofilisater frysetørres en opløsning, der foruden samtlige til bestemmelsen nødvendige reagenser indeholder sædvanlige skeletdannere, såsom f.eks. polyvinyl-25 pyrrolidon, og eventuelt yderligere fyldstoffer, såsom f.eks.
mannit, sorbit eller xylit. Til fremstilling af midlet ifølge opfindelsen til bestemmelse af bilirubin i på en sugedygtig bærer, fortrinsvis filtrerpapir, cellulose eller ikke-vævet plastfibertekstil, absorberet form imprægneres builderen med 30 opløsninger af de nødvendige prøvebestanddele i let flygtige opløsningsmidler, såsom f.eks. vand, methanol, ethanol eller acetone. De færdige prøvepapirer kan anvendes som sådan eller på i og for sig kendt måde klæbet til skafter eller fortrins-
DK 159174 B
9 vis indesluttet mellem plastmaterialer og finmaskede netstrukturer ifølge DBP 21 18 455.
De enkelte reagenser, der er nødvendige til bestemmelse af bilirubin, kan også være anbragt på en prøvestrimmel. I det-5 te tilfælde bliver den bilirubinholdige prøve, f.eks. serum, dryppet på prøveområdet indeholdende reagensbestanddelene, og ved hjælp af den fremkomne farveændring bestemmes prøvens bilirubinindhold på i og for sig kendt måde.
Opfindelsen belyses ved hjælp af følgende eksempler: 10 Eksempel 1.
1. Opløsninger:
Pufferopløsninq: 167 mmol tris-(hydroxymethyl)-aminomethan og 83 mmol citronsyre opløses med destilleret vand til et samlet volumen på 1 liter. Opløsningen har en pH-værdi på 15 5,0.
Reaktionsopløsninq 1: I 10 ml af den ovenfor nævnte pufferopløsning opløses 20 mg Fast Red TR (diazotieret 2-amino-5-chlor-toluen x 1/2 ZnC^)· Opløsningen er mindst holdbar i 24 timer ved stuetemperatur.
20 Opløsning 2: (Tilsætningsreagens til bestemmelse af samlet bilirubin): 0,9 mol tris-(hydroxymethyl)-aminomethan opløses med destilleret vand til et samlet volumen på 1 liter.
2. Forsøgsgang: I mikrokuvetter (lagtykkelse 1 cm) pipetteres ved stuetempe-25 ratur de forskellige reagensopløsninger på følgende måde:
DK 159174B
10 A = direkte bilirubin B = samlet bilirubin __Måleværdi blindværdi måleværdi blindværdj
Reaktionsopløsning 1 500 μ 1 - 500 μ 1
Puffer - 500 μΐ - 500 μΐ 5 Dest. vand 50 μΐ 50 μ 1
Opløsning 2 - - 50 μΐ 50 μΐ Måling af ekstinktionen ved 546 nm (E^)
Serum 20 μΐ 20 μΐ 20 -μ 1 20 μ 1 Måling af ekstinktionen efter nøjagtig 10 min. (E2) ved 546 nm.
10 For hver forsøgsserie måles en reagensblindværdi. Denne værdi opnås ved, at man går frem på analog måde som ovenfor angivet under "måleværdi", dog erstattes serummet med den samme mængde vand.
3. Udnyttelse: 15 Ud fra de målte ekstinktioner beregnes ekstinktionsforskelle ne som følger: Δ ^2 ” ^1^A-målekuvette ” ^2 ” ^1^A-blindværdikuvette - (E£ - ^A-reagensblindværdi “ ^2 ” ^1 ^B-målekuvette - (E„ - E.)D , , . , ... ..
2 1 B-blmdværdikuvette - ^2 ~ ^1^B-reagensblindværdi.
Ud fra de opnåede ekstinktionsforskelle måles prøvens bili-rubinindhold som følger: AE^ x 0,93 = mmol direkte bilirubin/1 AEd x 0,93 = mmol samlet bilirubin/1.
D
ψ 11
DK 15917 4 B
Eksempel 2.
1. Opløsninger:
Pufferopløsninq A (til direkte bilirubin): En opløsning af 0,13 mol citronsyre i vand behandles med 0,35 mol tris-(hy-5 droxymethyl)-aminomethan og fyldes op med vand til et samlet volumen på 1 liter. Opløsningen har en pH-værdi på 5,7.
