DE2110658C - Reagens zur Bestimmung von Gesamt Bilirubin - Google Patents

Description

5. Reagens nach Anspruch 3 oder 4, dadurch daß die erzeugte Farbe keine gute Beständigkeit aufgekennzeichnet, daß die Konzentration der Säure 25 weist.

0,01 bis 0,2 M ist. Der im Anspruch 1 angegebenen Erfindung liegt

6. Reagens nach einem der vorhergehenden die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes Reagens zur Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Bestimmung von Gesamt-Bilirubin zu schaffen, wel-Diazoniumsalz in einer Menge von 0,03 bis ches die obengenannten Nachteile nicht aufweist und 0,1 Gewichtsprozent, bezogen auf das Volumen 30 insbesondere hohe Anwendungsgenauigkeit, breiten der mineralsauren Alkylphenolpolyäthylenoxyd- Anwendungsbereich, gute Stabilität und einfachste lösung, vorliegt. Anwendungsmöglichkeit besitzt.

Das erfindungsgemäße Reagens kann nur aus den beiden Bestandteilen gemäß Anspruch 1 bestehen und

35 wird dann durch Zugabe einer verdünnten Mineralsäure gebrauchsfertig gemacht. Zweckmäßiger be-^λ steht das Reagenz jedoch aus einer mineralsauren Lö-

Die Feststellung des Bilirubingehaltes im Serum ist sung des Alkylphenolpolyäthylenoxyds und getrennt in der medizinischen Diagnose von erheblicher Be- davon festem Diazoniumsalz, wenn eine längere deutung. Die Bestimmung im Serum erfolgt üblicher- 40 Lagerungsfähigkeit gewünscht wird. Wenn eine Lageweise nach dem Verfahren von L. Jendrassik (Bio- rungsfähigkeh von etwa einem Monat ausreicht, kann ehem. Z., 297, S. 81 [1938]) durch Kupplung des das erfindungsgemäße Reagens auch allein aus einer Bilirubins mit einem Diazoniumsalz und Messung des Lösung des Diazoniumsalzes und des Alkylphenolgebildeten Azobilirubins durch optische Methoden. polyäthylenoxyds in verdünnter Mineralsäure bestehen. Ein Problem dieses Verfahrens besteht darin, daß 45 Die Konzentration der als Lösungsmittel im erfin-Azobilirubin relativ schwer löslich ist, so daß beson- dungsgemäßen Reagens angewendeten Säure liegt dere Maßnahmen ergriffen werden müssen, um die zweckmäßig zwischen 0,01 und 0,2 M, vorzugsweise Löslichkeit zu verbessern. Durch Alkalisieren der 0,06 bis 0,1 M. Als Säure wird bevorzugt Salzsäure Mischung ist es möglich, das Azobilirubin in Lösung verwendet. Andere Mineralsäuren entsprechender zu halten. 50 Stärke wie Phosphorsäure, Schwefelsäure u. dgl. kön-

Klinisch wird sogenanntes »indirektes« und »direk- nen jedoch ebenfalls verwendet werden,
tes« Bilirubin unterschieden, wobei ersteres im we- Wenn das erfindungsgemäße Reagens in gebrauchs-

sentlichen freies Bilirubin darstellt und fester an fertiger Form als Lösung vorliegt, soll die Konzen-Serumeiweiß gebunden ist als das »direkte« Bilirubin, tration des Alkylphenylpolyäthylenoxyds zweckmäßig das vor allem aus Bilirubin-Glucuroniden besteht. 55 zwischen 2 und 10 Volumprozent liegen. Bei Unter-Nach dem Verfahren von Jendrassik wird das in- schreiten dieses Konzentrationsbereichs wird der Prodirekte Bilirubin mit einer Mischung von Coffein und portionalitätsbereich der Bestimmung nachteilig be-Natriumbenzonat in Lösung gebracht und kann so einflußt, bei Überschreiten der oberen Grenze steigt in der Bestimmung erfaßt werden. die Viskosität der Lösung, so daß das Pipettieren

Dem Verfahren haften jedoch noch verschiedene 60 schwierig wird.

