DE2110658B2 - Reagens zur bestimmung von gesamt-bilirubin - Google Patents

Description

Die Feststellung des Bilirubingehaltes im Serum ist in der medizinischen Diagnose von erheblicher Bedeutung. Die Bestimmung im Serum erfolgt üblicherweise nach dem Verfahren,von.L. Jendrassik (Bio. Chem. Z., 297, S. 81 [1938]) durch Kupplung des Bilirubins mit einem Diazoniumsalz und Messung des gebildeten Azobilirubins durch optische Methoden. Ein Problem dieses Verfahrens besteht darin, daß Azobilirubin relativ schwer löslich ist, so daß besondere Maßnahmen ergriffen werden müssen, um die Löslichkeit zu verbessern. Durch Alkalisieren der Mischung ist es möglich, das Azobilirubin in Lösung zuhalten. . ·

Klinisch wird songenannte »indirektes« und »direktes« Bilirubin unterschieden, wobei ersteres im wesentlichen freies Bilirubin darstellt und fester an Serumeiweiß gebunden ist als das »direkte« Bilirubin, das vor allem aus Bilirubin-Glucuroniden besteht. Nach dem Verfahren von Jendrassik wird das indirekte Bihrubin mit einer Mischung von Coff ein und Natriumbenzonat in Lösung gebracht und kann so in der Bestimmung erfaßt werden.

Dem Verfahren haften jedoch noch verschiedene Nachteile an. So sind die verwendeten Diazoniumsalze in bezug auf Stabilität und Reaktionsbereitschaft nur mäßig zufriedenstellend. Infolge der geringen Löslichkeit des gebildeten Diazobilirubins kann nur in bestimmten Konzentrationsbereichen gearbeitet werden, so daß erhebliches Interesse an einer Verbesserung der Löslichkeit und damit einer Erweiterung des Linearitätsbereichs besteht. Schließlich ist auch die Saponifikation des indirekten Bilirubins noch unbefriedigend.

Es wurden schon verschiedene Versuche unternommen, diese Nachteile des Jendrassik-Verfahrens zu beseitigen.

Ein verbessertes Reagens zur Bestimmung des Gesamt-Bilirubins enthält Äthylenglykol als Lösungsmittel. Ein Nachteil dieses Reagens besteht in der starken Viskosität, die zur Schlierenbildung und zum

ίο Einschluß von Luftblasen führt, welche die optische Bestimmung erheblich stören können. Nach einem anderen Vorschlag wird als Lösungsvermittler ein nichtionogenes sulfoniertes Benzimidazolderivat mit höherem Fettsäurerest verwendet. Dieses Reagens hat jedoch den Nachteil, daß die Stabilität der gebildeten Farbstoffe so stark vermindert wird, daß keine zuverlässigen Endpunkte erhalten werden. Vielmehr findet laufend eine weitere Farbveränderung statt. Schließlich ist auch ein Reagens im Handel, welches Dimethylsulfoxyd als Lösungsvermittler enthält. Hierbei handelt es sich jedoch um eine toxische Substanz, die bei Kontakt leicht in die Haut penetriert und ^ außerdem übelriechend ist. Auch wurde gefunden, | daß die erzeugte Farbe keine gute Beständigkeit aufweist.

Der im Anspruch 1 angegebenen Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes Reagens zur Bestimmung von Gesamt-Bilirubin zu schaffen, welches die obengenannten Nachteile nicht aufweist und insbesondere hohe Anwendungsgenauigkeit, breiten Anwendungsbereich, gute Stabilität und einfachste Anwendungsmöglichkeit besitzt.