Pufferopløsninq B (til samlet bilirubin): En opløsning af 0,2 mol tris-(hydroxymethyl)-aminomethan i vand bringes med saltsyre op til en pH-værdi på 7,0. Der tilsættes 50 ml di-10 methylformamid og fyldes op med destilleret vand til et samlet volumen på 1 liter.
Reaqensopløsninq A eller B: Til hver 10 ml puffer A eller B opløses 40 mg Fast Violet B (diazotieret 6-benzoyl-amino- 4-methoxy-3-amino-toluen x 1/2 ZnC^).
15 2 . Forsøgs q-a-n-q : I kuvetter (lagtykkelse 1 cm) pipetteres ved stuetemperatur de nedenfor angivne opløsninger som følger: A = direkte bilirubin B = samlet bilirubin __Måleværdi__Måleværdi_ 20 Reagensopløsning A 2 ml
Reaqensopløsninq B_3_2 ml__ Måling af ekstinktionen ved 578 nm (E^)_
Serum__0,08 ml__0,08 ml_ Måling af ekstinktionen efter nøjagtig 10 min. ^) ved 578 nm 25 Reagensfriværdien måles for hver prøveserie. Denne værdi opnås ved, at man går frem på analog måde som angivet ovenfor under "måleværdi", dog erstattes serum med den samme mængde
DK 159174 B
12 puffer A eller B.
En blindværdikuvette svarende til eksempel 1, hvor der i stedet for reagensopløsningen tilsættes den tilsvarende mængde pufferopløsning, er kun nødvendig ved tydelig formørkelse eller 5 hæmolytisk sera.
3. Udnyttelse:
Ud fra de nævnte ekstinktioner beregnes ekstinktionsforskellene som følger: ^A “ ^2 ~ ^1^A-målekuvette ~ ^2 ~ ^1 ^A-reagensblindværdi 10 ΔΕβ - (E£ ~ ^1 ^B-målekuvette ~ ^2 ” ^l^B-reagensblindværdi.
Ud fra de opnåede ekstinktionsforskelle måles prøvens bili-rubinindhold som følger: ΛΕ^ x 0,49 = mmol direkte bilirubin/1 AEg x 0,49 = mmol samlet bilirubin/1.
15 Alternativt kan bilirubinbestemmelsen også udføres ved, at ekstinktionsforskellen mellem det første og femte minut efter starten aflæses (kinetisk måling).
Prøvens bilirubinindhold kan også bestemmes på den måde, at der ved måling af forskellige serumprøver med bestemte, kend-20 te bilirubinindhold fremstilles en kalibreringskurve, ud fra hvilken der derpå fra hver ekstinktionsforskel kan aflæses den tilsvarende bilirubinkoncentration, som er målt ved en prøve med ukendt bilirubinindhold.
Samme værdier for direkte bilirubin, som tidligere opnået, 25 når man anvender en citratpuffer med tilsætning af "Triton X" 100 i stedet for pufferopløsning A.
DK 159174 B
13
Eksempel 3.
1. Opløsninger;
Pufferopløsninq: 73 mmol tris-(hydroxymethyl)-aminomethan og 49 mmol citronsyre opløses med destilleret vand og fyldes 5 op til et samlet volumen på 1 liter. Opløsningen har en pH- værdi på 4,3.
Reaktionsopløsninq 1: 20 mg Fast Red RC (diazotieret 2-meth-oxy-5-chloranilin x 1/2 ZnCl^) opløses i 10 ml af denne puffer. Opløsningen er mindst holdbar i 24 timer ved stuetempe-10 ratur.
Opløsning 2 (tilsætningsreagens til samlet bilirubin): 0,73 mol tris-(hydroxymethyl)-aminomethan fyldes op til 1 liter med destilleret vand.