Nachteile an. So sind die verwendeten Diazonium- Die Konzentration des Diazoniumsalzes Hegt

salze in bezug auf Stabilität und Reaktionsbereitschaft zweckmäßig zwischen 0,03 und 0,1 °/o Gew./Vol. nur mäßig zufriedenstellend. Infolge der geringen Bevorzugt wird eine Konzentration zwischen 0,04 und Löslichkeit des gebildeten Diazobilirubins kann nur 0,06 °/o Gew./Vol.

in bestimmten Konzentrationsbereichen gearbeitet 65 Als Diazoniumsalz wird das 2,5-Dichlorphenylwerden, so daß erhebliches Interesse an einer Ver- diazoniumchlorid bevorzugt, da es besonders stabil besserung der Löslichkeit und damit einer Erweite- und leicht erhältlich ist.
rung des Linearitätsbereichs besteht. Schließlich ist Unter den Alkylphenolpolyäthylenoxyden hat sich

ein Isooctyl-Polyätheroxyäthanol mit 5 bis 40 Äthy- Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung

lenoxydresten im Molekül besonders bewährt Der- weiter.

artige Produkte sind z. B. unter den Handelsnamen

Triton X-100 oder Triton X405 von der Röhm and Beispiel 1

Haas Comp., Philadelphia/USA, erhältlich. Ganz 5

allgemein sind die Alkylphenolpolyäthylenoxyde Ein sofort gebrauchsfähiges Reagens besteht aus:

geruchlos und verursachen keine Hautreizung. Auch _{25 2},5-Οϊ_εΜοφηεη_Υ1(ΰ3ζοηηΐΐη_ε1ι1θΓΪα,

sind sie biologisch abbaubar. stabilisiert

Außer dem Diazoniumsalz, dem Alkylphenolpoly- __{n 1} .. ' . . . .

äthylenoxyd und gegebenenfalls der verdünnten io 50 ml 0,1 M HCl, enthaltend

Mineralsäure kann das erfindungsgemäße Reagens 4 Volumprozent Octylphenylathylenoxyd

auch ein Stabilisierungsmittel enthalten, wie es üb- mit 5 bis 15 Äthylenoxydresten im Molekül.

licherweise bei den im Handel erhältlichen ^. „ _ . , , , „ _{n c} .

Diazoniumsalzen bereits vom Hersteller zugesetzt .P» Bilirubin-Besümmung erfolgt so daß 2,5 ml

wird, um eine Zersetzung zu verhindern. Ein solches i_S ^dieses ^*™™ /-^ ^blb™^b?^h _/ ^a.^ltie^em ξ™™

StabiUsierungsmittel ist für das erfindungsgemäße gemischt und die Extinküon nach 5 Minuten Stehen

Reagens zwar nicht wesentlich, seine Anwesenheit in ^bei Raumtemperatur bei 546 nrn gemessen wird gegen

den üblichen Mengen stört jedoch nicht. «f« i^ert von 0,25ml Serum und 2 5 ml

Das erfindungsgemäße Reagens weist eine Reihe °'h ^M HO, enthaltend 4 Volumprozent des obigen

wesentlicher Vorteile auf. Es ist leicht beweglich *. ^{A k}y phenolpolyathylenoxyds. Fi g. 1der Zeichnung

und ausgezeichnet pipettierbar. Die Bilirubin-Bestim- ²^*ⁱⁿ graphischer Darstellung die erhaltenen Ergeb-

mung wird wesentlich vereinfacht, da die Zahl der nisse.

Pipettierschritte auf zwei herabgesetzt wird. Dies er- B e i s d i e 1 2
möglicht es, die Bilirubin-Bestimmung als Monotest

durchzuführen. Der Linearitätsbereich der Bestim- »5 ^. _T, , ^- ,_ · ^ i.fu α υυ-,,κϊΓ.

mung beträgt bis zu 24 mg·/. Gesamt-Bilirubin gegen- _n ^D!^e Korrelation bei Durchfuhrung der Bdirabm-

über beispielsweise 7 mg·/» bei dem bekannten Besamung mit dem erfindungsgemaßen Reagens

Äthylenglykol enthaltenden Reagens. Gesamt-Bili- ^im Y,^erB^le>ch ^{zu dem} Verfahren von Jendrassik

rubinwerte im Serum bis zu 24 mgVo sind unverdünnt ^{a s} Bezugsme hode wurde festgestellt indem mit

meßbar. (Wichtig bei Bilirubin-Bestimmungen im 30 ™™ ^mit, ^B*™^b* ^mf&*^" ^Se™^m' ^*?