Das erfindungsgemäße Reagens kann nur aus den beiden Bestandteilen gemäß Anspruch 1 bestehen und wird dann durch Zugabe einer verdünnten Mineralsäure gebrauchsfertig gemacht. Zweckmäßiger besteht das Reagens jedoch aus eine mineralsauren Lösung des Alkylphenolpolyäthylenoxyds und getrennt davon festem Diazoniumsalz, wenn eine längere Lagerungsfähigkeit gewünscht wird. Wenn eine Lagerungsfähigkeit von etwa einem Monat ausreicht, kann das erfmdungsgemäße Reagens auch allein aus einer Lösung des Diazoniumsalzes und des Alkylphenolpolyäthylenoxyds in verdünnter Mineralsäure bestehen, t Die Konzentration der als Lösungsmittel im erfindungsgemäßen Reagens angewendeten Säure liegt zweckmäßig zwischen 0,01 und 0,2 M, vorzugsweise 0,06 bis 0,1 M. Als Säure wird bevorzugt Salzsäure verwendet. Andere Mineralsäuren entsprechender Stärke wie Phosphorsäure, Schwefelsäure u. dgl. können jedoch ebenfalls verwendet werden.

Wenn das erfindungsgemäße Reagens in gebrauchsfertiger Form als Lösung vorliegt, soll die Konzentration des Alkylphenylpolyäthylenoxyds zweckmäßig zwischen 2 und 10 Volumprozent liegen. Bei Unterschreiten dieses Konzentrationsbereichs wird der Proportionalitätsbereich der Bestimmung nachteilig beeinflußt, bei Überschreiten der oberen Grenze steigt die Viskosität der Lösung, so daß das Pipettieren schwierig wird.

Die Konzentration des Diazoniumsalzes liegt zweckmäßig zwischen 0,03 und 0,1% Gew./Vol. Bevorzugt wird eine Konzentration zwischen 0,04 und 0,06%Gew./Vol.

Als Diazoniumsalz wird das 2,5-Dichlorphenyldiazoniumchlorid bevorzugt, da es besonders stabil und leicht erhältlich ist.

Unter den Alkylphenolpolyäthylenoxyden hat sich

ein Isooctyl-Polyätheroxyäthanol mit 5 bis 40 Äthylenoxydresten im Molekül besonders bewährt. Derartige Produkte sind z. B. unter den Handelsnamen Triton X-100 oder Triton X 405 von der Röhm and Haas Comp., Philadelphia/USA, erhältlich. Ganz allgemein sind die Alkylphenolpolyäthylenoxyde geruchlos und verursachen keine Hautreizung. Auch sind sie biologisch abbaubar.

Außer dem Diazoniumsalz, dem Alkylphenolpolyäthylenoxyd und gegebenenfalls der verdünnten Mineralsäure kann das erfindungsgemäße Reagens auch ein Stabilisierungsmittel enthalten, wie es üblicherweise bei den im Handel erhältlichen Diazoniumsalzen bereits vom Hersteller zugesetzt wird, um eine Zersetzung zu verhindern. Ein solches Stabilisierungsmittel ist für das erfindungsgemäße Reagens zwar nicht wesentlich, seine Anwesenheit in den üblichen Mengen stört jedoch nicht.

Das erfindungsgemäße Reagens weist eine Reihe wesentlicher Vorteile auf. Es ist leicht beweglich und ausgezeichnet pipettierbar. Die Bilirubin-Bestimmung wird wesentlich vereinfacht, da die Zahl der Pipettierschritte auf zwei herabgesetzt wird. Dies ermöglicht es, die Bilirubin-Bestimmung als Monotest durchzuführen. Der Linearitätsbereich der Bestimmung beträgt bis zu 24 mg°/o Gesamt-Bilirubin gegenüber beispielsweise 7 mg% bei dem bekannten Äthylenglykol enthaltenden Reagens. Gesamt-Bilirubinwerte im Serum bis zu 24 mg°/o sind unverdünnt meßbar. (Wichtig bei Bilirubin-Bestimmungen im Säulingsblut.) Die Stabilität des Reagens ist sehr gut. Liegen Diazoniumsalz in fester Form und Alkylphenolpolyäthylenoxyd in salzsaurer Lösung vor, so beträgt die Haltbarkeit bei 4° C mehr als ein Jahr. Liegt das Reagens in Form einer einzigen gebrauchsfähigen Lösung vor, so beträgt die Verwendbarkeitsdauer bei kühler Lagerung mindestens 4 Wochen. Hierbei ist es zweckmäßig, bei mehr als einer Woche Lagerungsdauer in dieser Form den Leerwert des Reagens zu bestimmen und mit zu berücksichtigen. Die Linearität der Bestimmung ist sehr gut. Der Korrelationskoeffizient beim Vergleich mit der Methode nach Jendrassik beträgt 0,999 und zeigt, daß das Lambert—Beersche Gesetz sehr gut erfüllt ist.