2. Forsøgsgang: 15 I mikrokuvetter (lagtykkelse 1 cm) pipetteres ved stuetempe ratur de efterfølgende opløsninger på den angivne måde: A = direkte bilirubin B = samlet bilirubin Måleværdi blindværdi måleværdi blindværd ί
Reaktionsopløsning 1 500 μΐ - 500 μΐ 20 Puffer - 500 μ 1 - 500 μ1
Dest. vand 50 μΐ 50 μ 1
Opløsning 2 - - 50 μΐ 50 μΐ Måling af ekstinktionen ved 546 nm (E^)
Serum 20 μΐ 20 μΐ 20 μΐ 20 μΐ 25 Måling af ekstinktionen efter nøjagtig 10 min. ved 546 nm (E£)
For hver forsøgsserie måles en reagensblindværdi. Denne opnås
DK 159174 B
14 ved, at man går frem på analog måde som angivet ovenfor under "måleværdi", idet der dog i stedet for serum anvendes samme mængde vand.
3. Udnyttelse: 5 Ud fra de målte ekstinktioner beregnes ekstinktionsforskelle ne som følger: - ^2 ” ^1 ^A-målekuvette ~ ” ^1^A-blindværdikuvette ^2 ~ ^1^A-reagensblindværdi - ^2 ” ^1 ^B-målekuvette - ^2 ~ ^l^B-blindværdikuvette” / p* r* \ -*•0 ” L1' B-reagensblindværdi.
Ud fra de opnåede ekstinktionsforskelle kan prøvens biliru- binindhold måles som følger: x 0,83 = mmol direkte bilirubin/1 ΔΕπ x 0,83 = mmol samlet bilirubin/1.
D
15 Tilsvarende resultater opnås, når der i den ovenfor anførte reaktionsopløsning 1 i stedet for 20 mg "Fast Red" RC anvendes 40 mg "Fast Blue" BB (diazoteret 2,5-diethoxy-4-benzoyl-amino-anilin x 1/2 ZnC^) eller 40 mg "Fast Blue" RR (diazoteret 2,5-dimethoxy-4-benzoylamino-anilin x 1/2 ZnC^).
20 Eksempel 4.
Filterpapir (f.eks. VS 532 fra Fa. Binzer) imprægneres med A en opløsning, som indeholder 0,13 mol citronsyre, 0,35 mol tris-(hydroxymethyl)-aminomethan og 4,0 g "Fast Violet" B i 1 liter destilleret vand,
Claims (9)
1. Fremgangsmåde til bestemmelse af direkte og samlet bili rubin i legemsvæsker ved at bilirubinet kobles med et diazo-niumsalt, og den derved opståede ekstinktionsændring måles på kendt måde, kendetegnet ved, at koblingen gennemføres i nærværelse af en puffer, som indstiller prøveop-25 løsningen på en pH-værdi fra 3,5'til 8, ag at der som kob-(iingskomponent anvendes et diazoniumsalt med den almene forr mel I: R, —y/ \_nUi| )β (I) Y\ R2 DK 159174 B hvori betyder hydrogen, halogen, en lavere alkyl-, en lavere alkoxy- eller en benzoylaminogruppe, R„ betyder hydrogen, en lavere alkyl- eller lavere alkoxy-
2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at diazoniumsaltet tilsættes i en koncentration på 0,5-30 mmol/1 prøveopløsning, og at pufferen tilsættes i en koncentration på 0,02-1 mol/1 prøveopløsning. 2Q
3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendeteg n- e t ved, at prøveopløsningen til bestemmelse af det direkte bilirubin har en pH-værdi i intervallet fra 3,5-6,0.
4. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1-3, kende-2® tegnet ved, at der yderligere tilsættes et opløsnings- fremmende middel.
5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at koncentrationen af det opløsningsfremmende middel i prøve-opløsningen til bestemmelse af det samlede bilirubin andrager 0,1-4 mol/1 og til bestemmelse af direkte bilirubin 0,01-0,1 mol/1.
5 L gruppe, R^ betyder hydrogen, halogen, en lavere alkyl- eller en lavere alkoxygruppe, 10 hvorhos R^ og R^ ikke samtidigt må være halogen, og X betyder en anion, der danner et lagringsstabilt salt med diazoniumkationen.
