DE2113762A1 - Bestimmung von Triglyceriden und Cholesterin im Blutplasma oder Blutserum - Google Patents

Description

224

Oxford Laboratories ban Mateo (California, USA)

Bestimmung von Triglyceriden und Cholesterin im Blutplasma oder Blutserum

Die Erfindung betrifft das Erkennen von Störungen im LipoidStoffwechsel, insbesondere die kolorimetrische Bestimmung des l'riglycerid- und des Cholesterinspiegels zwecks Feststellung des Vorhandenseins und der Art der Hyperlipoproteinämie.

In der zivilisierten westlichen Welt stehen Herz- und Kreislauferkrankungen als Todesursache an erster Stelle. Von den auf Herz- und Kreislauferkrankungen zurückzuführenden Todesfällen werden 60 $ durch Arteriosklerose und mit ihr verwandte Erkrankungen der Herzkranzgefäße verursacht. Allein in den Vereinigten Staaten sterben etwa 240 000 Menschen jährlich an Arteriosklerose und Erkrankungen der Herzkranzgefäße.

Dieses Problem ist so groß und schw erwiegend, daß Massenunt er suchung en erforderlich sind, um ein Früherkennen und Verhindern von Arteriosklerose und Erkrankungen der Herzkranzgefäße zu ermöglichen. Es ist bekannt, daß vor der Arteriosklerose und Erkrankungen der Herzkranzgefäße vor allein Störungen des Lipoidstoffv/echsels und des Kohlehydratatoffwechsels auftreten. Es ist erkannt //orden, daß bei Arteriosklerose oft der Cholesterin- oder Tiiglyceridspiegel erhöht sind. Man nimmt an, daß diese Störungen auf genetische Ursachen zurückzuführen und die ersten Störungen Auswirkungen von angeborenen Fehlern im Lipoidtransport sind. Die verschiedenen Arten dor Störungen sind als Hyperlipoproteinämie bezeichnet worden (Frederickson u.a. in M. Eng. J. jAed. VoI 276 , 1967).

109842/ 1 193

Die verschiedenen Arten der Hyperlipoproteinämie kann man zweckmäßig durch die Bestimmung des Cholesterin- und Triglyceridspiegels feststellen (Homogramm von Harlan, Arch. Intern. Med. Vol. 124, Juli 1969)· Bei Massenuntersuchungen zwecks Irüherkennung der Hyperlipoproteinämie genügt es dann, den Triglycerid- und Cholesterinspiegel des Blutplasmas zu bestimmen und jede Probe optisch zu kontrollieren. Prüflinge mit überhöhtem Cholesterin- und/oder Triglyeeridspiegel können dann weiter untersucht werfen. Es besteht daher ein Bedürfnis nach einer schnellen, billigen und zuverlässigen Methode zum Erkennen der Hyperlipoproteinämie.

fc In dem erfindungsgemäßen Verfahren zum Erkennen der Hyperlipoproteinämie wird Blutserum oder Blutplasma mit einem Lipoidlösungsmittel und Aluminiumoxid gemischt, das als Absorptionsmittel zum Entfernen von störenden Bestandteilen dient. Die gelösten Lipoide werden abgetrennt und auf einen überhöhten Triglycerid- und Gholesterinspiegel untersucht.

Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, durch Erkennen des Vorliegens einer Hyperlipoproteinämie und ihrer Art eine Früherkennung der Arteriosklerose und einer Erkrankung der Herzkranzgefäße zu ermöglichen.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in der Schaffung eines " verbesserten Verfahrens zur gleichzeitigen Bestimmung des Cholesterol- und Triglyceridspiegeis, wobei nur minimale Messungen und Verdünnungsmaßnahmen erforderlich sind, leicht erhältliche Einrichtungen verwendet werden können und unbeständige Reagenzien oder schwierige Verfahrenssehrxtte vermieden werden.

Die Erfindung schafft somit ein Verfahren zum Erkennen der Hyperlipoproteinämie und zur Bestimmung ihrer Art. Störende Bestandteile werden mit einem Aluminiumoxid enthaltenden Gemisch aus dem Blut bzw. Blutplasma entfernt. Der Cholesterin- und Triglycerid spiegel des Extraktes werden bestimmt. Auf diese Weise kann man das Vorhandensein einer Hyperlipoproteinämie und ihre Art bestimmen.

109842/1193

Die Zeichnung zeigt in einem Fließschema die Schritte des erf indung sg emäß en Verfahrens.

Das in der Zeichnung dargestellte, bevorzugte Ausführungsbeispiel des Verfahrens dient zur gleichzeitigen Bestimmung des Cholesterin- und Triglyceridspiegeis. In dem Schritt 16 werden Blutplasma und Isopropylalkohol in ein Extraktionsröhrchen gegeben. Dieses Extraktionsröhrchen kann vorher mit einem Extraktionsgemisch gefüllt, dicht verschlossen und bis zum Gebrauch in einem klinischen Laboratorium aufbewahrt werden. Mit einem aus Glas bestehenden Ext rakt ions röhre hen von 16x100 mm, das 2 g des Extraktionsgemisches enthält, hat der Erfinder gute Erfolge erzielt.

