DE1773330C2

DE1773330C2 - Reagenz und Verfahren zur Bestimmung von Aldosen

Info

Publication number: DE1773330C2
Application number: DE1773330A
Authority: DE
Inventors: Arnold Dr. Haertel; Roland Dr. Helger; Hermann Dr. Lang
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 1968-05-02
Filing date: 1968-05-02
Publication date: 1975-03-27
Also published as: BE732223A; FR2007637A1; CH507519A; US3607077A; SE346387B; IL31981A0; NL6906734A; DE1773330B1; GB1248624A; IL31981A

Description

60 Die Erfindung betrifft ein Reagenz zur Bestimmung von Aldosen, insbesondere Glucose, Galaktose oder Xylose, in Körperflüssigkeiten, enthaltend ein o-substituiertes aromatisches Amin, insbesondere o-Toluidin, eine Säure und gegebenenfalls Wasser und/oder Thioharnstoff.

In klinischen Laboratorien muß häufig die Konzentration von Aldosen in Körperflüssigkeiten bestimmt werden. Am wichtigsten ist die quantitative Bestimmung von Galaktose bzw. Xylose und insbesondere von Glucose, vorzugsweise im Blut. Glucosebestimmungen dienen vor allem der sicheren Diagnose und der Therapiekontrolle des Diabetes mcllitus. Außerdem gibt der Blutzuckcrgclialt Hinweise auf eine Reihe anderer Stoffwechselstörungen (vgl. hierzu JI. H a I 1-m a η η, Klinische Chemie und Mikroskopie. S. 437, Gcorg-Thicme-Vcrlag, Stuttgart [1950]).

Es sind schon eine große Zahl von Verfahren zur Bestimmung von Aldosen, insbesondere /uf Bestimmung von Blutzucker, bekannt.

Eine Reihe von bekannten Verfahren, beispielsweise die aus Biochem. Zeitschrift, 135. S. 46 (1923); Biochem. Zeitschrift, 320, S. 359 (1950). und Münch. med. Wochenschrift. 75, S. 1301 (1928), bekannten Verfahren, beruhen auf dem Nachweis der reduzierenden Wirkung der Glucose. Da bei diesen sogenannten Reduktionsverfahren sämtliche reduzierende Stoffe mit erfaßt werden, sind diese Bestimmungen jedoch unspezifisch.

Bei einer anderen Bestimmungsmethode wird die Glucose mit entsprechenden Enzymen, beispielsweise Glucoseoxydase, umgesetzt, und anschließend werden

die durch die Enzymrenktion entstandenen Produkte gemessen. Die Enzymreaktion ist zwar spezilisch, die Indikatorreaktion aber störanfällig, z.B. gegenüber Reduktionsmitteln, wie Ascorbinsäure. Deshalb kann der Glucosegehalt mit Hilfe der Glucoseoxydase-Methode z. B. in Urin nicht genau bestimmt werden. Außerdem besitzt diese Methode ebenso wie auch die anderen enzymatischen Verfahren den Nachteil, daß die Enzyme nur begrenzt haltbar sind.

Ferner ist die Bestimmung von Glucose durch Umsetzung mit Anilin, p-Aminosalicylsäure, p-Bromanilin oder Diphenylamin in Eisessig oder auch anderen Säuren bekannt. Diese Reaktion wurde zum Sichtbaimachen von einzelnen getrennten Zuckern auf Papier- und Dünnschichtchromatogrammen verwendet (vgl. hierzu z. B. J. chrom., 24, S. 117 [1966], und Scand. J. CIm. Lab. Invest.. 20, S. 216 [1967]). Zur Bestimmung von nicht «u fgetrennten Aldosengemisclien ist jedoch diese Methode schlecht geeignet, da die Reak- lion iinspezilisch ist. Unter den Bedingungen dieser Bestimmung absorbieren nämlich sowohl Aldohcxoscn, z. B. Glucose oder Galaktose, als auch Aldopentosen, t. B. Xylose, und Ketosen, z. B. Fructose, im nahen UV-Bereich, so daß z. B. die Pcnlo'en nicht getrennt von den Hexosen gemessen werden können.

