DE1523133B2

DE1523133B2 - Vergleichsstandard zur kolorimetrischen Bestimmung des Gesamtcholesterins im menschlichen Blutplasma

Info

Publication number: DE1523133B2
Application number: DE19641523133
Authority: DE
Inventors: Charles Pairlawn N.J. Fox (V.St.A.)
Original assignee: Warner Lambert Pharmaceutical Co
Current assignee: Warner Lambert Co LLC
Priority date: 1963-08-16
Filing date: 1964-08-03
Publication date: 1970-11-05
Also published as: US3260648A; DE1523133C3; DE1523133A1; GB1066459A; ES303140A1

Description

1 2

Die Erfindung betrifft einen neuen Vergleichs- In Diagnosehilfsmitteln, die lyophilisiertes Menstandard zur kolorimetrischen Bestimmung des Ge- schenblutplasma enthalten, findet man zwar Cholesamtcholsterins im Menschenblutplasma. Dieses Mittel sterin, doch schwankt ihr Gesamtcholesteringehalt je besitzt einen Gehalt an lyophilisiertem Menschenblut- nach Cholesterinspiegel im Komplexblut. Aus diesem plasma mit bekanntem und standardisiertem Gehalt 5 Grund läßt sich lyophilisiertes Blutplasma nicht an durch gewisse Lösungsvermittler löslich gemachtem schlechthin als Vergleichsstandard bei klinischen Cholesterin und/oder Cholesterinfettsäureestem. Ins- Bestimmungsmethoden des Serumcholesterinspiegels besondere beschäftigt sich die Erfindung mit bestimm- im Blut verwenden, und daher besteht ein ausgeten Lösungsvermittlern, die ohne wesentlichen Stör- sprochener Bedarf an einem komplexen Menschenbluteinfluß auf die üblichen Testmethoden anwendbar io plasma mit auf Standardwert eingestelltem Gesamtsind, welche mit dem neuen Vergleichsstandard durch- cholesteringehalt, damit man den Cholesterinspiegel geführt werden, der nach Wiederinlösungbringen das einer Blutserumprobe durch einfachen Vergleich mit Gesamtcholesterin enthält. einer Standardprobe bestimmen kann. Eine einfache

Cholesterin als solches oder in Esterform, dazu oft Zugabe des Cholesterins zu derartigen Diagnosehilfsauch noch seine Derivate Dihydrocholesterin und 15 mitteln stößt aber deswegen auf Schwierigkeiten, weil 7-Dihydrocholesterin, bilden einen wesentlichen Be- sich das Cholesterin beim Wiederauflösen des lyophilistandteil aller tierischen und pflanzlichen Zellen. sierten Blutplasmas im Wasser schlecht löst. Dieses Verestertes sowie auch freies Blutcholesterin ist eines mangelnde Auflösungsvermögen stört aber die analyder hauptsächlichsten Blutlipoide und liegt zusammen tische Testdurchführung, die nun mit Hilfe des wiedermit den gesamten Fettsäuren, Triglyceriden und 20 aufgelösten, lyophilisierten Blutplasmas durchgeführt Phosphatiden vor. Im Blut ist das Chlolesterin zu fast wird, dessen Cholesterinspiegel aber nicht dem Gegleichen Teilen auf das Plasma und die Korpuskeln samtcholesterinspiegel gleich ist.
verteilt, wobei die Leukocyten cholesterinreicher sind. Ein brauchbares Diagnosehilfsmittel muß rasch und Menschenblutplasma enthält normalerweise in je einfach anwendbar sein und genaue Ergebnisse liefern. 100 ml 100 bis 320 mg und im Mittel 160 mg Gesamt- 25 AU diese Vorteile waren bisher bei Präparaten mit cholesterin, wobei etwa ¹J₁ aus freiem Cholesterin und Standardcholesteringehalt nicht erreichbar, weil beim die restlichen ³/₄ aus Cholesterinestern von Fettsäuren Wiederauflösen von lyophilisiertem Blutplasma das bestehen. Die Summe aus freiem Cholesterin und Gesamtcholesterin schwer in Lösung zu bringen war. Cholesterinestern im Serum nennt man üblicherweise Es sind zwar viele Lösungsvermittler zum Auflösen von »Gesamtcholesterin«, und in diesem Sinne wird auch 3° Gesamtcholesterin in verschiedenen Flüssigkeiten, im vorliegenden Text dieser Ausdruck gebraucht. einschließlich Menschenblut, bekannt, sie stören jedoch

