DK149759B - Fremgangsmaade til bestemmelse af total bilirubin og reagens til udfoerelse af fremgangsmaaden - Google Patents

Fremgangsmaade til bestemmelse af total bilirubin og reagens til udfoerelse af fremgangsmaaden Download PDF

Info

Publication number
DK149759B
DK149759B DK041772AA DK41772A DK149759B DK 149759 B DK149759 B DK 149759B DK 041772A A DK041772A A DK 041772AA DK 41772 A DK41772 A DK 41772A DK 149759 B DK149759 B DK 149759B
Authority
DK
Denmark
Prior art keywords
reagent
polyethylene oxide
dichloro
procedure
bilirubin
Prior art date
Application number
DK041772AA
Other languages
English (en)
Other versions
DK149759C (da
Inventor
August Wilhelm Wahlefeld
Erich Bernt
Wolfgang Gruber
Hans Ulrich Bergmeyer
Original Assignee
Boehringer Mannheim Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE19712110658 external-priority patent/DE2110658C/de
Application filed by Boehringer Mannheim Gmbh filed Critical Boehringer Mannheim Gmbh
Publication of DK149759B publication Critical patent/DK149759B/da
Application granted granted Critical
Publication of DK149759C publication Critical patent/DK149759C/da

Links

Classifications

    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/72Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood pigments, e.g. haemoglobin, bilirubin or other porphyrins; involving occult blood
    • G01N33/728Bilirubin; including biliverdin
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10STECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/903Diazo reactions
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10TTECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/14Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
    • Y10T436/145555Hetero-N
    • Y10T436/146666Bile pigment

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Investigating Or Analyzing Non-Biological Materials By The Use Of Chemical Means (AREA)

