DE3152458T1

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Info

Publication number: DE3152458T1
Application number: DE19813152458
Authority: DE
Inventors: Haruhiko Kawaji; Toshihiro Ono
Original assignee: Kanto Chemical Co Inc
Current assignee: Kanto Chemical Co Inc
Priority date: 1980-10-28
Filing date: 1981-10-28
Publication date: 1982-12-02
Anticipated expiration: 2001-10-29
Also published as: JPS6440B2; WO1982001564A1; JPS5774099A; DE3152458C2

Description

VOSSlUS · VOSSlUS TAUCM-N^RJ-H¹BlDjNeMANN · RAUH

16. Juni

SIEBERTSTRASSE 4 · 8OOO MÜNCHEN 86 · PHONE: (O89) 47 4O 75 CABLE: BENZOLPATENT MDNCHEN · TELEX 5-29453 VOPAT D

Beschreibung

Titel der Erfindung:

Reagenzien zur Bestimmung der Aktivität von /^-Glutamyl- ^ transpeptidase

Technisches Gebiet:

Die Erfindung betrifft Reagenzien zur Bestimmung der Aktivität von /"-Glutamyltranspeptidase. Insbesondere betrifft die Erfindung Reagenzien zur Bestimmung der Aktivität von /^-Glutamyltranspeptidase, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie ^-Glutamyl-4-nitroanilid und Cyclodextrine enthalten.

Zur Bestimmung der Aktivität von /"'-Glutamyltranspeptidase (nachstehend als /"-GTP bezeichnet) werden verschiedene Donorsubstrate verwendet, von denen das L-^Glutamyl^-nitroanilid (nachstehend als Glu-4-NA bezeichnet) am meisten verwendet wurde, da ein verbessertes Verfahren von Szasz entwickelt wurde; vgl. Clin. ehem., Bd. 15 (1969), S. 124.

Das Verfahren unter Verwendung von Glu-4-NA als Donorsubstrat

hat jedoch den Nachteil, daß Glu-4-NA in Wasser eine extrem niedrige Löslichkeit aufweist, instabil und leicht zersetz-

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lieh ist. Zur Erhöhung der Löslichkeit.von Glu-4-NA wurde ein Verfahren entwickelt, bei dem Salzsäure, organische Lösungsmittel oder Tenside zusätzlich verwendet werden, sowie eine Methode, bei dem Wärme angewendet wird. Selbst mit diesen verschiedenen Methoden zur Erhöhung der Löslichkeit löst sich das Glu-4-NA bei diesen Methoden nur bis zu etwa 4 mMol/1 (4 mM) zum Zeitpunkt der Bestimmung der /"-GTP-Aktivität. parüberhinaus bleiben Schwierigkeiten ungelöst, die unerwünschte Erscheinungen und Ergebnisse zur Ί0 Folge haben, was nachstehend erläutert wird.

Bei diesen Methoden erfolgt eine nicht-enzymatische Zersetzung von Glu-4-NA bei seiner Auflösung, und selbst nach der Auflösung setzt sich diese Zersetzung im Lauf der Zeit

^ fort. Als Ergebnis dieser nicht-enzymatischen Zersetzung werden Glutaminsäure und 4-Nitroanilin gebildet. Das 4-Nitro-'anilin'hemmt die katalytische Wirkung von ^-GTP; vgl. Rinsho Kagaku, Bd. 7 (1979), S. 255, und Clin. ehem., Bd. 22 (1976), S. 417. Die Gegenwart dieser Substanzen hat . einen Einfluß auf sämtliche Bedingungen, wie pH-Wert, Temperatur, die Donorsubstrat-Konzentration und die Art des zu verwendenden Puffermittels. All dies muß bei der Bestimmung der /^-GTP-Aktivität berücksichtigt werden. Deshalb ist es sehr schwierig, optimale Bedingungen zur Bestimmung einzuhalten. Darüberhinaus wird die enzymatische Aktivität von >*-GTP spektophotometrisch durch Bestimmung des bei der enzymatischen Spaltung gebildeten 4-Nitroanilins gemessen. Daraus folgt, daß das Meßergebnis mit zunehmender. Absorption

sehr ungenau wird.
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Als Ergebnis eingehender Arbeiten über Verfahren zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität von /^-GTP mit Glu-4-NA als Donorsubstrat haben die Erfinder nunmehr festgestellt, daß der Zusatz von Cyclodextrinen zum Reaktionssystera die