Zur Anwendung des erfindungsgemäßen Reagens wird in eine bestimmte Menge desselben die zu bestimmende Serumprobe gegeben, gemischt und dann die Extinktion bei 546 nm gemessen, sobald ihr Endwert erreicht ist, was gewöhnlich nach einigen Minuten der Fall ist.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.

Beispiel 1

Ein sofort gebrauchsfähiges Reagens besteht aus:

25 mg 2,5-Dichlorphenyldiazoniumchlorid,

stabilisiert,

50 ml 0,1 M HCl, enthaltend
4 Volumprozent Octylphenyläthylenoxyd

mit 5 bis 15 Äthylenoxydresten im Molekül.

Die Bilirubin-Bestimmung erfolgt so, daß 2,5 ml dieses Reagens mit 0,25 ml bilirubinhaltigem Serum gemischt und die Extinktion nach 5 Minuten Stehen bei Raumtemperatur bei 546 nm gemessen wird gegen einen Leerwert von 0,25 ml Serum und 2,5 ml 0,1 M HCl, enthaltend 4 Volumprozent des obigen Alkylphenolpolyäthylenoxyds. F i g. 1 der Zeichnung zeigt in graphischer Darstellung die erhaltenen Ergebnisse.

Beispiel 2

Die Korrelation bei Durchführung der Bilirubin-Bestimmung mit dem erfindungsgemäßen Reagens im Vergleich zu dem Verfahren von Jendrassik als Bezugsmethode wurde festgestellt, indem mit einem mit Bilirubin aufgestockten Serum, welches bis 16 mg°/o Bilirubin enthielt, Gesamt-Bilirubin mit dem erfindungsgemäßen Reagens (Y-Werte) sowie nach Jendrassik (X-Werte) bestimmt wurde.

Die gefundenen Wertepaare wurden korreliert und sind in"F i g. 2 der Zeichnung dargestellt. Als Korrelationsgerade wurde berechnet:

y = -0,1389 + 1,0277 -x.
Der Korrelationskoeffizient r = 0,999.

Beispiel 3

Ein zur längeren Lagerung geeignetes Reagens besteht aus:

100 mg 1,5-Dichlorphenyldiazoniumchlorid,
lyophilisiert in einem Reagensfläschchen,

200 ml 0,06 M HCl, enthaltend

8 Volumprozent Dodecylphenolpolyäthylenoxyd in einer Reagensflasche.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen copy

Claims (6)

2 HO 658 Patentansprüche:

1. Reagens zur Bestimmung von Gesamt-Bilirubin, bestehend im wesentlichen aus einem Diazoniumsalz und einem Lösungsvermittler, dadurch gekennzeichnet, daß es als Diazoniumsalz 2,4-Dichlor-, 2,5-Dichlor- oder 2-Chlor-4-nitrophenyldiazoniumchlorid und als Lösungsvermittler ein Alkylphenolpolyäthylenoxyd enthält.

2. Reagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Alkylphenolpolyäthylenoxyd ein Octylphenolpolyäthylenoxyd mit 5 bis 15 Äthylenoxydresten im Molekül ist,

3. Reagens nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es das Diazoniumsalz in fester Form und das· Alkylphenolpolyäthylenoxyd in mineralsaurer Lösung enthält.

4. Reagens nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die mineralsaure Lösung 2 bis 10 Volumprozent Alkylphenolpolyäthylenoxyd enthält.

5. Reagens nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration der Säure 0,01 bis 0,2 M ist.

6. Reagens nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Diazoniumsalz in einer Menge von 0,03 bis 0,1 Gewichtsprozent, bezogen auf das Volumen der mineralsauren Alkylphenolpolyäthylenoxydlösung, vorliegt.