Der menschliche Organismus weist einen konstanten erfahrungsgemäß die Genauigkeit der analytischen

Cholesterinspiegel auf, der sich normalerweise nicht Tests bei den bevorzugt durchgeführten chemischen

wesentlich ändert. Untersuchungen über den Einfluß Blutanalysen.

von anomal hohem Gesamtcholesterinspiegel im Blut 35 Aufgabe der Erfindung ist es daher, den Vergleichs-

zeigten nun deutlich, daß er kontrolliert und innerhalb standard der eingangs genannten Art leicht löslich zu

der für einen bestimmten Patienten als normal ange- machen.

sehenen Grenzen gehalten werden sollte. Beispielsweise Erfindungsgemäß dient hierzu als Lösungsvermittler

pflegt der Gesamtcholesterinspiegel im Blutplasma eine Substanz der allgemeinen Formel
bei überhöhtem Blutzuckergehalt oder unkontrollierter 40
Diabetes anzusteigen. Außerdem ist erfahrungsgemäß

bei Arteriosklerose das Cholesterin das Hauptlipoid in der R entweder

im Gefäßwandinneren. Hohe Plasmacholesterinspiegel _{a) einen geradkettigetl} Alkylrest mit 12 bis 18 C-Ato- (\

findet man fernerhin bei Gelbsucht, Nierenentzun- _men QA_tr N dung, Alkoholvergiftung, Anästhesis, Schwanger- 45

schaft, Syphilis und als Folge von Nebennierenentfer- b) einen verzweigtkettigen Alkylrest mit 12 bis

nung. Eine Erhöhung des Gesamtserumcholesterin- 18 C-Atomen oder

spiegeis tritt auch bei Lebererkrankungen und damit _c) einen Niedrigalkylphenoxyrest oder

verbundener Verstopfung des Gallenflusses, der be- ,. . . , . „ „ , . „. _ .

kannten Hypercholesterinämie, bei Hyperthreose und 50 ^d) ^{emen Ac}y^{lrest mit 12 bis 22} C-Atomen

nephrotischem Syndrom auf. Niedrige Blutcholesterin- und η eine ganze Zahl zwischen 10 und 20 bedeuten,

spiegel andererseits treten bei schwerer Lebererkran- so daß der Vergleichsstandard nach Wiederinlösung-

kung, Schwindsucht, Unterernährung und Über- bringen auf Ausgangsvolumen bei 620 ηΐμ eine Extink-

funktion der Schilddrüse auf. Folglich ist die genaue tion von weniger als 0,450 aufweist.

Bestimmung des Gesamtserumcholesterinspiegels für 55 Der erfindungsgemäße Vergleichsstandard zeichnet

die moderne Diagnostik von großer Bedeutung. sich dadurch aus, daß sich das in ihm enthaltene

Die Verwendung von lyophilisiertem Blutplasma als Cholesterin beim Wiederauflösen leicht löst und sich Diagnosehilfsmittel in klinischen Laboratorien ist all- der in ihm enthaltene LösungsVermittler auf die gemein bekannt. Ein solches bei der chemischen Blut- üblichen Verfahren zur Bestimmung des Gesamtanalyse als Blutserumstandard verwendetes Präparat 60 cholesterinspiegels nicht nachteilig auswirkt,
ist beispielsweise ein menschliches Komplexserum mit Der erfindungsgemäße Vergleichsstandard wird Standardmengen an Proteinfeststoffen des Menschen- hergestellt, indem man dem Menschenblutplasma die blutplasmas einschließlich Bilirubin, Harnsäure, Thyro- normalerweise in ihm enthaltenen wenigen basischen globulin, Glycerin, Harnstoff, Dextrose, Creatinin und Bestandteile zunächst bis auf einen vorgegebenen Rest geringen Mengen verschiedener Natrium- und Ka- 65 entzieht und danach wieder in gereinigter Form bis zu liumverbindungen. Präparate dieser Art werden im einem bestimmten, festgesetzten Gehalt zugibt. Durch folgenden allgemein als lyophilisiertes Menschenblut- Vereinigen des so standardisierten Produkts mit beplasma bezeichnet. stimmten Zusätzen erhält man ein als Primärstandard