Gegenwärtig wird allgemein in den klinischen I.aboratorien die beispielsweise in Nature, 183, S. 108(1959), beschriebene Methode zur Blutzuckerbestimmung angewandt, bei der eine Lösung von o-Toluidin in Eiscssig als Farbreagenz verwendet wi; 1. Dieses Reagenz kann durch einen Zusatz von thioharnstoff, der einen Autoxydationsschulz bewirkt, stabilisiert werden, so daß es gut haltbar ist (Clin. Chim. Acta, 7, S. 140 [1962]). Der mit Glucose sich bildende Farbstoff wird bei der o-Toluidin-Mcthodc bei 620 nm gemessen, während mit dem Anilin-Fisessig-Verfahren im nahen UV-Bercich gemessen werden muß. Die o-Toluidin-Mcthode hat den Vorteil, daß sie spezifisch für Aldohexosen i>t, wenn bei 620 nm gemessen wird, und daß sie für Aldopentosen weitgehend spezifisch ist, wenn bci 4SO nm gemessen wird.

Wegen der guten Spczifität gehört die o-Toluidin-Methode heute zu den Standardmethoden im klinisehen Laboratorium. Sie besitzt jedoch noch einen großcn Nachteil: Ksergeben sich große Schwierigkeiten *5 durch die Reizwirkung des als Losungsmittel verwendcten Eisessigs. Nahezu bei der gesamten Durchführung der Analyse, d. h. bei der Pipctticrung des Reagenzcs, hei der Umsetzung der Glucose bei 100 C in Reagenzgläscrn. hei der Messung im Photometer und l-cim Reinigen der Gefiiße kommt es zu einer starken Geruchf.tclästigiing. Bei der Durchführung von einigen hundert Analysen pro Tag, wie es in großen Kliniken üblich ist, wird der Essigsäuredampf zum ernsten Problem für die Arbeitskräfte.

L⁷S wurde schon vorgeschlagen, an Stelle von Eisessig 50°/₀ige Essigsäure zu verwenden (Ärztl. Labor, 13, S. 177 bis 180 [1967]), um die Geruchsbeläsiigung wenigstens teilweise zu verringern. Mit diesem Lösungsmittel ergeben sich jedoch längere Reaktionszeiten und fio wesentlich geringere Farbausbeuten, so daß sich diese Methode in der Praxis nicht durchsetzen konnte.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Reagenz zur Bestimmung von Aldosen, insbesondere Glucosen, Galaktose oder Xylose, in Körperflüssig-65 keiten, enthaltend ein o-substituiertes aromatisches Amin, insbesondere o-Toluidin, eine Säure und gegebenenfalls Wasser und/oder Thioharnstoff, das da- durch gekennzeichnet ist, daß die Säure aus einer hydroxylgruppenhaltigen Mono-, Di- oder Tricarbonsäure mit 2 bis 6 C-Atomen oder aus einem Gemisch solcher Säuren besteht.

Ferner umfaßt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung von Aldosen, insbesondere von Glucose, Galaktose oder Xylose, in gegebenenfalls enteiweißten Körperflüssigkeiten, durch Erhitzen der zu untersuchenden Probe mit der Lösung eines aromatisehen o-substituierten Amins, insbesondere von o-Toluidin, und anschließende Extinktionsbestimmung des gebildeten Farbstoffs, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man das vorstehend definierte und im folgenden näher beschriebene Reagenz anwendet.

Ein Hauptvorteil des neuen Reagenzes besteht darin, daß der bisher verwendete Eisessig überflüssig ist bzw. nur in geringerer Konzentration als bei der o-Toluidin-Standardmethode angewendet wird und bei der Anwendung keine bzw. nur eine verminderte Geruchsbelästigung auftritt und daß mit dem neuen Reagenz eine günstige Reaktionsgeschwindigkeit und gute Farbausbeuten erzielt werden. Das neue Reagenz bietet die Möglichkeit, durch Veränderung der Konzentration seiner einzelnen Bestandteile die Geschwindigkeiten der Farbbikiung und die Empfindlichkeit in weiten Grenzen den jeweiligen Erfordernissen anzupassen. Man kann die Reaktion wesentlich empfindlieher bzw. die Beständigkeit des gebildeten Farbstoffs größer machen als bei den bisher bekannten Verfahren.

Die glatte Bildung des spezifischen Farbstoffs mit dem Reagenz der vorliegenden Erfindung ist erstaunlieh, da z. B. Flalogenfettsäuren, Thiosäuren, nicht hydroxylierte Dicarbonsäuren oder auch anorganische Säuren nicht die in dem Reagenz der vorliegenden Erfindung vorzugsweise enthaltenen, gut wirksamen hydroxylgruppenhaltigen Carbonsäuren vertreten können. Außerdem können auch organische oder anorganische Lösungsmittel ohne Säurezusatz nicht mit Erfolg für die Reaktion herangezogen werden, da mit ihnen keine meßbaren Farbausbeuten erhalten werden. Demgegenüber liefert bemerkenswerterweise das Reagenz der vorliegenden Erfindung, in dem eine spezielle Gruppe von Säuren, gegebenenfalls in Kombination mit einem Lösungsvermittler, verwendet wird, ausgczeichnete Meßergebnisse bei einfacher Handhabung des Verfahrens.

