DE1943580A1 - Reagens zur Blutzuckerbestimmung - Google Patents

Reagens zur Blutzuckerbestimmung

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DE1943580A1 DE19691943580 DE1943580A DE1943580A1 DE 1943580 A1 DE1943580 A1 DE 1943580A1 DE 19691943580 DE19691943580 DE 19691943580 DE 1943580 A DE1943580 A DE 1943580A DE 1943580 A1 DE1943580 A1 DE 1943580A1
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Description

PAT E N TA NVA LT E D I P L. - IN G. F. ^f E Ι Γ. Κ MANN, 1943580
Dipl.-Ing. H. "Weickmann, Dipl.-Pkys. Dr. K. Fincke Dipl.-Ing. R A.Weickmann, Dipl.-Chem. B. I-Iubep.
jrr-ψ s MÜNCHEN 27, DKN
MOHLSTPv-ASSE 22, BAJFNOMiViER 48 39 21/22
Int.Nrc 1655
BOBHRIKGER MAIIHHEIH GMBH. , Mannheim
Reagens zur BlutzuckerbeStimmung
Die Erfindung betrifft ein Reagens zur Blutauckerbestimmung nach der o-Toluidin-Methode, welches keinen Eisessig enthält.
Die Blutzuckerbestiremung mit c—Toluidin in Eisessig ist eine der Standardmethodiii des klinischen Labors, Hierbei wird die Blutprobe nach Enteiveißung mit etwa der 10fachen Menge einer Reagenslösung versetzt, die o-Toluidin und Thioharnstoff in Eisessig gelöst enthält. Die Mischung wird erhitzt, wobei sich ein grüner Farbstoff bildet, der im Photonieter bei 630 raai gemessen wird.
Dieses bekannte Verfahren besitzt »v/ei wesentliche Nachteile» die vor allem i:n großen Routinelabor erhebliche Problem.;; aufweisen. Einmal ist die Empfindlichkeit ^erhältnieniäßig gering, d.h. die Fehlonnöplichkeit im unteren Bereich der Empfindlichkeit ist vergrößert. Zum andern bev/irkt die 'Verwendung von. Eisessig als Reaktionsrr.edimr. eine starke und sehr unangenefrine C-eruchsboläßtirmnf;, 3ov/oh.l beira Pipettieren als auch bei in Erhitz en der Probon im siedenden Wasserbad oder beim Säubern ü.ev Gl'äsov. Außordom v/ird dio Korrosion der l'hotcuueter durch rl ie Kk f. .i. ^i ü'-:"i 1J :r ■ e— dämpfe nicht xmer^icb J ich erhöht.
10"',/0926.
Man hat daher bereits versucht, diese Nachteile durch Verwendung eines anderen Lösungsmittels und Reaktionsmediums zu beseitigen. So wurde schon vorgeschlagen, halb konzentrierte Essigsäure zu verwenden. Die Nachteile konnten hierdurch jedoch nicht beseitigt v/erden.
Von A. Härtel et al. in Z. klin. Chem. u. klin. Biochem. 7, 14 (1969) wurde vorgeschlagen, den Eisessig zu ersetzen durch ein Gemisch von Glykolsäure und Apfelsäure, Wasser, Methanol und Athylenglykolmonomethyläther. Ein entsprechendes Reagens ist auch im Handel erhältlich.
Bei einem weiteren im Handel erhältlichen Reagens ist der Eisessig durch organische Ester und Salicylsäure ersetzt.
Die beiden erwähnten Eisessig-freien Reagenzien beseitigen zwar das Problem der Geruch3belästigung und verbessern auch die Empfindlichkeit. Diese Empfindlichkeit liegt bei den üblichen Uormalwerten für den Blutzuckergehalt im Vollblut von'60 bis 100 mg?S unter dem Wert von E = 0,100 bei der üblicherweise verwendeten Meßwellenlänge von 578 nm. Bei sehr niedrigen Blutzuckerwerten, wie sie bei Hypoglykämie auftreten, liegen daher die Extinktionsdifferenzen in der Größenordnung des Blindwertes. Es besteht daher ein Bedarf nach der Schaffung eines Reagenses, welches die Empfindlichkeit der Methode noch wesentlich erhöht.
Ein weiterer Nachteil der beiden Reagenzien besteht in der Instabilität des Lösungsraittelgemisches, welche durch den Gehalt an leichtflüchtigen Bestandteilen bedingt ist. Diese erhöhte Verdampfungsgeschwindiglteit fällt ins Gewicht, da das Reagents 8 Minuten lang im siedenden Wasserbad zur Entwicklung der Färbung erhitzt v/erden muß. Bei dem bekannten Salicylsäure enthaltenden Reagens tritt bereits nach etwa 1stündi^eui Stehen an der Luft ein Auskristallisieren der gelösten Subntar.aen ein.
MD ORfGfNAl.
Ein Nachteil besteht schließlich noch darin, daß die anstelle von Eisessig verwendeten Substanzen wesentlich teurer sind und dadurch die wirtschaftliche Konkurrenzfähigkeit beeinträchtigt wird.
Ziel der Erfindung ist daher die Schaffung eines neuen Reagens zur Blutzuckerbestimmung, welches die erwähnten Nachteile der bekannten Reagenzien vermeidet und zuverlässig, hochempfindlich und wirtschaftlich, ist.
Das erfindungsgemäße Reagens zur Blutzuckerbestimmung, enthaltend o-Toluidin, Thioharnstoff, Äthylenglykolmononiedrigalkyläther und Säure ist dadurch gekennzeichnet, daß es
1) als Säure Phthalsäure und
2) als Lösungsvermittler Dimethylformamid enthält.