Description

149759
Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til bestemmelse af total bilirubin samt et reagens til udførelse af denne bestemmelse.
Konstatering af bilirubinindholdet i serum er af stor betydning i . den medicinske diagnose. Bestemmelsen i serum sker sædvanligvis ved fremgangsmåden ifølge L. Jendrassik (Bio. Chem. Z. 297, 81 (1938)) ved kobling af bilirubinet med et diazoniumsalt og måling af det dannede azobilirubin ved optiske metoder. Et problem med denne fremgangsmåde, består i at azobilirubin er ret tungt opløseligt, således at der må gribes til særlige foranstaltninger, for at forbedre opløselig 2 149759 heden. Ved alkalisering af blandingen, er det muligt at holde azobilirubinet i opløsning.
Klinisk skelnes mellem såkaldt indirekte og direkte bilirubin, i-5 det førstnævnte i det væsentlige udgør frit bilirubin og er fastere boandet til serumæggehvide end direkte bilirubin, som især består af bilirubinglucuronider. Ved fremgangsmåden ifølge Jendrassik bringes det indirekte bilirubin i opløsning med en blanding af koffein og natriumbenzoat og kan derved omfattes af bestemmelsen.
10
Der er dog forskellige ulemper ved fremgangsmåden. Således er de anvendte diazoniumsalte med hensyn til stabilitet og reaktionsevne kun moderat tilfredsstillende. Som følge af den ringe opløselighed af det dannede diazobilirubin kan der kun arbejdes i bestemte kon-15 centrationsområder, således at der er en betydelig interesse i en forbedring af opløseligheden og dermed en udvidelse af linearitetsområdet. Endelig er også forsæbningen af det indirekte bilirubin endnu utilfredsstillende.
2o Der er ifølge opfindelsen foretaget forskellige forsøg, for at fjerne disse ulemper ved Jendrassik-metoden.
Et forbedret reagens til bestemmelse af total bilirubin, indeholder ethylenglycol som opløsningsmiddel. En ulempe ved dette reagens be-25 står i den høje viskositet, som fører til sliredannelse"og indeslutning af luftblærer, som kan forstyrre den optiske bestemmelse betydeligt. Ifølge et andet forslag anvendes som opløsningsformidler et ikke-ionogent sulfoneret benzimidazolderivat med højere fedtsyrer.
Dette reagens har dog den ulempe, at stabiliteten af de dannede farve-30 stoffer formindskes så stærkt, at der ikke opnås noget pålideligt slutpunkt. Tværtimod sker der løbende en yderligere farveændring. Endelig findes der også i handelen et reagens, som indeholder dimethyl= sulfoxyd som opløsningsformidler. Det drejer sig her om et giftigt stof, som ved kontakt let trænger ind, i.huden, og desuden er ildelugt-35 ende. Det har også vist sig, at den frembragte farve ikke har nogen god holdbarhed.’
Formålet med opfindelsen er derfor, at skaffe en fremgangsmåde og et reagens til bestemmelse af total bilirubin, som ikke har de ovennævnte ulemper, og især stor anvendelsesnøjagtighed, bredt anvendelsesområde, god stabilitet 40 og enklest mulige anvendelsesmuligheder.
149759 3
Ifølge opfindelsen løses denne opgave ved, at prøven, som skal bestemmes, sættes til en 2 til 10 rumfangs%ig opløsning af alkylphe-nolpolyethylenoxyd i 0,01 til 0,02M mineralsyre, som indeholder 0,03 til 0,1 vægt% pr. rumfang 2,4-dichlor-, 2,5-dichlor- eller 5 2-chlor-4-nitrophenyldiazoniumchlorid, og det dannede farvestof måles.
Reagenset til udførelse af fremgangsmåden er ejendommeligt, ved at det i det væsentlige består af 2,4-dichlor-, 2,5-dichlor- eller 2-chlor-4-nitrophenyldiazoniumchlorid og et alkylphenolpolyethylenoxyd.
10
Reagenset ifølge opfindelsen kan bestå af kun de to ovennævnte bestanddele og gøres så brugsfærdigt ved tilsætning af en fortyndet mineralsyre. Hensigtsmæssigt består reagenset dog af en mineralsur opløsning af alkylphenolpolyethylenoxydet og adskilt derfra fast diazoniumsalt, når der ønsket en længere lagerholdbarhed. Hvis en holdbarhed på ca. 1 . måned er tilstrækkelig, kan reagenset ifølge opfindelsen også bestå alene af en opløsning af diazoniumsaltet og alkylphenolpolyethylenoxydet i fortyndet mineralsyre.
20 Koncentrationen af den som opløsningsmiddel i reagenset ifølge opfindelsen anvendte syre ligger hensigtsmæssigt mellem 0,01 og 0,2M, fortrinsvis 0,06 til 01M. Som syre anvendes fortrinsvis saltsyre. Andre mineralsyrer af tilsvarende styrke såsom phosphorsyre, svovlsyre og lignende, kan dog også anvendes.
25 Når reagenset ifølge opfindelsen foreligger i brugsfærdig form som opløsning, skal koncentrationen af alkylphenylpolyethylenoxydet hensigtsmæssigt ligge mellem 2 og 10 rumfangs^. Under dette koncentrationsområde, påvirkes bestemmelsens proportionalitetsområde skade-30 ligt, og over den øvre grænse stiger opløsningens viskositet, således at pipettering bliver vanskelig.
Koncentrationen af diazoniumsaltet ligger hensigtsmæssigt mellem 0,03 og 0,1 vægt% pr. rumfang. Foretrukket er en koncentration mellem 35 0,04 og 0,06 vægt?é pr. rumfang.
Som diazoniumsalt foretrækkes 2,5-dichlorphenyldiazoniumchlorid, da det er særligt stabilt og let at fremskaffe.
149759 4 ·
Blandt alkylphenolpolyethylenoxyderne har en isooctylphenolpolyethoxy= ethanol med 5 til 40 ethylenoxydrester. i molekylet særlig vist sig egnet. Sådanne produkter kan f.eks. fås under handelsnavnene Triton® X-100 eller TritorP% 405 fra Rohm and Haas Comp., Philadelphia/USA.
5 Ganske alment er alkylphenolpolyethylenoxyderne lugtløse og forårsager ingen hudirritation. De er også biologisk nedbrydelige.
’ Foruden diazoniumsaltet, alkylphenolpolyethylenoxydet og eventuelt den fortyndede mineralsyre kan reagenset ifølge opfindelsen også 10 indeholde et stabiliseringsmiddel, således som det almindeligvis tilsættes til de i handelen værende diazoniumsalte allerede fra fabrikantens side for at forhindre en dekomponering. Et sådant stabiliseringsmiddel er ganske vist ikke væsentligt for reagenset ifølge opfindelsen, men dets tilstedeværelse i de sædvanlige mængder for-15 styrrer ikke.
Reagenset ifølge opfindelsen udviser en række væsentlige fordele.
Det er let bevægeligt og udmærket pipetterbart. Bilirubinbestemmelsen forenkles væsentligt,da antallet af pipetteringsskridt kan nedsættes 20 til to. Dette gør det muligt at udføre bilirubinbestemmelsen som monotest. Bestemmelsens linearitetsområde er indtil 25 mg$ total bilirubin til forskel fra f.eks. 7 mg% med det kendte reagens indeholdende ethylenglycol. Totalværdier for bilirubin i serum, på indtil 24 mg% kan måles ufortyndet. (vigtigt ved bilirubinbestemmelser i 25 spædbørnsblod). Reagensets stabilitet er meget god. Hvis diazoniumsaltet foreligger i fast form, og alkylphenolpolyethylenoxydet i saltsur opløsning, er holdbarheden ved 4°C mere end et år. Foreligger reagenset i form af en enkelt brugsfærdig opløsning,er varigheden af anvendeligheden ved kold lagring mindst 4 uger. Herunder er det 30 hensigtsmæssigt ved mere end 1 uges lagring i denne form at bestemme reagensets blindværdi og tage det med i betragtning. Bestemmelsens linearitet er meget god. Korrelationskoefficienten ved sammenligning med Jendrassiks metode er 0,999 og viser, at Lambert-Beer's lov er meget godt opfyldt.
35
Med henblik på anvendelse af reagenset ifølge opfindelsen bliver den serumprøve, som skal bestemmes,sat til en bestemt mængde af reagenset, blandet og derefter extinktionen ved 546 nm målt, såsnart dens slutværdi er nået, hvilket sædvanligvis er tilfældet efter nogle minutter.
5 149769
De følgende eksempler belyser nærmere opfindelsen.
Eksempel 1.
5 Et straks brugsfærdigt reagens består af: 25 mg 2,5-dichlorphenyldiazoniumchlorid, stabiliseret 50 ml 0,1M HC1, indeholdende 4 rumfangs^ octylphenylpolyethylenoxyd med 5 til 15 ethylenoxyd-10 rester i molekylet.
Bilirubinbestemmelsen sker ved, at 2,5 ml af dette reagens blandes med 0,25 ml bilirubiriholdigt serum,og extinktionen efter 5 minutters henstand ved stuetemperatur måles ved 546 nm, overfor en blind-.
15 værdi på 0,25 ml serum og 2,5 ml 0,1M HC1, indeholdende 4 rumfangs^ af ovennævnte alkylphenolpolyethylenoxyd. Tegningens fig. 1 viser grafisk de fremkomne resultater.
Eksempel 2.
20
Korrelationen ved udførelse af bilirubinbestemmelsen med reagenset ifølge opfindelsen sammenlignet med fremgangsmåden ifølge Jendrassik, som referencemetode blev konstateret ved,at total bilirubin blev bestemt med reagenset ifølge opfindelsen (Y-værdier) og efter 25 Jendrassik (X-værdier) med en serum med tilsat bilirubin.
De fundne værdipar blev korreleret og er vist på tegningen fig. 2.
Som korrelationsligning, blev beregnet: 30 Υ = -0,1389 + 1,0277 . x
Korrelationskoefficienten r = 0,999.
Eksempel 3.
35
Et reagens egnet til længere lagring, består af 100 mg 2.,5-dichlorphenyldiazoniumchlorid, lyophiliseret i en lille reagensflaske, 40 200 ml 0,06M HC1, indeholdende 8 rumfangs^ dodecylphenolpolyethylenoxyd i en reagensflaske.