Unter den für das crfindungsgemäße Reagenz zu verwendenden aromatischen, in einer o-Stellungsubsti-Uiiertcn Aminen sind solche bevorzugt, die leicht destillieirbar sind. Gegebenenfalls können die Amine auch in 3- und/oder 4- und/oder 5-Stellung zusätzlich subslituiert sein. Die bevorzugt verwendeten Amine, insbesondere die durch niederes Alkyl, wie C1I_;!, C₂H-, in o-Stellung oder in 2.3- oder 2,4- oder 2,5-Stcllung substituicrtcn Aniline, wie beispielsweise o-Toluidin, 2,3-Dimethylanilin. 2.5-Dimeihylanilin, 2.5-Diäthylanilin, 2,4-Xylidin, lassen sich leicht von den stets in größeren oder kleineren Anteilen enthaltenen störcnden Autoxydationsprodukten durch Destillation rcinigen. Besonders bevorzugt ist o-Toluidin. Die Konzentration des Amins beeinflußt die Farbausbeute und die Beständigkeit des gebildeten Farbstoffes, so daß man durch Verändern der Konzentration ein den speziellen Erfordernissen angepaßtes Reagenz herstellen kann.

Die in dem Reagenz nach der Erfindung verwendeten Amine, in denen eine der beiden o-Stellungen substituiert ist, insbesondere o-Toluidin, ergeben vorteilhafterweise nur mit Aldosen Färbungen. Dabei bilden

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Aldohexosen ein Maximum bei 620 ηm (grüne Für- falls können auch Gemische der vorstehend genannten bung) und können bei dieser Wellenlänge spezifisch Verbindungen als Lösungsvermittler verwendet wergemessen werden, während Aldopentosen ein Maxi- den. Hei Verwendung von Äthylenglykol-monomethylmum bei 480 nm bilden (rotbraune Färbung). äther bildet sich vortcilhal'tcrwche der Farbstoff uußer-

AIs im Reagenz nach der Erfindung enthaltene 5 ordentlich rasch. Äthylenglykol besitzt den Vorteil, daß hydroxylgruppenhaltige Carbonsäuren mit 2 bis der Farbstoff in der Lösung außerordentlich beständig 6 C-Atomen sind geeignet z, B. Monohydroxymoiio- ist.

carbonsäuren, vorzugsweise niedere α-Hydroxymono- Zusätzlich zu den hydroxylgruppenhaltigcn Mono-,

carbonsäuren, insbesondere Glykolsäure und/oder Di- bzw. Tricarbonsäuren kann das Reagenz nach der Milchsäure, femer hydroxyiierte Dicarbonsäuren, io Erfindung auch Eisessig als Säure enthalten. Bei Vervorzugsweise eine bis zwei Hydroxylgruppen enthal- wendung von Eisessig enthält das Reagenz stets einen tende Dicarbonsäuren, insbesondere Äpfelsäure und/ Lösungsvermittler in Form von hydroxylgruppen- oder Weinsäure. Geeignet sind ferner auch hydroxyl- haltigen organischen Lösungsmitteln mit einem Siedegruppenhaltige Tricarbonsäuren, insbesondere Citro- punkt von 90⁰C oder höher, insbesondere eines oder nensäure. Allerdings erhöhen Hydroxy tricarbonsäuren 15 mehrere der oben aufgeführten bevorzugten Diole die Viskosität der Reagenzlösung, so daß hydroxyl- bzw. von deren Monoalkyläth.ern.
gruppenhaltigc Mono- bzw. Dicarbonsäuren im Rea- Neben dem Lösungsvermittler, der im allgemeinen

genz der Erfindung bevorzugt angewandt werden. aus hydroxyigruppenhaltigen organischen Lösungs-

