DE3038010C2 - Verfahren zur Inhibierung der Blutplättchen-Release-Reaktion und Blutsammelvorrichtung zur Durchführung des Verfahrens - Google Patents

Verfahren zur Inhibierung der Blutplättchen-Release-Reaktion und Blutsammelvorrichtung zur Durchführung des Verfahrens

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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Inhjbierung der Blutplättchen-Release-Reaktion bei der in vitro-Handhabung von Blutproben und eine Blutsammei-Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens. Das Verfahren und die Blutsammei-Vorrichtung nach der Erfindung eignen sich insbesondere zum Sammeln von Blut, das für Screening-Tests zur Aktivierung des Koagulationssystems verwendet wird.
Der Blutplättchenfaktor 4 (PF4) ist ein Protein mit geringem Molekulargewicht, das als Sekret von den <*- Granulaten der Blutplättchen abgeschieden wird, wenn die Zellen der Release-Reaktion unterliegen. Dieses Phänomen tritt auf, wenn die Blutplättchen im Anschluß an den Kontakt mit Subendothelgewebe und zahlreichen anderen physiologischen Mitteln, einschließlich Thrombin, Adenosin-diphosphat und Epinephrin, aktiviert werden. PF4 wird in einer Blutprobe unter Anwendung klassischer Radioimmunassay-Techniken gemessen. Leider führen die üblichen Techniken der Sammlung von Blut zu einer Aktivierung des Release-Mechanismus der gesammelten Blutprobe. Es muß daher sehr sorgfältig vorgegangen werden, um sicherzugehen, daß die gemessene Release-Reaktion ein Ergebnis der Aktivierung der Release-Reaktion in vivo und nicht in vitro ist.
Es wurden verschiedene Techniken und Versuche zur Stabilisierung gesammelter Blutproben gegen die Plättchen-Release-Reaktionen beschrieben.
Eine sorgfältige Handhabung der Blutproben ist erforderlich, um die Blutplättchenrelease-Reaktion zu inhibieren. Im allgemeinen wird das Blut unter Anwendung von Venopunkturtechniken unter Anwendung von Standard EDTA (Äthylendiamintetraessigsäure) enthaltenden Vakuum-Blutsammelbehältern gesammelt Das Blut wird mit dem EDTA in dem Behälter durch vorsichtiges Umdrehen vermischt, und der Behälter wird in ein Eisbad eingebracht. Nach 30 Min. wird die Probe bei 2500 g und bei 2—4°C während 20 Minuten zentrifugiert. Das Zentrifugieren muß innerhalb 2 h nach der Entnahme erfolgen. Das Plasma wird abgetrennt und direkt analysiert oder es kann bei 2—4°C während 24 h oder bei —20°C während bis zu 3 Monaten gelagert werden.
In Thrombosis Research, 6,543—548 (1975) wird das Sammeln von Blut in Anwesenheit von EDTA und Theophyllin beschrieben; es ist jedoch ein Zentrifugieren bei 0° C erforderlich,
In Thrombosis Research, 12,851 -861 (1978) wird das Sammeln von Blut zur PF4-Analyse in Anwesenheit des Blutplättchen-Release-Inhibitors EDTA, Prostaglandin E und Theophyllin beschrieben. Diese Verfahrensweise erfordert ebenfalls das nachteilige Zentrifugieren bei niedriger Temperatur.
Niemetz et al, Proc. Soc Exp. BioL Med.128, 658 (1968) beschreiben die Auswirkungen verschiedener Anästetika auf die Verhinderung der Gerinnung, der durch Adenosin-disphosphat und Thrombin induzierten Blutplättchenaggregation. Bei diesen Untersuchungen hat es sich gezeigt daß p-Aminobenzoyi-diäthylaminoäthanol-hydrochlorid (Procain) und verwandte Homologe, wie p-Aminobenzoyldibutylaminoäthanol (Butacain) und p-Butylaminobenzoyldimethylaminoäthanol (Tetracain) die durch Thrombin induzierte Blutplättchenaggregation inhibierten. Butacain und Tetracain inhibierten die durch ADP induzierte Blutplättchenaggre-· gation, wohingegen Procain dies nicht tat Butacain, Tetracain und Procain inhibierten die durch Thrombin induzierte Blutplättchenaggregation. Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß Procain und nicht Butacain und Tetracain die Freisetzung des Blutplättchenfaktors 4 während der Sammlung verhindert
Aus der DE-OS 28 24 588 ist eine Vorrichtung zum Sammeln von Blut bekannt, die aus einem teilweise evakuierten, verschlossenen Glasrohr besteht das ein Antikoagulans enthält. Maßnahmen zur Inhibierung der Blutplättchen-Release-Reaktion sind gemäß dieser Druckschrift nicht vorgesehen.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein einfaches Verfahren zur Inhibierung der Blutplättchen-Release-Reakiion bei der in vitro-Handhabung von Blutproben zur Verfügung zu stellen, sowie eine Blutsammeivorrichtung zur Durchführung des Verfahrens.
Die Lösung der Aufgabe ist hinsichtlich des Verfahrens im Patentanspruch 1 angegeben und hinsichtlich der Blutsammeivorrichtung zur Durchführung des Verfahrens im Patentanspruch 2.