Claims (6)

149759 Eksempel 4. Et yderligere reagens består af: 2 25 mg 2,5-dichlorphenyldiazoniumchlorid, stabiliseret 50 ml 0,1M HC1 indeholdende 2 vol% octylphenylpolyethylenoxyd med 40 ethylenoxydrester i molekylet. ^ Bilirubinbestemmelsen sker som i eks. 1.
1. Fremgangsmåde til bestemmelse af total bilirubin, kendeteg net ved, at prøven, som skal bestemmes, sættes til en 2 til 10 rum-fangs%ig opløsning af aikylphenolpolyethylenoxyd i 0,01 til 0,02M mineralsyre, som indeholder 0,03 til 0,1 vægt% pr. rumfang 2,4-dichlor-, 2.5- dichlor- eller 2-chlor-4-nitrophenyldiazoniumchlorid, og det danne-20 de farvestof måles.
2. Reagens til udførelse af fremgangsmåden ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det i det væsentlige består af 2,4-dichlor-, 2.5- dichlor- eller 2-chlor-4-nitrophenyldiazoniumchlorid og et 25 alkylphenolpolyethylenoxyd.
3. Reagens ifølge krav 2, kendetegnet ved, at det består af fast diazoniumsalt og en mineralsur opløsning af alkylphenolpolyethy= lenoxyd. 30
4. Reagens ifølge krav 2 eller 3, kendetegnet ved, at alkyl= plienolpolyethylenoxydet -er et octylphenolpolyethylenoxyd med 5 til 40 ethylenoxydrester i molekylet.
5. Reagens ifølge krav 3 eller. 4, kendetegnet ved, at sy rens koncentration er 0,01 til 0,2M.
6. Reagens ifølge krav 3-5, kendetegnet ved, at den sure
DK41772A 1971-03-05 1972-01-31 Fremgangsmaade til bestemmelse af total bilirubin og reagens til udfaerelse af fremgangsmaaden DK149759C (da)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE2110658 1971-03-05
DE19712110658 DE2110658C (de) 1971-03-05 Reagens zur Bestimmung von Gesamt Bilirubin