Durch Anwendung verschiedener hydroxylgruppen- mitteln besteht — oder in einK η Fällen, beispielsweise haltiger Carbonsäuren im Reagenz de·- vorliegenden 20 bei Verwendung von Milchsäure, auch an Stelle dieses Erfindung lassen sich unterschiedliche Reaktions- Lösungsvermittlers — kann Wasser im Reagenz nach geschwindigkeiten erzielen. Auch durch Verändern der der Erfindung enthalten sein. Durch Ve. änderung des Konzentrationen der angewandten hydroxylgruppen- Wassergehalts in dem Reagenz läßt sich die Geschwinlialtigen Carbonsäuren läßt sich die Geschwindigkeit di^keit der Farbstoffbildung und die Empfindlichkeit der Farbstoffbildung und Empfindlichkeit des Rea- 25 des Reagenzes weitgehend den jeweiligen Erfordergenzes in weiten Grenzen variieren und an die jeweili- nissen anpassen. Die Anwendung von Wasser ist gen Erfordernisse anpassen. Besonders bewährt haben besonders in den Fällen empfehlenswert, in denen die sich außerdem Gemische von Säuren, um das Kristalli- Bildung von inneren Estern aus den Hydroxycarbonsieren des Reagenzes auch unter extremen Bedingungen säuren bzw. von Estern aus diesen Säuren mit den zu verhindern und um soweit wie möglich leicht her- 30 hydroxyigruppenhaltigen organischen Lösungsmitteln stellbare bzw. leicht zu reinigende Säuren einsetzen zu verhindert werden soll. Außerdem ist die aus dem können, insbesondere Gemische gut kristallisierender Amin und der Aldose gebildete farbige Verbindung in Säuren wie Äpfel- und Weinsäure untereinander, oder Gegenwart von Wasser etwas stabiler.
Gemische dieser gut kristallisierenden Säuren mit Durch geeignete Konzentrationsvcrhältnissc des

schlechter kristallisierenden Säuren, wie MiMisäure 35 Lösungsvcrmittlers bzw. des Wassers bzw. der liy- oder Glykolsäure. Zum Beispiel kann man folgende droxylgruppenhaltigen Carbonsäuren und/oder des Gcinisuie verwenden: Äpfelsäure/Weinsäure; Äpfel- Eisessigs bzw. des Amins ist es möglich, die optimale säure und/oder Weinsäure mit Milchsäure und/oder schnelle Bildung eines über längere Zeit stabilen Farb-Glykolsäure, oder auch Glykolsäurc/Milchsäure. Di« Stoffs zu erzielen.

Konzentration, in der die Säuren zugesetzt werden, ist 40 Im Reagenz können gegebenenfalls auch noch andere u. a. von der Löslichkeit der Säuren abhängig. Gut organische Lösungsmittel enthalten .,ein. die die Farblösliche Säuren, z.B. Milchsäure, können in einer Stoffbildung und Extinktionsme.sung nicht stören. Vor Konzentration bis zu 90°/₀ im Reagenz enthalten sein. allem hat sich der Zusatz einer geringen Menge von

Neben den hydroxylgruppenhaltigcn Carbonsäuren Methanol (z. B. bis zu 15 Gewichtsprozent, vorzugsist in dem Reagenz der Erfindung bevorzugt ein zusatz- 45 weise etwa 5 Gewichtsprozent) zu dem Reagenz nach Jicher Lösungsvermittlcr, insbesondere in Form von der Erfindung bewährt. Weitere geeignete Lösungsmit Wasser mischbarsn, hydroxylgruppenhaltigcn orga- mittel, die in geringer Menge zugesetzt werden können, nischen Lösungsmitteln enthalten. Bevorzugt sind hier- sind z. B. Dioxan, Tetrahydrofuran. Glykolsäurecster. bei Alkohole bzw. Polyole mit einem Siedepunkt über z. B. Glykolsäurcmethylestcr.

90 C, insbesondere Diole. Vor allem sind niedere Alke- S- Zur Verbesserung der Stabilität kann das Reagenz hole und insbesondere niedere Diole mit bis zu nach der Erfindung außerdem noch Thioharnstoff ent-4 C-Atomen und mit einem Siedepunkt von 90⁰C oder halten.

höher, wie insbesondere Äthylen- und/oder Propylen- Der im folgenden angegebene Gehalt der vorstehend

glykol, geeignet. Weitere bevorzugte Lösungsvcrmittler aufgeführten einzelnen Bestandteile des neuen Reasind Monoaikylglykoläthcr, insbesondere mit jeweils 55 genzes hat ^rich als besonders vorteilhaft erwiesen. (Die einem niederen Alkylrest verätherte niedere Glykole, Angaben im folgenden bedeuten Gewichtsteile pro wie Methyl-, Äthyl- oder Butylglykoläther. Gegebenen- 100 Gewichtsteile Reagenz.)