Löslichkeit von Glu-4-NA signifikant erhöht und nichtenzymatische Spaltungen von Glu-4-NA in Wasser oder Puffer-

lösungen verhindert. Die vorliegende Erfindung wurde auf der Basis dieser Befunde erreicht.

Offenbarung der Erfindung:

Die Erfindung ist gekennzeichnet durch die Verwendung von ^-Glutamyl-4-nitroanilid (Donorsubstrat) zusammen mit Cyclodextrinen als Reagens zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität von /*-GTP. Eine Aufgabe der Erfindung ist es, durch Erhöhung der Löslichkeit von /"-Glutamyl-4-nitroanilid (Glu-4-NA) als Donorsubstrat und durch Hemmung irgendwelcher nicht-enzymatischer Spaltungen des Donorsubstrats ein Reagens zur Verfügung zu stellen, mit dem die Aktivität der /^-Glutamyltranspeptidase wesentlich genauer als bisher bestimmt werden kann. Wie vorstehend bereits erwähnt, zeigt das Donor substrat. Glu-4-NA bei den. bekannten Methoden nur eine Löslichkeit bis zu 4 rtiM in Wasser oder Pufferlösungen. In den Reagenzien der Erfindung dagegen läßt sich z.B.

²^ mit 0,3 Gewichtsprozent pro Volumen Cyclodextrinen eine Löslichkeit von 16 mM (mindestens das Vierfache) erreichen.

Der Zusatz von Cyclodextrinen bewirkt neben der vorstehend erwähnten Erhöhung der Löslichkeit von Glu-4-NA auch eine Stabilisierung des Glu-4-NA. Beim Stehenlassen einer wäßrigen Lösung oder einer Pufferlösung (4 mM) von Glu-4-NA bei Raumtemperatur erreicht die Menge der Zersetzung nach 24 Stunden bereits etwa 27 μΜ, nach 48 Stunden etwa 55 μΜ, nach 72 Stunden etwa 80 μΜ und nach 96 Std. etwa 108 μΜ. Es wurde bereits gefunden, daß etwa 10 % der ^"-GTP-Aktivität nach 24 Stunden gehemmt werden aufgrund des durch Zersetzung gebildeten 4-Nitroanilins, das die katalytische Wirkung von ^-GTP hemmt. Im Gegensatz dazu läßt sich bei Zusatz von Cyclodextrinen kaum eine nicht-enzymatische

Spaltung von Glu-4-NA auch nach 24 Stunden beobachten, und selbst nach 120 Stunden ist das Ausmaß der Zersetzung nahe-

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— >4 —

zu das Gleiche wie nach 24 Stunden bei den bekannten Reagenzien, die keine Cyclodextrine enthalten.

Da durch Zusatz von Cyclodextrinen die Löslichkeit und Stabilität von GIu-4-NA erhöht wird und dieser Zusatz keinen Einfluß auf die katalytische Funktion von /"-GTP hat, gestatten die Reagenzien der Erfindung die Bestimmung der /"-GTP-Aktivität in wesentlich genauerem Ausmaß als die bekannten Verfahren.
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Bei Untersuchungen über die Chemie von Enzymen ist die Bestimmung der kinetischen Konstante (Km) eine der wichtigen Aufgaben. Aufgrund schlechter Löslichkeit des Donorsubstrats wurde die Bestimmung der K. für /*-GTP bisher derart durchgeführt, daß die Bestimmung in einem Bereich niedrigerer Konzentration erfolgte und eine abschätzende Berechnung im Bereich höherer Konzentration durchgeführt wurde. Nunmehr ist die Herstellung einer Donorsubstratlösung im Bereich höherer Konzentration durch die Erfindung möglieh, wodurch Meßwerte mit wesentlich größerer Genauigkeit erhalten werden als bei dem bekannten Verfahren.