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DK149759B true DK149759B (da) 1986-09-22
DK149759C DK149759C (da) 1987-03-02

Family

ID=5800664

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DK41772A DK149759C (da) 1971-03-05 1972-01-31 Fremgangsmaade til bestemmelse af total bilirubin og reagens til udfaerelse af fremgangsmaaden

Country Status (12)

Country Link
US (1) US3754862A (da)
JP (1) JPS5412840B1 (da)
AT (1) AT316761B (da)
BE (1) BE780100A (da)
CH (1) CH571224A5 (da)
DK (1) DK149759C (da)
FI (1) FI53758C (da)
FR (1) FR2127996A5 (da)
GB (1) GB1330094A (da)
IT (1) IT954878B (da)
NL (1) NL176103C (da)
SE (1) SE376092B (da)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2240357C2 (de) * 1972-08-17 1974-09-12 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Testpapier zum Nachweis von Bilirubin in Körperflüssigkeiten
DE2240471C3 (de) * 1972-08-17 1975-04-03 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Testpapier zum Nachweis von Bilirubin in Körperflüssigkeiten
US4069017A (en) * 1977-01-14 1978-01-17 Eastman Kodak Company Colorimetric assay for bilirubin
US5955374A (en) * 1994-11-23 1999-09-21 Smith; Jack V. Method of detection of bilirubin in urine on an automated analyzer

Also Published As

Publication number Publication date
FI53758C (fi) 1978-07-10
US3754862A (en) 1973-08-28
JPS5412840B1 (da) 1979-05-25
NL7202549A (da) 1972-09-07
IT954878B (it) 1973-09-15
DE2110658A1 (da) 1972-09-14
FI53758B (da) 1978-03-31
SE376092B (da) 1975-05-05
CH571224A5 (da) 1975-12-31
DK149759C (da) 1987-03-02
AT316761B (de) 1974-07-25
DE2110658B2 (de) 1972-09-14
FR2127996A5 (da) 1972-10-13
NL176103C (nl) 1985-02-18
GB1330094A (en) 1973-09-12
NL176103B (nl) 1984-09-17
BE780100A (fr) 1972-09-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Nelson A photometric adaptation of the Somogyi method for the determination of glucose
JPS62182651A (ja) 混濁除去剤
JPS5923253A (ja) 直接型ビリルビン及び全ビリルビンを測定する方法及び試薬
Osgood et al. A new permanent standard for estimation of hemoglobin by the acid hematin method
DK149759B (da) Fremgangsmaade til bestemmelse af total bilirubin og reagens til udfoerelse af fremgangsmaaden
CN105755103A (zh) 一种稳定的酶法测定脂肪酶活性的试剂
JP3569139B2 (ja) ジアゾニウムイオンアッセイ試薬およびその使用方法
US3888739A (en) Reagents and methods for determining amylase concentrations
US4119401A (en) Total bilirubin assay
JP4669205B2 (ja) アルカリホスファターゼ活性測定用試薬および測定方法
JPH01108997A (ja) 血液又は血液から導出した試料中の血清のフルクトスアミン含量を特異的に測定する方法及び試薬、及び非特異的還元作用を有するか、又は/及び溷濁を惹起する試料成分を除去する方法
McKay Pentose estimation by the orcinol method, with particular reference to plasma pentose
JPH0358467B2 (da)
US4965210A (en) Stable reagent for determining bilirubin in serum and method of preparation
EP1754062B1 (en) Assay system with in situ formation of diazo reagent
DE2302721B1 (de) Verfahren zur Bestimmung der Creatinkinase
US4030885A (en) Bilirubin determination
JP6801381B2 (ja) 凍結乾燥状態の検体前処理試薬
JPH1146798A (ja) 血液凝固時間測定用溶液試薬および血液凝固時間測定用溶液試薬用乾燥組成物
JP6740768B2 (ja) 凍結乾燥状態の検体希釈試薬
JPH0588789B2 (da)
Bahl An enzymic method for the determination of skimmed milk powder in raw sausages
CN109837270A (zh) 一种使肌醇脱氢酶、酮胺氧化酶和鞘磷脂酶在液体中长期稳定的方法
EP0335954B1 (en) Method for forming a stable reagent for determining bilirubin in serum and reagent obtainable by said method
US20020146630A1 (en) Non-oxidizable bilirubin substitutes and uses therefor

Legal Events

Date Code Title Description
PUP Patent expired