Im allgemeinen ist eine etwa 10—30 millimolare Endkonzentration an p-Aminobenzoyldiäthylaminoäthanol oder der biologisch brauchbaren Säureadditionssalze davon im Blut wirksam zur Inhibierung der Blutplättchen-Release-Reaktion wobei etwa 15 millimolar eine wirksame Mepge ist. Biologisch brauchbare Säureadditionssalze beziehen sich auf zahlreiche Salze organischer oder mineralischer bzw. anorganischer Säuren, wie Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Jodwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure, Essigsäure, Benzoesäure, Toluolsulfonsäure, Ameisensäure und dgl., die geeignet sind zur Herstellung von Additionssalzen, die die biologische Aktivität von Proteinen, wie dem Blutplättchenfaktor 4, nicht zerstören.
2-Chloradenosin wird in etwa 0,05—1 millimolarer Konzentration etwa 0,1 millimolar in Kombination mit p-Aminobenzoyldiäthylaminoäthanol-hydrochlorid verwendet, um ein besonders wirksames, stabilisierendes Reagens bereitzustellen.
Diese Reagentien werden in einer üblichen, teilweise evakuierten Blutsammeivorrichtung verwendet, die Antikoagulatien, wie Äthylendiamintetraessigsäure (ED-TA) enthält. Derartigen üblichen Blutsammeivorrichtungen können wirksame Mengen der vorstehend be-
schriebenen Blutplättchen-Release inhibierenden Mittel injiziert werden oder die Vorrichtung kann so hergestellt werden, daß sie diese Ingredientien von vornherein enthält
Die erfindungsgemäße teilweise evakuierte Blutsammelvorrichtung besteht aus einem teilweise evakuierten Glasrohr mit Silikon-behandeltcm Stopfen, das EDTA als Antikoagulans und wirksame Mengen an 2-Chloradenosin und p-Aminobenzoyldiäthylaminoäthanol oder der biologisch brauchbaren Säureaddioiissalze davon zur Inhibierung der Blutplättchen-Release-Reaktion enthält
Ein teilweis: evakuiertes verschlossenes 10 ml-Glasrohr zum Sammeln von Blut enthält, 0,6 ml eines Reagens, das 2^0% EDTA, 0,025% 2-Chloradenosin, 6,60% p-Aminobenzoyldiäthylaminoäthanol-hydrochlorid, 0,3% Natriumchlorid enthält, wobei der pH-Wert mit Natriumhydroxid auf 6,5 eingestellt ist Die vorstehend angegebenen Prozentangaben sind Gew7VoL-%.
Das Verfahren und die Vorrichtung gemäß der Erfindung sind besonders geeignet zur Bestimmung des Blutplättchenfaktors 4, da das Sammeln und Handhaben der Probe stark erleichtert wird; beispielsweise ist kein Zentrifugieren bei niedriger Temperatur erforderlich.
Unter Anwendung von üblichen Venopunkturtechniken für mehrfache Probenentnahme werden zwei Blutproben entnommen. Die erste wird entnommen, um das System von aktivierenden Faktoren zu befreien, und die zweite wird in ein vorstehend beschriebenes 10 ml-Glasrohr abgezogen. Die Probe wird durch leichtes Umdrehen bzw. Schütteln vermischt, und das Rohr wird in ein Eisbad eingesetzt, um während mindestens 30 Minuten (nicht länger als 2 h) zu inkubieren. Anschließend wird das Rohr bei Raumtemperatur bei 2500 g während 20 Minuten oder bei 1500 g während 30 Minuten mit einem Plasmaseparator zentrifugiert. Das Plasma wird in ein Kunststoffrohr mit einer Kunststoffpipette überführt Die Probe kann bei 2—4° C während 24 h oder bei —20° C während bis zu 3 Monaten gelagert werden.
Der Blutplättchenfaktor 4 wird durch übliche Radio-Ii immunassay-Techniken bestimmt. Unter Verwendung der Methoden und Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung sind die normalen Konzentrationen des Plättchenfaktors 4 weniger als 5 ng/ml. Patienten mit einer Coronararterien-Erkrankung, nach einem chirurgischen Herzklappeneingriff, nach einer Coronar-Bypass-Operation, nach einem Myocardialinfarkt und mit Diabetes haben erhöhte Konzentrationen an Blutplättchenfaktor 4, bis zu 100 ng/ml.
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Claims (3)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Inhibierung der Blutplättchen-Release-Reaktion bei der in vitro-Handhabung von Blutproben, dadurch gekennzeichnet, daß man die Blutprobe mit einer wirksamen Menge an p-Aminobenzoyldiäthylaminoäthanol oder einem biologisch brauchbaren Säureadditionssalz davon behandelt, um die Freisetzung des Blutplättchenfaktors 4 zu inhibieren.
2. Teilweise evakuierte Blutsammeivorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, die ein Antikoagulans enthält, dadurch gekennzeichnet, daß sie p-Aminobenzoyldiäthylaminoäthanol oder ein biologisch brauchbares Säureadditionssalz davon zur Inhibierung der Blutplättchen-Release-Reaktion enthält
3. Blutsammei-Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie zusätzlich eine wirksame Menge an 2-Chloradenosin enthält
DE3038010A 1979-10-09 1980-10-08 Verfahren zur Inhibierung der Blutplättchen-Release-Reaktion und Blutsammelvorrichtung zur Durchführung des Verfahrens Expired DE3038010C2 (de)

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