6. Middel til bestemmelse af direkte og samlet bilirubin 5® i legemsvæsker ved en fremgangsmåde ifølge ethvert af kra vene l-:-5, kendetegnet ved, at det indeholder et i off-intervallet 3,5-8 virksomt puffersystem οσ et diazonium--salt med den'almene formel I. ψ DK 159174 B Rl~\ y-S=N| x® (i) y\ / R R2 5 hvori betyder hydrogen, halogen, en lavere alkyl-, en lavere jq alkoxy- eller en benzoylaminogruppe, R^ betyder hydrogen, en lavere alkyl- eller lavere alkoxy-gruppe, R^ betyder hydrogen, halogen, en lavere alkyl- eller en lavere alkoxygruppe, hvorhos R^ og R^ ikke samtidigt må betegne halogen, og X betegner en anion, der med diazoniumkationen danner et lagrings-stabilt salt.
7. Middel ifølge krav 6, kendetegnet ved, at di-azoniumsaltet og pufferen foreligger i en sådan koncentra- 2g tion, at der i prøveopløsningen til bestemmelse af direkte og samlet bilirubin opnås en slutkoncentration på 0,5-30 mmol/1 af diazoniumsaltet og 0,02 - 1 mol/1 af pufferen.
8. Middel ifølge krav 6 eller 7, kendetegnet ved, ^0 at det yderligere indeholder et opløsnings fremmende middel.
9. -Middel ifølge krav 8, kendetegnet ved, at det opløsningsfremmende middel foreligger i en sådan koncentration, at der i prøveopløsningen til bestemmelse af den samlede bilirubin opnås en slutkoncentration på 0,1-4 mol/1, og at kon- 3 5 centrationen til bestemmelse af direkte bilirubin andrager 0,01-0,1 mol/1. ·
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3225331 | 1982-07-07 | ||
| DE19823225331 DE3225331A1 (de) | 1982-07-07 | 1982-07-07 | Verfahren zur bestimmung von direktem und gesamt-bilirubin sowie hierfuer geeignetes reagens |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK312883D0 DK312883D0 (da) | 1983-07-06 |
| DK312883A DK312883A (da) | 1984-01-08 |
| DK159174B true DK159174B (da) | 1990-09-10 |
| DK159174C DK159174C (da) | 1991-02-18 |
Family
ID=6167814
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK312883A DK159174C (da) | 1982-07-07 | 1983-07-06 | Fremgangsmaade til bestemmelse af direkte og samlet bilirubin samt et hertil egnet middel |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4892833A (da) |
| EP (1) | EP0098562B1 (da) |
| JP (1) | JPS5923253A (da) |
| AT (1) | ATE18464T1 (da) |
| AU (1) | AU559319B2 (da) |
| CA (1) | CA1211348A (da) |
| DE (2) | DE3225331A1 (da) |
| DK (1) | DK159174C (da) |
| ES (1) | ES8403623A1 (da) |
| IE (1) | IE55209B1 (da) |
| YU (1) | YU144783A (da) |
| ZA (1) | ZA834852B (da) |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4548905A (en) * | 1984-04-09 | 1985-10-22 | Eastman Kodak Company | Reagent composition, dry element and method for determination of total bilirubin |
| JPS61223651A (ja) * | 1985-03-29 | 1986-10-04 | Kyowa Medetsukusu Kk | ビリルビンの定量方法 |
| JPH0675072B2 (ja) * | 1986-04-16 | 1994-09-21 | 協和メデックス株式会社 | 間接ビリルビンの定量法及び定量用キツト |
| US5278073A (en) * | 1991-05-08 | 1994-01-11 | Streck Laboratories, Inc. | Method of bilirubin assay |
| JP3091094B2 (ja) * | 1993-12-28 | 2000-09-25 | ユニチカ株式会社 | 直接型ビリルビン測定用試薬 |
| AU697785B2 (en) | 1994-07-19 | 1998-10-15 | Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. | Analytical element,composition and method using modified apo-horseradish peroxidase |
| US6066300A (en) * | 1995-07-07 | 2000-05-23 | Bayer Corporation | Reagent handling system and configurable vial carrier for use therein |
| US5609822A (en) * | 1995-07-07 | 1997-03-11 | Ciba Corning Diagnostics Corp. | Reagent handling system and reagent pack for use therein |