Als Cyclodextrine können erfindungsgemäß die üblichen Cyclodextrine verwendet werden, wie cx'-Cyclodextrin, ß-Cyclodextrin und /"-Cyclodextrin. Auch ein Gemisch dieser Cyclodextrine kann verwendet werden. Alle diese Verbindungen . können verwendet werden und es bestehen keine bestimmten Bedingungen hinsichtlich Reinheit usw. Im Hinblick auf die Kosten und die Wasserlöslichkeit wird ß-Cyclodextrin bevorzugt verwendet.

Ein besonderer Vorteil der Reagenzien der Erfindung ist darin zu erblicken, daß sie in Form eines gefriergetrockneten Präparats geschaffen werden können. Bisher konnten Reagenzien zur Bestimmung der /"-GTP-Aktivitat, die Glu-4-NA als Hauptbestandteil enthalten, nur in einer Kon-

ζentration von 4 mM unter Verwendung der verschiedensten Mittel zur Verbesserung der Löslichkeit aufgrund der vorstehend erwähnten schlechten Löslichkeit von Glu-4-NA hergestellt werden. Dementsprechend war es nicht möglich, gefriergetrocknete Präparate als Reagenzien herzustellen.

Durch die gemeinsame Verwendung von Cyclodextrinen ist es erfindungsgemäß nun möglich, die Reagenzien in Form eines gefriergetrockneten Präparats zu schaffen. Die Verwendung eines Produkts, das durch Gefriertrocknung einer Lösung von Glu-4-NA und Cyclodextrinen erhalten worden ist, ermöglicht die Bestimmung von ^"-GTP in einfacher und.glatter Weise. Die Erfindung hat somit den weiteren Vorteil, daß das Verfahren zur Bestimmung von ^f-GTP erheblich vereinfacht ist.

Die nachstehenden. Beispiele erläutern, die. Erfindung.

Be i s ρ i e 1 1 20

Bestimmung der /"-GTP-Aktivität

A. Herstellung der Reagenzien

(a) Pufferlösung: 6,2 g Glycylglycin und 10,5 g Diäthanolamin werden in etwa 900 ml destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wird mit Salzsäure auf einen pH-Wert von 8,2 (bei 30⁰C) eingestellt und mit destilliertem Wasser auf 1000 ml aufgefüllt.

(b) Donorsubstratlösung: 4,6 g L-/'-Glutamyl-4-nitroanilid und 2,7 g Cyclodextrine werden in 100 ml der in (a) hergestellten Pufferlösung gelöst.

(c) Lösung für die Messung: 300 ml der in (a) hergestellten Pufferlösung und 100 ml der in (b) hergestellten Donorsubstratlösung werden miteinander vermischt.

L J

B. Durchführung der Messung

2,5 ml der in (c) hergestellten Lösung für die Messung werden etwa 2 Minuten auf 3O⁰C erwärmt. Sodann werden 0,1 ml der zu bestimmenden Enzymlösung zugegeben, und das Gemisch wird gründlich geschüttelt. Die Zunahme der Absorption bei 405 nm wird in Abständen von 1 Minute mittels eines Spektrophotometers gemessen.

C. Berechnung der Aktivitätseinheiten Die Zunahme der Absorption pro Minute wird mit X bezeichnet. Die Aktivitätseinheiten werden nach folgender Gleichung berechnet:

Aktivitätseinheit = £* t't λ x "1000 = Xx 2626 IU/1.

y , y χ υ f ι

Beispiel 2

Bestimmung der kinetischen Konstante (K ) von <f-GTP gegen Glu-4-NA
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A. Herstellung der Reagenzien

. . Unter Verwendung der in Beispiel 1 beschriebenen Pufferlösung (a) und der Donorsubstratlösung (b) werden die folgenden Lösungen hergestellt:
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(1) 39 ml dor Pufferlösung werden zu 1 ml der Donorsubstratlösung (0,4 mM) gegeben.