Mischung A

Aromatisches, in o-Stellung und gegebenenfalls in 3- und/oder
4- und/oder 5-Stellung substituiertes Amin, vorzugsweise
o-Toluidin 2 bis 25, insbesondere 4 bis 15 Teile

Hydroxylgruppenhaltige Carbonsäuren mit 2 bis 6 C-Atomen, wie
vorzugsweise Glykolsäure, Milchsäure, Äpfelsäure und/oder
Weinsäure ·. 5 bis 90, insbesondere 15 bis 50 Teile

Lösungsvermittler, vorzugsweise hydroxylgruppenhaltige organische Lösungsmittel mit Siedepunkt 90° oder höher bis zu 85, insbesondere 40 bis 80 Teile

7 8

Mischung Λ (Fortsetzung)

Gegebenenfalls Wasser bis _Zl, 70. insbesondere 0,2 bis C) Teile

Gegebenenfalls Thioharnstoff bis zu 3, insbesondere 0,02 bis 0,5 Teile

Gegebenenfalls zusätzliche inerte organische Lösungsmittel,

insbesondere Methanol bis zu 15, insbesondere S Teile

Lösung B
Sofern Eisessig als zusätzliche Säure verwendet wird, ändert sich der Gehalt der Linzelbcsiandteile wie folgt:

Eisessig bis zu 60, vorzugsweise 40 bis 50 Teile

Hydroxylgruppenhaltige Mono-, Di- bzw. Tricarbonsäuren mit 2 bis

6 C-Atomen bis zu 50, vorzugsweise 10 bis 30 Teile

Hydroxylgruppenhaltige organische Lösungsmittel (Kp. 90° oder

höher) als Lösungsvermittler 30 bis 60, vorzugsweise 40 bis 50 Teile

Aromatisches, o-substituiertes Amin. Wasser. Thio- von o-Toluidin mißt man beispielsweise bevorzugt in

harnstoff und gegebenenfalls zusätzliches inertes orga- einem Bereich von 540 bis 700 mn. beispielsweise bei

nisches Lösungsmittel sind in derselben Konzentration dem Maximum von etwa 620 nm. Der Gehalt an

wie in Mischung A enthalten. Aldose, z. B. Glucose, ergibt sich durch Vergleich des

Für die Herstellung des Reagenzes nach der Erfin- a< > ermittelten Wertes mit dem Meßwert einer Standarddung können die Bestandteile in beliebiger Reihenfolge probe bekannten Gehalts. Die Reaktion kann in ihlizusammengegeben werden. Vorteilhafterweise löst man uher Weise, z. B. von Hand, in Reagenzgläsern oder die hydroxylgruppenhaltigen Carbonsäuren bzw. den mit Hilfe eines Analysenautomaten, beispielsweise in Eisessig in dem angewandten Lösurigsvermittler. der Analog·" zu dem in Clinica Chiinica Acta. 11. S. SX im allgemeinen aus einem hydroxylgruppenhaltigen 15 (1965), angegebenen Verfahren, durchgeführt werden. organischen Losungsmittel (Kp. 90 C oder hoher). Zur Galaktosebestimmung wird die eventuell vorgegebenenfalls zusammen mit Wasser und/oder Thio- handenc Glucose vorher mit < ilucoseoxydE.se selektiv harnstoff, besteht, auf und gibt danach das aroma- oxydiert. Die Messung des Calaktosegehalts erfolgt tische o-substituierte Amin zu. Die einzelnen Bestand- dann bei 620 nm wie bei der Glucosebestinimung. Bei teile des Reagenzes sollten in reiner Form eingesetzt 30 der Xylosebestimmung empfiehlt sich :iueh die vorwerden, um die Blindwerte bei der Messung niedrig herige Anwendung der Glucoseoxyda-^e-O- .llation. zu halten. Die Messung des Xylosegehalts erfolgt bei 4*u nn im

Die Anwendung des Reagenzes für die Bestimmung Bereich des Extinktionsmaximums des rotbrauner.

von Aldosen, insbesondere von Glucose, Galaktose Farbstoffs.