| ATE225515T1 (de) * | 1996-03-22 | 2002-10-15 | Roche Diagnostics Gmbh | Stabilisierung von bilirubin in kontrollseren und kalibratoren |
| US5783407A (en) * | 1996-04-05 | 1998-07-21 | Beckman Instruments, Inc. | Method of measuring bilirubin |
| US7087420B1 (en) | 1997-07-17 | 2006-08-08 | Cambia | Microbial β-glucuronidase genes, gene products and uses thereof |
| US6391547B1 (en) * | 1997-09-09 | 2002-05-21 | Center For The Application Of Molecular Biology To International Agriculture | Microbial β-glucuronidase genes, gene products and uses thereof |
| US5935861A (en) * | 1997-11-21 | 1999-08-10 | Boehringer Mannheim Corporation | Diazonium ion assay reagents and methods for their use |
| ES2202959T3 (es) * | 1999-04-21 | 2004-04-01 | Mohammad Zouheir Dr. Habbal | Procedimiento y reactivos para la determinacion de bilirrubinas. |
| WO2003048766A2 (en) * | 2001-11-29 | 2003-06-12 | The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services, Centers For Disease Control And Prevention | Colorimetric artemisinin and artemisinin derivatives assay and assay kit |
| GB0600031D0 (en) * | 2006-01-03 | 2006-02-08 | London School Hygiene & Tropical Medicine | Assay |
| US8435794B2 (en) | 2007-11-05 | 2013-05-07 | The United States of America, as represented by the Secretary of the Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention | Colorimetric test for antimalarial artemesin derivatives |
| WO2017151469A1 (en) * | 2016-02-29 | 2017-09-08 | The University Of Toledo | Thin molecules for the treatment of obesity and type ii diabetes |
| CN107607638B (zh) * | 2017-08-22 | 2020-06-12 | 杭州谱景柏泰科技有限公司 | 芳香族化合物的检测方法及试剂盒 |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3511607A (en) * | 1967-10-06 | 1970-05-12 | Smithkline Corp | Laboratory reagent for assay of total bilirubin |
| US3585004A (en) * | 1969-03-21 | 1971-06-15 | Miles Lab | Test composition and device for detecting couplable compounds |
| DE2240471C3 (de) * | 1972-08-17 | 1975-04-03 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Testpapier zum Nachweis von Bilirubin in Körperflüssigkeiten |
| US3825411A (en) * | 1972-08-30 | 1974-07-23 | Medico Electronic Inc | Reagent and method for bilirubin determination |
| US3814586A (en) * | 1973-01-02 | 1974-06-04 | Miles Lab | Composition,method and device for determining bilirubin and urobilinogen |
| JPS5433094A (en) * | 1977-08-18 | 1979-03-10 | Terumo Corp | Test piece for detecting bilirubin |
| DE2926980A1 (de) * | 1979-07-04 | 1981-01-22 | Behringwerke Ag | Mittel zum nachweis von bilirubin |
| CA1128333A (en) * | 1979-07-11 | 1982-07-27 | Tai-Wing Wu | Determination of conjugated and unconjugated bilirubin |
| US4412005A (en) * | 1979-10-25 | 1983-10-25 | Eastman Kodak Company | Determination of total bilirubin |
| US4338095A (en) * | 1980-07-11 | 1982-07-06 | Eastman Kodak Company | Method for selective determination of conjugated and unconjugated bilirubin |
| JPS57103056A (en) * | 1980-12-19 | 1982-06-26 | Toyobo Co Ltd | Reagent for measuring direct bilirubin |
| US4468467A (en) * | 1982-02-01 | 1984-08-28 | Eastman Kodak Company | Diazonium salt for bilirubin assay |
-
1982
- 1982-07-07 DE DE19823225331 patent/DE3225331A1/de not_active Withdrawn
-
1983
- 1983-06-30 CA CA000431532A patent/CA1211348A/en not_active Expired
- 1983-07-01 US US06/510,221 patent/US4892833A/en not_active Expired - Fee Related
- 1983-07-01 YU YU01447/83A patent/YU144783A/xx unknown