(2) 38 ml der Pufferlösung werden zu 2 ml Donorsubstratlösung (0,8 mM) gegeben.

(3) 37 ml der Pufferlösung werden zu 3 ml der Donorsubstratlösung (1,2 mM) gegeben.

(4) 36 ml der Pufferlösung werden zu 4 ml der Donorsubstratlösung (1,6 mM) gegeben.

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. δ"

(5) 35 ml der Pufferlösung werden zu 5 ml der Donorsubstratlösung (2,0 mM) gegeben.

B. Durchführung der Messung

0,1 ml einer Lösung von /"-GTP von etwa 100 IÜ/1 werden zu jeweils 2,5 ml der vorstehend, unter A hergestellten Lösungen (1) bis (5) gegeben, und eine Zunahme der Absorption bei 405 nm wird in Abständen von jeweils 1 Minute gemessen. Die erhaltene Zunahme der Absorption pro Minute für jede der Lösungen wird ausgedrückt durch Xi (X - Xg).

C. Bestimmung von K_m

Die Konzentration von Glu-4-NA, die Xi entspricht, wird ausgedrückt als Si (S₁ -S₅). Der Wert von ττ-τ— auf der

Ordinate wird gegen den Wert rr- auf der Abszisse aufgetragen. Sämtliche Punkte werden durch, eine gerade
Linie miteinander verbunden. Die beiden Enden der
Linie werden verlängert. Der Wert an der Schnittstelle
der verlängerten Linie und die Abszisse ergibt den Wert für - —rj— . Somit ergibt der absolute Wert des umgekehrten Werts an der Schnittstelle den Wert K .

Beispiel- '3
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Herstellung des gefriergetrockneten Präparats.

4,6 g L-«f-Glutamyl-4-nitroanilid und 2,7 g Cyclodextrine

werden in 100 ml destilliertem Wasser gelöst. 3 ml Anteile

der erhaltenen Lösung werden gefriergetrocknet.

Das erhaltene gefriergetrocknete Präparat liefert beim
Auflösen in 3 ml Wasser oder einer Pufferlösung eine

mM Lösung von Glu-4-NA. Das gefriergetrocknete Präpa-

rat ist sehr stabil im Vergleich zu Glu-4-NA allein in

fester Form, und es läßt sich stabil lagern.

L ' · J

1 Gewerbliche Anwendbarkeit

Die Reagenzien zur Bestimmung der Aktivität von «f-Glutamyltranspeptidase der Erfindung haben im Vergleich zu den 5 bisher bekannten Reagenzien zur Bestimmung der Aktivität von /'"-Glutamyltranspeptidase ( ^-GTP) folgende Vorteiles

1. Die Herstellung von Donorsubstratlösungen im höheren Konzentrationsbereich wird möglich, wodurch Messwerte

10 mit wesentlich größerer Genauigkeit als beim Stand der Technik erhalten werden;

2. die nicht-enzymatische Spaltung des Donörsubstrats ist gehemmt, so daß Meßwerte mit größerer Genauigkeit als bei dem bekannten Verfahren erhalten werden.

15 3. Da das Produkt als gefriergetrocknetes Präparat anfällt, ist die Durchführung der Messung wesentlich ein*- facher und leichter als beim bekannten Stand.der Technik.

20 Die Reagenzien zur Messung der /"-GTP-Aktivität der Erfindung finden in breitem Umfang Verwendung, z.B. als Diagnostika in der Medizin sowie für Untersuchungen in der Enzymchemie.

L . = J

Claims

1 Patentanspruch

Reagenzien zur Bestinonung der Aktivität von /"-Glutamyltranspeptidase, gekennzeichnet durch 5 einen Gehalt an /^-Glutamyl-4-nitroanilid und Cyclodextri nen.

L . J