bzw. Xylose, in Körperflüssigkeiten, erfolgt in an sich 35 Die folgenden Beispiele dienen der näheren Erläute-

bekannter Weise. Als Körperflüssigkeiten können ins- rung der Erfindung, besondere Blut. Plasma. Serum, Liquor oder Urin

untersucht werden. In den meisten Fällen, insbesondere Beispiel 1

beider Untersuchung von Blut, ist die zu untersuchende „ _

Probe zuerst mit einem üblichen hierfür angewandten 40 Reagenz zur Bestimmung von Glucose Mittel, insbesondere Trichloressigsäure Perchlorsäure _{a) Zusammensetzung des Rca2e}nzes oder Uranylacetat zu enteiweißen. Nach der Enteiwei- _{10 m( o To}i_uj_din ßung wird zweckmäßigerweise der Eiweißniederschlag _{35 m}, _{Müchsäure (85β/ ie)} abfiltriert oder abzentnfugiert bevor die Aldosen- 50 ml Äthylendykolmonomethvläther bestimmung ausgeführt wird. Bei Verwendung von 45 3 _mj Wasser Serum. Plasma oder Liquor und Urin kann gegebenenfalls auf die Enteiweißung verachtet widen. _{b) Durch}r_ührung einer Glucosebestimmune

Zur Bestimmung wird ein aliquoter Teil der Vorzugs- j dj_u. weise enteiweißten Lösung mit einer abgemessenen

Menge einer Lösung des Reagenzes nach der Erfindung 50 0,05 ml Blut und 0,5 ml 3°/_oige Trichloressigsäure versetzt und in üblicher Weise anschließend für eine werden vermischt und zentrifugiert. Anschließend bestimmte Zeit auf eine feststehende Temperatur, z. B. mischt man 0,2 ml des erhaltenen eiweißfreien Über· etwa 100⁰C, erhitzt. Die angewandten Zeiten liegen, stands mit 2 ml des unter a) beschriebenen Reagenzei sofern der Wassergehalt gering ist, bei etwa 4 bis und erhitzt die Lösung 10 Minuten lang im siedender 10 Minuten bzw., sofern der Wassergehalt höher oder 55 Wasserbad. Nach dem Abkühlen wird die Extinktioi die Temperatur niedriger ist, bei bis zu etwa 60 Minu- der Lösung bei 578 nm gegen einen Blindwert ge ten. Die genaue optimale Erhitzungszeit wird für die messen. Die Berechnung erfolgt durch Vergleich mi betreffende Reagenzzusammensetzung und Reaktions- dem Meßergebnis einer Standardprobe, temperatur jeweils ermittelt. Man wählt zweckmäßigerweise die Zeit, in der bei der betreffenden Reaktions- 60 B e i s ρ i e 1 2 temperatur mindestens 98% der maximalen Farbaus- Reagenz zur Bestimmung von Glucose beute erreicht ist. In dringenden Fällen kann man jedoch auch mit kürzeren Zeiten arbeiten, da Standard- ^a) Zusammensetzung des Reagenzes und Analysenproben stets gleich behandelt werden und 6 ml o-Toluidin da in das Ergebnis nur das Verhältnis der Extinktionen 65 30 ml Milchsäure eingeht. Nach dem Abkühlen des Gemisches wird die 60 ml Glykol Extinktion der Lösung gegen eine Blindprobe bei einer 13 _m] Wasser geeigneten Wellenlänge gemessen. Bei Verwer^:>,r ■- 0.1 g Thioharnstoff 50961c

h) Durchführung einer Gliieosebcslimmiing

im Serum

0,02 ml Serum werden mit 2 ml des unter a) beschriebenen Reagenzes gemischt und 20 Minuten lang auf 90 C erhitzt. Nach dem Abkühlen mißt man die Extinktjor bei 623 nm gegen einen Blindwert. Der Gehalt wird an einer Eichkurve abgelesen, die mit Lösungen Cckanmcn (ilucosegehaltes in entsprechender Weise erhalten wurde.

Beispiel 3

Reagenz zur Xyloscbestimmung a) Zusammensetzung des Reagenzes

0.6 ml o-Toluidin '⁵

1,2 g Apfelsäure
1.2 g Glykolsäure

6 ml Äthylenglykolmonomethyläther 0.5 ml Methanol

0.5 ml Wasser 10 mg Thioharnstoff

b) Durchführung einer Xyloscbestimmung bei Xylosebelastungsversuchen

0,1 ml Urin werden mit 1 ml Phosphatpuffer

t>H = 7.0. 0.1 Mol) und — zur Zerstörung der in der r be enthaltenen Glucose — mit 0.5 mg Glucose-•xydase (30 μ/mg) versetzt. Man läßt die Lösung JO Minuten lang bei Zimmertemperatur stehen und vermischt 0.2 ml dieser Lösung mit 2 ml des vorstehend • nter a) beschriebenen o-Toluidin-Reagenzes. Das Ciemisch wird 6 Minuten im siedenden Wasserbad oder JO Minuten auf 80C erhitzt. Nach dem Abkühlen mißt man die Extinktion bei 480 nm in einer 1-cmtCüvette gegen einen Blindwert. Der Gehalt ergibt sich ^3S «lurch Vergleich mit dem Meßwert ei nerStandardprobe.