Dem erfindungsgemäßen Verfahren kann jede Substanz unterworfen werden, die Triglycerid und/oder Cholesterin enthält. In der Zeichnung ist angenommen, daß Blutplasma als Ausgangsmaterial verwendet wird, doch kann man mit gleich guten Ergebnissen auch 31utserum verwenden, da die störenden Bestandteile des Blutes in dem erfindungsgemäßen Verfahren von den neutralen Lipoiden getrennt werden. Man kann als Ausgangsmaterial auch Gewebe oder biologische Proben verwenden, deren Cholesterin- und/oder Triglycerid spiegel bestimmt werden soll. Vorzugsweise verwendet man Blutplasma oder Blutserum, bei dessen Entnahme sich die zu untersuchende Person im nüchternen Zustand befand. Der Alkohol und das Ausgangsmaterial können in beliebiger Reihenfolge in das Extrakt ionsröhrchen eingebracht werden.

Der Isopropylalkohol verursacht ein Gerinnen der Proteine, die danach von dem Extraktionsgemisch absorbiert werden, und bewirkt ein Auflösen der abzutrennenden Lipoide. Voraugsweise verwendet man zu diesem Zweck Isopropylalkohol. Man kann zwar auch andere Lösungsmittel für Triglycerid und Cholesterin, z.B. Chloroform, verwenden, doch hat es sich gezeigt, daß diese anderen Lösungsmittel kein so hohes Lösungsvermögen für das Cholesterin und das Triglycerid haben wie der Isopropylalkohol.

109842/1193

Zur Extraktion, verwendet man ein Gemisch von Absorptionsmitteln. Ein wichtiges Merkmal der Erfindung besteht in der Verwendung eines großen Anteils Aluminiumoxid als Absorptionsmittel. Bisher hat man bei der Extraktion Zeolith zum Entfernen störender Bestandteile des Blutplasmas oder Blutserums verwendet. Leider sind Zeolithe nicht beständig und müssen sie periodisch reaktiviert -werden, damit sie einwandfrei absorptionsfähig sind. Zeolithe verlieren ihre Aktivität schon nach Tagen, während das in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete, aktivierte Aluminiumoxid seine Aktivität mindestens ein Jahr lang behält.

Das als Absorptionsmittel verwendete Aluminiumoxid kann jede beliebige Korngröße haben. Gute Erfolge sind mit Zorngrößen im Bereich von 50-400 mesh erzielt worden. Bevorzugt wird das Aluminiumoxid Alcoa F-1 mit einer Korngröße von 48-100 mesh.

Das Absorptionsgemisch enthält ferner Kieselgur zum Entfernen des Bilirubins, soweit es nicht von dem Aluminiumoxid entfernt wird. Durch das Aluminiumoxid werden Phospholipoide, Monoglyceride und Diglyceride von den in dem Blutplasma oder Blutserum enthaltenden Triglyceriden getrennt. Zur genauen Bestimmung und Analyse ist eine saubere und vollständige Abtrennung der Triglyceride wesentlich. In dieser Beziehung hat Aluminiumoxid gegenüber den bisher verwendeten Zeolithen den Vorteil, daß es sich besser absetzt als die flaumigen Zeolithe.

Das Extraktionsgemisch kann ferner weitere Bestandteile enthalten, die bestimmte Aufgaben haben. Wichtig ist, daß der Hauptanteil aus Aluminiumoxid besteht. Beispielsweise kann man eine Störung durch Glucose dadurch vermeiden, daß man etwas Kupfersulfat und Kalk zusetzt. Infolge des Kalks ist ein alkalisches Medium vorhanden, in dem das Kupfer die Glucose oxidiert. Zum Absorbieren von unerwünschten Blutbestandteilen, die von dem Aluminiumoxid nicht absorbiert werden, gibt man vorzugsweise ein wenig aktivierten Zeolith hinzu:

109842/1193

Gewöhnlich braucht keiner der Zusatzstoffe in dem Ge samt ext raktionsgemisch in einem Anteil von mehr als 2 $ enthalten zu sein. Der Hauptanteil muß jedenfalls aus Aluminiumoxid bestehen. Vorzugsweise enthält das Gemisch mindestens 60 % Aluminiumoxid. Die nachstehende Zusammensetzung hat sich sehr gut bewährt: Aluminiumoxid 1000,0 g

wasserfreier Kalk 20,0 g

Kieselgur 20,0 g

wasserfreies CuSO. 0,5 g

Aktivierter Zeolith 0,5g

1047,0 g

Die Abtrennung der von dem Aluminiumoxid absorbierten, geronnenen Blutbestandteile wird durch ein kräftiges Mischen im Verfahrensschritt 12 unterstützt. Eine gründliche Berührung zwischen dem Isopropylalkohol, dem Blutplasma oder Blutserum und dem Extraktionsgemisch ist für eine vollständige Abtrennung der Triglyceride und des Oholesterins von den anderen Bestandteilen wesentlich. Man kann das Mischen von Hand oder mit anderen üblichen Mischeinrichtungen durchführen. Vorzugsweise wird ein Vortex-Mischer (Wirbelstrom-Mischer) verwendet, mit dem gleichbleibende Ergebnisse erzielt werden. Zum Mischen im Verfahrensschritt 12 behandelt man vorzugsweise das verschlossene Extraktionsröhrchen, das Blutplasma oder Blutserum sowie Isopropylalkohol enthält, 5-10 Sekunden lang in einem Vortex-Mischer.

Wenn die unerwünschten Bestandteile des Extraktionsgemisches vollständig absorbiert sind, wird im Verfahrensschritt 13 das Rohr zentrifugiert. Dann kann man die Feststoffe verwerfen und die Flüssigkeit zur Bestimmung der Triglyceride und des Gholesterins verwenden. Die Triglycerid-BeStimmung ist in dem Fließschema durch die Vorgangsfolge A dargestellt. Wie auch sonst wird zur kolorimetrischen Bestimmung vorzugsweise ein Vergleich zwischen einer Blindprobe, einer Normalprobe und einer unbekannten Probe vorgenommen. Die Normalprobe enthält Triglycerid in bekannter Konzentration in Isopropylalkohol. Als Normal-Triglycerid verwendet man vorzugsweise Triolein. Man zeichnet eine Eichkurve,

109842/ 1193

welche die Dichte bei verschiedenen Konzentrationen von z.B. 0, 100, 200 und 500 mg$ darstellt. Vorzugsweise verwendet man ein zum Wegwerfen nach dem Gebrauch bestimmtes Kulturröhrchen von 16x100 oder 16x125 mm aus Glas. In das mit "Blindprobe" bezeichnete Röhrchen gibt man 1,0 ml Isopropylalkohol, in das mit "Normalprobe" bezeichnete Röhrchen 1,0 ml der verdünnten Normalprobe und in jedes mit "unbekannte Probe" bezeichnete Röhrchen 1,0 ml Lipoidextrakt.

Im Verfahrensschritt 14 wird der lipoidextrakt zu Glycerin verseift, vorzugsweise mit konzentriertem Kaliumhydroxid, insbesondere mit 6,25 n-Kaliumhydroxid, das mit Hilfe einer Tropfflasche eingeführt wird. Bei dieser Konzentration genügt ein einziger Tropfen zum Verseifen der Triglyceride in 1,0 ml Lipoidextrakt. Zum vollständigen Verseifen wird nach dem Zusatz der Kaliumhydroxidlösung zu dem Lipoidextrakt das Röhrchen zugestöpselt, sein Inhalt zum Mischen geschüttelt und danach erwärmt, zweckmäßig in einem Wasserbad von 60-70° C. Im allgemeinen genügt eine Erwärmung während eines Zeitraums von 5 Minuten.

Nach dem Erwärmen werden die Röhrchen aus dem Wasserbad herausgenommen und wird in Verfahrensschritt 16 das verseifte Glycerin mit einem beliebigen, milden Oxidationsmittel oxidiert, vorzugsweise mit Natriummetaperjodat. Bei den angegebenen Probenmengen kann man gute Erfolge erzielen, wenn man 0,6 $> Natriumperjodat in verdünnter Essigsäure verwendet. In die dem Wasserbad entnommenen Röhrchen gibt man 1,0 ml des Oxidationsmittels.

In dem Schritt 17 findet eine Farbreaktion statt, so daß der Triglyceridspiegel kolorimetrisch bestimmt werden kann. In dem Oxidationsschritt 16 erhält man als Reaktionsprodukt Formaldehyd, das in dem Schritt 17 nach dem von Fletcher in Clin. Chim. Äcta 22, 1968, angegebenen Verfahren mit ß-Diketon umgesetzt wird. Als ß-Diketon verwendet man vorzugsweise Acetylaceton. Das Triglyceridderivat reagiert mit dem Acetylaceton unter Bildung eines gelben Dihydrolutidinderivates, das bei 405 myu absorbiert. In dem Schritt 17 verwendet man zweckmäßig eine Acetylacetonlösung, zu deren Herstellung 0,75 ml Acetylaceton zu 100 ml einer alko-

109842/1193

liolischen Ammoniaklösung mit einem pH-Wert von 6,0 zugesetzt wird, die aus Ammoniak als Puffersubstanz in Isopropylalkohol besteht. In dem Schritt 17 wird jeder Probe 0,5 ml dieser Acetylaceton!^ sung zugesetzt und mit ihr vermischt. Danach werden die Proben wieder zugestöpselt und in dem auf 60-70° G befindlichen Wasserbad 5 Minuten lang erwärmt.