zur chemischen Blutanalyse brauchbares Diagnosehilfsmittel, dem man dann Gesamtcholesterin zusammen mit den erfindungsgemäßen Lösungsvermittlern zusetzen kann. Letztere kann man direkt mit einer bestimmten Menge heißen destillierten Wassers vermischen und dann in gleicher Gewichtsmenge zur Gesamtcholesterinmischung zugeben, wobei man die Wassertemperatur zwecks leichterer Auflösung des Cholesterins auf einem Wert zwischen 49 bis 93 ⁰C hält. Die Menge des dem Gesamtcholesterin zugesetzten Lösungsvermittlers liegt im Gewichtsverhältnis von 7,5:1 bis 15:1 und vorzugsweise bei 8:1 bis 10:1. Diese Cholesterinlösung kann man dann den modifizierten Menschenblutplasma direkt zugeben und die Lösung anschließend lyophilisieren.

Gibt man das Cholesterin in gelöster Form direkt dem modifizierten Menschenblutplasma zu, so soll die zugefügte Lösung zweckmäßigerweise etwa 2 bis etwa 5 Gewichtsprozent der Gesamtcholesterinlösung enthalten. Die Menge des dem modifizierten Menschenblutplasma zugegebenen Gesamtcholesterins hängt natürlich vom gewünschten Gesamtcholesterinspiegel im lyophilisierten Endprodukt ab. Statt dessen kann man auch das löslich gemachte Cholesterin dem Plasma erst unmittelbar vor dem Test zugeben. Das standardisierte wiederaufgelöste Blutplasmareagenz enthält auf je 100 ml 75 bis 500 mg und vorzugsweise 100 bis 325 mg Gesamtcholesterin. Auf das Mengenverhältnis von Cholesterin zu Cholesterinacetat im Testreagenz kommt es nicht an; es liegt aber für gewöhnlich zwischen etwa 0,1 und etwa 10,0 und am besten zwischen 0,5 und etwa 1,5.

Die folgenden Beispiele dienen zur weiteren Erläuterung der Erfindung. Alle Teile beziehen sich, falls nicht anders angegeben, auf Gewicht.

Bestandteil

Gewichtsteile

Standardblutserums sowie dieselbe Menge einer unbekannten, einem Patienten abgenommenen Probe ab und gibt diese Proben in etikettierte 50-ml-Zentrifugengläser mit Glasstopfen. Dann werden jeder Probe 5 ml alkoholische Kalilauge (6 ml einer 33 °/_oigen wäßrigen Kalilauge in 94 ml absolutem Alkohol) zugegeben, die Gläser verschlossen, gut geschüttelt, 55 Minuten lang bei 37 bis 40⁰C inkubiert und auf Zimmertemperatur abgekühlt. Nach Zugabe von je

ίο 10 ml Petroläther und etwa 1 Minute dauerndem Vermischen mit 5 ml Wasser werden die Proben in einer verhältnismäßig langsam umlaufenden Zentrifuge 5 Minuten oder so lange zentrifugiert, bis die Emulsion in zwei klare Schichten zerfällt. Dann wird je eine 4-ml-Probe der oberen, petrolätherhaltigen Schicht aus den Zentrifugengläsern entnommen und in kleine trockene Bechergläser überführt, in denen der Petroläther durch schwaches Erwärmen und Einblasen von Luft verdampft wird. Die trockenen Proben werden dann auf Zimmertemperatur abgekühlt.