Beispiel 4

Reagenz zur Galaktosebestimmung bei Galaktosebela^c:tungs\ersuchen

a) Zusammensetzung des Reagenzes

Eiir cas Reagenz werden die im Beispiel 3. a) aufgeführten Bestandteile verwendet.

45

b) Durchführung der Galaktosebestimmung bei Galaktosebelastungsversuchen

0,1 ml Blut werden mit 1 ml einer Lösung von 160 rag Uranylacetat und 900 mg Natriumchlorid in 100 ml Wasser versetzt. Man zentrifugiert und vermischt Ü,5 ml des erhaltenen eiweißfreien Überstands mit 0,5 ml Phosphatpuffer (pH = 7.5, 0,2 Mol) und — zur Zerstörung von Glucose — mit 0,5 mg Giucoseoxydase. Das Gemisch wird 1/2 Stunde lang stehengelassen. Anschließend werden 0.5 ml dieser Lösung mit 5 ml Reagenzlösung 8 Minuten lang auf 100⁰C erhitzt. Nach dem Abkühlen mißt man die Extinktion bei 620 nm gegen einen Blindwert (2-cm-Küvette). Der Gehalt ergibt sich durch Vergleich mit dem Meßwert einer Standardprobe.

40

Beispiel 5

Reagenz für Glucosebestimmung
a) Zusammensetzung des Reagenzes

0.60 ml o-Toluidin

1 g Äpfel sä ure

I g Glykolsäure

6.4 ml Äthylenglykolmonomethyläther

0.5 ml Methanol

0,05 ml Wasser

0.01 g Thioharnstoff

b) Durchführung einer Glucosebestimmung
im Urin

0,2 ml einer 1 : 10 verdünnten Diabetiker-Urinprobi werden mit 2 ml des unter a) beschriebenen Reagenze: Minuten lang auf 100 C erhitzt. Nach dem Abkühlet mißt man die Extinktion bei 623 nm gegen einen Blind wert und berechnet hieraus durch Vergleiche mit eine Standardprobe den Glucosegehalt.

In analoger Weise kann mit dem unter a) beschriebe nen Reagenz auch der Glucosegehalt im Plasma Serum oder Liquor bestimmt werden.

Beispiel 6
Reagenz für Glucosebestimmung

a) Zusammensetzung des Reagenzes

0,6 ml o-Toluidin
1 g Äpfelsäure
T,5 g Milchsäure (80ⁿ/₀ig)
6 ml Äthylenglykolmonomethyläther
10 mg Thioharnstoff

b) Glucosebsstimmung im Vollblut

0,1 ml der Probe werden mit 1 ml einer Lösung voi g Trichloressigsäure in 100 ml Wasser versetzt. Mai zentrifugiert, versetzt 0,2 ml des erhaltenen eiweiß freien Überstandes mit 2 ml des unter a) beschriebene! Reagenzes und erhitzt das Gemisch 6 bis 8 Minute! lang im siedenden Wasserbad. Nach dem Abkühlet mißt man die Extinktion bei 578 nm gegen einen Blind wert. Die Berechnung erfolgt an Hand einer Eichkurv« oder durch Vergleich mit den Meßwerten einei Standardprobe.

Beispiel 7

Reagenz zur Bestimmung von Glucose
bzw. Galactose oder Xylose

Zusammensetzung des Reagenzes

1 ml o-Toluidin

2 ml Eisessig und 2 ml Glycolsäure
5 ml Äthylenglykolmonoäthyläther
1 ml Wasser

10 mg Thioharnstoff

Die Durchführung der Bestimmungen mit dem Rea genz erfolgt analog Beispiel 4.

Claims

I 773 Patentansprüche:

1. Reagenz zur Bestimmung von Aldosen, insbesondere Glucose, Galaktose oder Xylose, in Körperflüssigkeiten, enthaltend ein o-substituiertes aromatisches Amin, insbesondere o-Toluidin, eine Säure und gegebenenfalls Wasser und/oder Thioharnstoff, dadurch gekennzeichnet, daß die Säure aus einer hydroxylgruppenhaltigen Mono-, Di- oder Tricarbonsäure mit 2 bis

6 C-Atomen oder aus einem Gemisch solcher xo Säuren besteht.

2. Reagenz nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich einen Lösungsvermittler enthält.

3. Reagenz nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß es als zusätzliche Säure Eisessig enthält.

4. Reagenz nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Säure aus Glykolsäure, Milchsäure, Äpfelsäure, Weinsäure und/ oder Zitronensäure besteht.