Säulingsblut.) Die Stabilität des Reagens ist sehr gut. ^{bls 16} ^⁰ Bilirubin enthielt, Gesamt-Bihrubm mit

Liegen Diaioniumsalz in fester Form und Alkyl- ^dem erfindungsgemaßen Reagens (y-Werte) sowie phenolpolyäthylenoxyd in salzsauer Lösung vor, so ^nach Jendrassik (Z-Werte) bestimmt wurde,

beträgt die Haltbarkeit bei +4° C mehr als ein Jahr. Die gefundenen Wertepaare wurden korrehert und Liegt das Reagens in Form einer einzigen gebrauchs- 35 ^{sind in} F1 g. 2 der Zeichnung dargestellt. Als Korre-

fähigen Lösung vor, so beträgt die Verwendbarkeits- lationsgerade wurde berechnet:

dauer bei kühler Lagerung mindestens 4 Wochen. y — —0,1389 + 1,0277 ·χ.
Hierbei ist es zweckmäßig, bei mehr als einer Woche

Lagerungsdauer in dieser Form den Leerwert des Der Korrelationskoeffizient r = 0,999.

Reagens zu bestimmen und mit zu berücksichtigen. 40

Die Linearität der Bestimmung ist sehi gut. Der Kor- Beispiel 3

relationskoefnäent beim Vergleich mit der Methode _{ längeren Lagerung geeignetes Reagens be-

nach Jendrassik betragt 0,999 und zeigt, daß das τΓ; ⁸ β β 6 6 &

Lambert—Beersche Gesetz sehr gut erfüllt ist. ^aus:

Zur Anwendung des erfindungsgemäßen Reagens 45 100 mg l.S-Dichlorphenyldiazoniumchlorid,

wird in eine bestimmte Menge desselben die zu be- lyophilisiert in einem Reagensfläschchen,

stimmende Serumprobe gegeben, gemischt und dann ₂₀„ _{ml 0 0}6 M HCl enthaltend

die Extinktion bei 546 nm gemessen, sobald ihr End- ^{ζυυ ml υ}'^{υο M} "^¹' ^enUldliena

wert erreicht ist, was gewöhnlich nach einigen Minu- 8 Volumprozent Dodecylphenolpolyäthylenoxyd

ten der Fall ist. 50 in einer Reagensflasche.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims (4)

ι · 2 auch die Saponifikation des indirekten Bilirubins noch Patentansprüche: unbefriedigend. Es wurden schon verschiedene Versuche unter-

1. Reagens zur Bestimmung von Gesamt-Bili- nommen, diese Nachteile des Jendrassik-Verfahrens rubin, bestehend im wesentlichen aus einem Di- 5 zu beseitigen. ,
azoniumsalz und einem Lösungsvermittler, da- Ein verbessertes Reagens zur Bestimmung des durch gekennzeichnet, daß es als Di- Gesamt-Bilirubins enthältÄthylenglykol als Losungsazoniumsalz 2,4-Dichlor-, 2,5-Dichlor- oder mittel. Ein Nachteil dieses Reagens besteht in der 2-Chlor-4-nitrophenyldiazoniumchlorid und als starken Viskosität, die zur Schherenbildung und zum Lösungsvermittler ein Alkylphenolpolyäthylen- io Einschluß von Luftblasen führt, welche die optische oxyd enthält. Bestimmung erheblich stören können. Nach einem

2. Reagens nach Anspruch i, dadurch gekenn- anderen Vorschlag wird als Lösungsvermittler ein zeichnet, daß das Alkylphenolpolyäthylenoxyd nichtionogenes sulfoniertes Benzimidazolderivat mit ein Octylphenolpolyäthylenoxyd mit 5 bis höherem Fettsäurerest verwendet. Dieses Reagens 15 Äthylenoxydresten im Molekül ist. 15 hat jedoch den Nachteil, daß die Stabilität der gebil-

3. Reagens nach Anspruch 1 oder 2, dadurch deten Farbstoffe so stark vermindert wird, daß keine gekennzeichnet, daß es das Diazoniumsalz in zuverlässigen Endpunkte erhalten werden. Vielmehr fester Form und das Alkylphenolpolyäthylenoxyd findet laufend eine weitere Farbveränderung statt, in mineralsaurer Lösung enthält. Schließlich ist auch ein Reagens im Handel, welches

4. Reagens nach Anspruch 3, dadurch gekenn- 20 Dimethylsulfoxyd als Lösungsvermittler enthält. Hierzeichnet, daß die mineralsaure Lösung 2 bis bei handelt es sich jedoch um eine toxische Substanz, 10 Volumprozent Alkylpheaolpolyäthylenoxyd die bei Kontakt leicht in die Haut penetriert und enthält. außerdem übelriechend ist. Auch wurde gefunden,