Dem Rückstand werden in bestimmten Zeitabständen 6 ml modifiziertes Liebermann-Buchard-Reagens zugegeben, das aus 20 Volumteilen Essigsäureanhydrid, 1 Volumteil konzentrierter Schwefelsäure und 10 Volumteilen Eisessig hergestellt worden war. Genau 30 Minuten nach Reagenszugabe wird jede Probe in einem Spektrometer bei 620 πιμ gegen ein Klarwasser-Normal auf Extinktion untersucht. Dabei stellt man fest, daß die Extinktion einer Standardprobe mit 310 mg Gesamtcholesterin je 100 ml bei 620 πιμ 0,380 und die einer unbekannten Probe beispielsweise 0,163 beträgt. Aus dem Verhältnis der beiden Extinktionen errechnet sich hieraus der Gesamtcholesteringehalt der unbekannten Probe zu 200 mg je 100 ml

35 Plasma.

Beispiel 1

In ein 250-ml-Becherglas wurden die folgenden Bestandteile eingegeben und bei 100⁰C gleichmäßig vermischt:

45

Cholesterin*) 0,5 g

Cholesterinacetat 1,5 g

Oleylalkoholkondensat mit durchschnittlich 10 Mol Äthylenoxyd/Mol 10,0 g

Oleylalkoholkondensat mit durchschnittlich 20 Mol Äthylenoxyd/Mol 10,0 g

*) Reinheitsgrad nach dem USA.-Arzneibuch (United States Pharma copoeia; USP), d. h. unter anderem Schmelzbereich: 147 bis 150⁰C;

Spezifische Drehung: —34° bis —38°, bestimmt in einer 200 mg/10 ml starken Dioxanlösung; Trocknungsverlust: nicht über 0,3 Gewichtsprozent nach 4stiindigem Trocknen im Vakuum bei 6O⁰C; Glühverlust: höchstens 0,1%·

55

Nach gründlichem Vermischen dieser Bestandteile wurde die Mischung auf 82° C abgekühlt, mit 25 ml gleich heißem destillierten Wasser versetzt, unter schwachem Rühren langsam auf Zimmertemperatur abgekühlt und notfalls durch weitere Wasserzugabe auf genau 100 ecm aufgefüllt. 5 ml hiervon wurden in eine 25-ml-Ampulle mit Menschenblutplasma eingegeben und lyophilisiert. Dieser Plasmaansatz enthielt dann nach dem Wiederauflösen in je 100 ecm einen Gesamtcholesterinspiegel von 310 mg.

Zur Bestimmung des Gesamtcholesterins in einer unbekannten Probe pipettiert man 0,5-ml-Proben des in vorstehender Weise zubereiteten wiederaufgelösten

Beispiel 2

Folgende Bestandteile werden in ein 350-ml-Becherglas eingewogen und bei 100⁰C gleichmäßig vermischt:

Bestandteil Gewichtsteile

Cholesterin*) 0,125 g

Cholesterinacetat 0,375 g

Oleylalkoholkondensat mit durchschnittlich 3 Mol Äthylenoxyd/
Mol 10,0 g

Oleylalkoholkondensat mit durchschnittlich 10 Mol Äthylenoxyd/
Mol 10,0 g

Polyoxyäthylen - Polyoxypropylenkondensat 5,0 g

*) Siehe Fußnote zum Beispiel 1.

Die obigen Bestandteile werden gemäß Beispiel 1 behandelt. Die so erhaltene lyophilisierte Masse löst sich innerhalb von 30 Minuten schaum- und blasenfrei wieder auf; sie besitzt einen Gesamtcholesteringehalt von 300 mg je 100 ml wiederaufgelöstes Plasma sowie nach der im Beispiel 1 beschriebenen spektrometischen Methode bei 620 ΐημ eine Extinktion von 0,400.