5. Reagenz nach den Ansprüchen I bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß Apfelsäure und/oder Weinsäure, gegebenenfalls in Mischung mit Milchsäure und/oder Glykolsäure enthalten sind.

6. Reagenz nach den Ansprüchen 1 bis 5. dadurch gekennzeichnet, daß als Lösungsvermittler hydroxylgruppenhaltige organische Lösungsmittel, vorzugsweise mit einem Siedepunkt von 90⁰C oder Iv'.her, gegebenenfalls unter Zusatz einer gelingen Menge Methanol, enthalten sind.

7. Reagenz nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Lösungsvermittler Munoalkylglykoläther und/oder Glykole, insbesondere niedere Monoalkylglykoläther und/oder niedere Glykole, enthalten sind.

8. Reagenz nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß als Lösiingsvcrmittier Athylenglykolmonomethyl- und/oder -äthyläther und/oder Äthylenund/oder Propylenglykol enthalten sind.

9. Reagenz nach den Ansprüchen 1 bis 8. dadurch gekennzeichnet, daß die folgenden Bestandteile in den nachstehend angegebenen ungefähren Gcwichtsteilen pro 100 Gewichtsteile Reagenz enthalten sind: 2 bis 25 Teile eines aromatischen o-substitu erten Amins, insbesondere o-Toluidin, 5 bis 90 Tiile einer oder mehrerer hydroxylgiuppenhaltiger Mono-, Di- oder Tricarbonsäuren, gegebenenfalls bis zu 85 Teilen hydroxylgruppcnhaltige organische Lösungsmittel, insbesondere mit Siedepu:nl;t 90⁰C oder höher, gegebenenfalls bis zu 70 Teilen Wasser, gegebenenfalls bis zu 3 Teilen Thioharnstoff, gegcbcnfalls zusätzliches organisches Lösungsmittel: bis zu 15 Teilen.

K). Reagenz nach Anspruch 9, enthaltend jeweils ungefähr

10 Teile o-Toluidin,
30 Teile Glykolsäure,
55 Teile Äthylenglykolmonomcthyläther,

5 Teile Wasser.

11. Reagenz nach Anspruch 9, enthaltend jeweils ungefähr

6 Teile o-Toluidin,
30 Teile Milchsäure,
60 Teile Glykol,

Kl Teile Wasser,
(U Teil Thioharnstoff.

12. Reagenz nach Anspruch 9, enthaltend jeweils ungefähr 6 Teile o-Toluidin, 20 Teile Äpfelsäure/ Glykolsäure., vorzugsweise im Verhältnis 1:1, 50 bis 70, vorzugsweise etwa 64 Teile Äthylenglykolmonomethyläther, bis zu 10, vorzugsweise etwa 5 Teile Methanol, bis zu 10, vorzugsweise etwa 5 Teile Wasser, bis zu 1, vorzugsweise etwa 0,1 Teil Thioharnstoff.

13. Reagenz nach den Ansprüchen 1 bis 8, enthaltend jeweils ungefähr 2 bis 25 Teile eines aromatischen o-substituierten Amins, insbesondere o-Toluidin, bis zu 50, vorzugsweise 10 bis 30 Teile einer oder mehrerer hydroxylgruppenhaltiger Mono-, Di- bzw. Tricarbonsäuren, bis zu 60, vorzugsweise 40 bis 50 Teile Eisessig, 30 bis 60, vorzugsweise 40 bis 50 Teile hydroxylgruppenhaltige organische Lösungsmittel vom Siedepunkt 90 C oder hoher,gegebenenfalls bis zu 30 Teilen Wasser, gegebenenfalls bis zu 3 Teilen Thioharnstoff.

14. Verfahren zur Bestimmung von Aldosen, insbesondere von Glucose, Galaktose oder Xylose, in gegebenenfalls enteiweißten Körperflüssigkeiten, durch Erhitzen der Probe mit der Lösung eines aromatischen o-subslituierten Amins, insbesondere von o-Toluidin, und anschließende Extinktionsbestimmung; des gebildeten Farbstoffs, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Reagenz nach den Ansprüchen 1 bis 13 anwendet.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Extinktion hei Bestimmung von Aldohexosen im Bereich von 560 bis 680 mn und bei Bestimmung von Aldopentosen im Bereich von 440 bis 520 nm gemessen wird.