In dem Schritt 18 erfolgt mit Hilfe eines Spektrophotometers die kolorimetrische Untersuchung. Die gemessene optische Dichte der erwärmten Lösung bei 405 m Ai wird mit der der Blindprobe verglichen. Für das Spektrophotometer werden Eichpunkte festgelegt, die Konzentrationen von 75, 150 und 300 mg$£ Triglycerid entsprechen. Die Bestimmung der optischen Dichte der unbekannten Probe ergibt dann den Triglyceridspiegel.

In der in dem Fließschema mit B bezeichneten Vorgangsfolge erfolgt die Gholesterinbestimmung. In dem Schritt 21 wird zu dem Lipoidextrakt ein farbbildendes Reagenz zugesetzt. Wie bei der TriglyceridbeStimmung verwendet man auch zur Gholesterinbestimmung zweckmäßig zum Wegwerfen nach dem Gebrauch bestimmte KuI-turröhrchen aus Glas, die mit "Blindρrobe", "Normalprobe" und "unbekannte Probe" bezeichnet worden sind. In das Röhrchen "Blindprobe" gibt man 1,0 ml Isopropylalkohol, in jedes der Röhrchen "Normalprobe¹¹ 1 ,'0 ml verdünnte Normalprobe. In das Röhrchen "unbekannte Probe" gibt man 1,0 ml des im Schritt 13 erhaltenen Lipοidextrakts. In dem Schritt 21 werden 3,0 ml des farbbildenden Reagenz zugesetzt, das aus dem Eerri-Ion besteht. Man kann jede beliebige, Ferri-Ionen enthaltende Substanz verwenden, z.B. eine Lösung von Eisen(III)-ehlorid (FeCl^.6HpO) in Essigsäure. In Anwesenheit von Essigsäure und von Schwefelsäure als Katalysator reagiert das Ferri-Ion mit dem Cholesterin unter Bildung eines violettfarbigen Reaktionsprodukts. Die Violettfärbung kann kolorimetrisch gemessen werden. Die Reaktion mit dem Ferri-Ion kann zweckmäßig in demselben Wasserbad vorgenommen werden, das bei der Triglyceridbestimmung zur Erwärmung verwendet wurde.

109842/1193

Nach dem Zusatz des farbbildenden Reagenz werden die Röhrchen zugestöpselt und wird ihr Inhalt vermischt, vorzugsweise in einem Vortex-Mischer. Dann werden die Röhrchen 5 Minuten lang in dem Wasserbad erwärmt, das auf 65° 0+5⁰O gehalten wird. Danach werden die Röhrchen herausgenommen und auf Zimmertemperatur abkühlen gelassen, ehe die bei 560 m/u gemessene optische Dichte mit der der Blindprobe verglichen wird. Wie bei der Triglyceridbestimmung wird eine Eichkurve gezeichnet, von der die unbekannten Werte abgelesen werden können.

Die gleichzeitige Bestimmung der Iriglyceride und des Cholesterins nach der vollständigen Extraktion aller störenden Bestandteile ermöglicht eine schnelle und genaue Bestimmung von Werten, mit deren Hilfe das Vorhandensein und die Art der Hyperlipoproteinämie leicht erkannt werden kann. Durch Untersuchung von nur zwei Proben und Pipettieren von drei Reagenzien kann man unter Verwendung von leicht erhältlichen Einrichtungen eine einfache und billige Analyse durchführen, die mit den bisher verwendeten Untersuchungsmethoden gut übereinstimmt.

1 09842/ 1 1 93

Claims (3)

1. — Q _

   Patentansprüche:

   Verfahren zur kolorimetrischen Bestimmung des Triglycerid- S spiegeis im Blutserum oder Blutplasma, wobei gelöste, neutrale Grlyceride aus Blutserum oder Blutplasma extrahiert und zu Glycerin verseift werden, das zu Formaldehyd oxidiert wird, worauf dieses unter Bildung eines gelben Reaktionsprodukts umgesetzt wird, dadurch gekennzeichnet, daß die gelösten G-lyceride durch Mischen mit einem Aluminiumoxid enthaltenden Absorptionsmittel abgetrennt werden.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Absorptionsmittel zum größten Teil aus Aluminiumoxid besteht und kleinere Anteile Kieselgur, Kupfersulfat, Kalk und aktivierten Zeolith enthält.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Absorptionsmittel mehr als 90 $ Aluminiumoxid enthält.

   10 9 8 4 2/1193

   AO .

   Leerse.ite