Beispiel 3

Folgende Bestandteile werden in ein 250-ml-Becherglas eingewogen und bei 100°C gleichmäßig vermischt:

Claims

5 6 Bestandteil Gewichtsteile Blutplasma mit einem Gehalt an lyophilisiertem Cholesterin*) 0,5 g Menschenblutplasma sowie Cholesterin und/oder Cholesterinacetat 1,5 g Cholesterinfettsäureestern in bekannter Standard- Nonyl - phenoxypolyoxyäthylenäther menge und einem Lösungsvermittler, dadurch mit durchschnittlich 10 Mol Äthy- 5 gekennzeichnet, daß als Lösungsvermitt- lenoxyd/Mol 9,0 g ler eine Substanz der allgemeinen Formel Stearylpolyoxyäthylenäther mit durchschnittlich 20 Mol Äthylenoxyd/Mol 9,0 g RO(CH2CH2O)Jh Polyäthylenglykol(400)-monoeleat ... 2,0 g *) Siehe Fußnote zum Beispiel 1. 10 dient> in der R entweder Die obigen Bestandteile werden gemäß Beispiel 1 a) einen geradkettigen Alkylrest mit 12 bis behandelt. Die so erhaltene lyophilisierte Masse löst 18 C-Atomen oder sich innerhalb von 30 Minuten schaum- und blasenfrei b) einen verzweigtkettigen Alkylrest mit 12 bis wieder auf. Sie besitzt einen Gesamtcholesteringehalt 15 \% C-Atomen oder von 300 mg ie 100 ml wiederaufgelöstes Plasma sowie . . ^T. . . ,, , , , nach der im Beispiel 1 beschriebenen spektrometrischen c) emen Niedngalkylphenoxyrest oder Methode bei 620 πιμ eine Extinktion von 0,380. d) einen Acylrest mit 12 bis 22 C-Atomen B e i s ρ i e 1 4 20 un(j neinß ganze ^ahl zwischen 10 und 20 bedeutet, Die folgenden Bestandteile werden in ein 250-ml- so daß der Vergleichsstandard nach Wieder- Becherglas eingewogen und bei 100° C gleichmäßig inlösungbringen auf Ausgangsvolumen bei 620 ιημ vermischt". eine Extinktion von weniger als 0,450 aufweist. 2. Vergleichsstandard nach Anspruch 1, dadurch Bestandteil Gewichtsteile 25 gekennzeichnet, daß er als Lösungsvermittler eine Cholesterin*) 0,5 g Oleylalkoholkondensat mit 10 bis 20 Mol Äthylen- Cholesterinacetat 1,5 g oxyd je Mol Kondensat enthält. Nonyl - phenoxypolyoxyäthylenäther 3. Vergleichsstandard nach Anspruch 1, dadurch mit durchschnittlich 10 Mol Äthy- gekennzeichnet, daß er als Lösungsvermittler ein lenoxyd/Mol 9,0 g 30 Oleylalkoholkondensat mit durchschnittlich 10 Mol Oleylpolyoxyäthylenäther mit durch- Äthylenoxyd je Mol Kondensat und Polyoxyäthy- schnittlich 20Mol Äthylenoxyd/Mol 9,0 g len-Polyoxypropylenkondensat enthält. *) Siehe Fußnote zum Beispiel 1. 4· Vergleichsstandard nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er als Lösungsvermittler Die obigen Bestandteile werden gemäß Beispiel 1 35 Nonyl-phenoxypolyoxyäthylenäther mit im Mol behandelt. Die so erhaltene lyophilisierte Masse löst durchschnittlich 10 Mol Äthylenoxyd, Stearylpoly- sich innerhalb von 30 Minuten schaum- und blasenfrei oxyäthylenäther mit im Mol durchschnittlich wieder auf und besitzt 300 ml Gesamtcholesterin je 20 Mol Äthylenoxyd und Polyäthylenglykol(400)- 100 ml wiederaufgelöstes Plasma sowie nach der im monooleat enthält. Beispiel 1 beschriebenen spektrometrischen Methode 40 5. Vergleichsstandard nach Anspruch 1, dadurch bei 620 πιμ eine Extinktion von 0,380. gekennzeichnet, daß er als Lösungsvermittler _ ... Nonyl-phenoxypolyoxyäthylenäther mit im Mol Patentansprüche: durchschnittlich 10 Mol Äthylenoxyd und Oleyl-

1. Vergleichsstandard zur kolorimetrischen Be- polyoxyäthylenäther mit im Mol durchschnittlich

Stimmung des Gesamtcholesterins im menschlichen 45 20 Mol Äthylenoxyd enthält.