- 1983-07-01 AU AU16497/83A patent/AU559319B2/en not_active Ceased
- 1983-07-02 EP EP83106467A patent/EP0098562B1/de not_active Expired
- 1983-07-02 AT AT83106467T patent/ATE18464T1/de not_active IP Right Cessation
- 1983-07-02 DE DE8383106467T patent/DE3362427D1/de not_active Expired
- 1983-07-04 ZA ZA834852A patent/ZA834852B/xx unknown
- 1983-07-05 IE IE1570/83A patent/IE55209B1/en not_active IP Right Cessation
- 1983-07-06 DK DK312883A patent/DK159174C/da not_active IP Right Cessation
- 1983-07-06 ES ES523896A patent/ES8403623A1/es not_active Expired
- 1983-07-07 JP JP58122448A patent/JPS5923253A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0098562A1 (de) | 1984-01-18 |
| JPH0324629B2 (da) | 1991-04-03 |
| DK312883A (da) | 1984-01-08 |
| AU1649783A (en) | 1984-01-12 |
| YU144783A (en) | 1988-08-31 |
| DE3225331A1 (de) | 1984-01-12 |
| US4892833A (en) | 1990-01-09 |
| ZA834852B (en) | 1984-04-25 |
| ES523896A0 (es) | 1984-04-01 |
| DE3362427D1 (en) | 1986-04-10 |
| CA1211348A (en) | 1986-09-16 |
| ATE18464T1 (de) | 1986-03-15 |
| JPS5923253A (ja) | 1984-02-06 |
| DK159174C (da) | 1991-02-18 |
| ES8403623A1 (es) | 1984-04-01 |
| DK312883D0 (da) | 1983-07-06 |
| IE831570L (en) | 1984-01-07 |
| AU559319B2 (en) | 1987-03-05 |
| EP0098562B1 (de) | 1986-03-05 |
| IE55209B1 (en) | 1990-07-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK159174B (da) | Fremgangsmaade til bestemmelse af direkte og samlet bilirubin samt et hertil egnet middel | |
| JP2922003B2 (ja) | 過酸化活性物質の検定のための組成物、用具及び方法の改良 | |
| JP2928649B2 (ja) | 過酸化活性物質の検定のための組成物、用具及び方法 | |
| KR20020065891A (ko) | 8-(아닐리노)-1-나프탈렌술포네이트 유사체 및 분석물검출 분석에서의 그들의 사용 | |
| Fairbridge et al. | The direct colorimetric estimation of reducing sugars and other reducing substances with tetrazolium salts | |
| CS273301B2 (en) | 3,3,5,5-tetramethylbenzidine and 3,3,5,5-tetraethylbenzidine as oxidizing indicators during speeds | |
| JPS5813398A (ja) | 過酸化水素もしくは過酸化水素を形成する基質またはペルオキシダ−ゼもしくはペルオキシダ−ゼのように作用する物質を検出するための剤および方法 | |
| DK158995B (da) | Blanding til bestemmelse af naervaerelsen af en forbindelse i en proeve samt teststrimmel impraegneret med blandingen | |
| US4994395A (en) | Chromogenic cryptand reagents and methods for determining cation concentrations in test samples containing interfering cations | |
| US4224034A (en) | Assay of iron and iron binding protein reagents and methods | |
| US4594225A (en) | Elements for analysis of calcium | |
| JP3569139B2 (ja) | ジアゾニウムイオンアッセイ試薬およびその使用方法 | |
| EP0253548A2 (en) | Method for the determination of occult blood and chemical compositions therefor | |
| JPS6142823B2 (da) | ||
| US4439527A (en) | Composition and method for the detection of hydrogen peroxide | |
| JPH0827290B2 (ja) | 臨床診断に用いる安定した液体対照および／または較正用血清 | |
| EP0497385A1 (en) | New indicator compounds, method of their preparation and use of those compounds in an iron assay system | |
| JP5231392B2 (ja) | 酸化発色化合物またはその塩およびその製造方法、ならびに試薬組成物およびこれを用いた試験具 | |
| JP4392486B2 (ja) | ハプトグロビンの分析方法 | |
| JPH0439913B2 (da) | ||
| SU416969A3 (da) | ||
| US4894472A (en) | Dicyanoethylaryl derivatives and process for their preparation | |
| JPH05168497A (ja) | エステル分解酵素又は蛋白分解酵素の測定用試薬 | |
| US6696297B2 (en) | Non-oxidizable bilirubin substitutes and uses therefor | |
| DK149759B (da) | Fremgangsmaade til bestemmelse af total bilirubin og reagens til udfoerelse af fremgangsmaaden |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PBP | Patent lapsed |