Aus A. Haertel, H. Lang, Ärati. Lab. 15, 60 (1966) war bekannt, daß nicht hydroxylierte Dicarbonsäuren den Eisessig nicht ersetzen können, sondern die Bildung des gewünschten Farbstoffes verhindern. Es war daher höchst überraschend, als gefunden wurde, daß Phthalsäure einen ausgezeichneten Katalysator für die aldosespezifische Farbreaktion von o-Toluidin darstellt, während z.B. Isophthalsäure und Terephthalsäure-unbrauchbar sind.
Zweckmäßig besteht das erfindungsgemäße Reagens aus 0,1 bis 5 Gew.TIn. Thioharnstoff, 10 bis 65 Gew.Tin· Phthalsäure, 50 bis 130 Vol.TIn. Dimethylformamid und 20 bis 100 Vol.TIn. Äthylenglykolmononiedrigalkyläther und 5 bis 30 Vol.TIn. o-Toluidin. Die Summe von Dimethylformamid und Äthylenglykolmononiedrigalkyläther sollte zweckmäßig 150 Vol.TIe. nicht übersteigen.
Eine besonders bevorzugte Zusammensetzung besteht aus 0,15 bis 0,5 Gew.TIn. Thioharnstoff, 40 bis 50 Gew.TIn. Phthalsäure, 70 bis 110 Vol.TIn. Dimethylformamid, 40 bis 80 Vol.TIn. Äthylenglykolmononiedrigalkyläther und 15 bi3 20 Vol.TIn. o-Toluidin.
Unter "Niedrigalkyl" wird im Rahmen der Erfindung eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen verstanden.
Das erfindungsgemäße Reagens kann bis zu etwa 5 % Wasser enthalten, ohne daß hierdurch seine Brauchbarkeit beeinträchtigt wird.
Das erfindungsgemäße Reagens führt ..weder zu einer Geruchsbelästigung noch besteht die Gefahr eines Lösungsmittelverlustes, wenn zur Ausbildung des Farbstoffes erhitzt wird. Es ist farblos bis schwach gelb gefärbt» die Viskosität ist gering» so daß keine Behinderung des Pipettierens durch Luftblasen oder Nachlauf eintritt. Der Nachlauf bei normalem Pipettieren ist = 1 fa, bei 2,0 ml Reagens also 40,02 ml. Das Reagens erwies sich auch als gut lagerfähig, wobei bei längerem Lagern bei erhöhter Temperatur (330C) zwar eine Verstärkung der Gelbfärbung auftreten kann. Hierdurch wird jedoch weder die Meßempfindlichkeit erheblieh beeinflußt» noch die Stabilität der gebildeten .Farbe.
Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Reagens besteht in seiner ausgezeichneten Empfindlichkeit schon bei niedrigen GIu-kosegehalten. So wird bereits im Bereich von 20 bis 400 mg#· (und weiter bis über 1 g$) Glukosegehalten eine sehr gute lineare Proportionalität zwischen den Extinktionswerten bei 578 nm und der Glukosekonzentration erhalten. Hierzu wird auf Figur 1 der beigefügten Zeichnung verwiesen. Wenn der Glukosegehalt über 400 mg$ liegt, so wird die Probe zweckmäßig verdünnt, beispielsweise im Verhältnis 1:10, da bei diesem Gehalt bereits eine Extinktion von 0,65 gemessen wird.
Die Empfindlichkeit des erfindungsgemäßen Reagens übersteigt die Empfindlichkeit der bekannten Reagenzien nicht unbeträchtlich, wie aus der nachstehenden Tabelle 1 hervorgeht.
BAD ORIQtNAt,
1 0 !■■ / η ο 2 Β
Tabelle 1
Vergleich der Empfindlichkeit verschiedener Blutzucker-Be·
stircmungs-Methoden (l-estkombinat ionen)
Bezeichnung Empfindlichkeit - 200 mgfo G-lukose
E578 Blind E578 Probe AE573 		0,201 0,117 Empfindlichkeit
io bezogen auf (1)
(1) o-Soluidin-Kethode
mit Eisessig		 0,084 0,285 0,205 = IOO/0
(2) o-Toluidin-Kethode
ohne Eisessig
mit Q-lykolsäure		 0,080 0,326 0,272 175,5 fo
_ -
cn		 (5) o-5oluidin-Kethode
ohne Eisessig
mit Slicylsäure		 0,054 0,382 0,333 232 %
(4) erfindungsgemäße
Eeagensmischung
c-I'oluidin-Methode/
+ Phthalsäure		 0,049 285 % +)
+) Vergleich (4) au (2} = (4) zu (3) =
1,62 su 1,0 1,22 zu 1,0
Die aus der letzten Spalte von Tabelle 1 sieh ergebende überlegene Empfindlichkeit des erfindungsgemäßen Reagens hat für die Praxis große Bedeutung, da es hiermit möglich wird, auch in hypoglykämisehen Fällen sowie in Fällen, in denen sehr wenig Blut zur Verfügung steht, also bei Blutauckermeßwerten von 30 bis 50 mgf« Extinktionen in der Größenordnung von 0,050 bis 0,082 bei 578 mn gemessen gegen einen Blindv/ert zu erhalten, so daß Bestimmungsfehler beim Ablesen am Photometer stark verringert werden.
Ein \\reiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Reagens liegt darin, daß es im Bereich der besonders bevorzugten Zusammensetzung eine sogenannte "optimale Zusammensetzung" darstellt. Dies bedeutet, daß alle einzelnen Bestandteile der Mischung in der Konzentration vorliegen, bei der die Empfindlichkeit, die Inkubationsdauer des Tests und die Stabilität der entstehenden Farbe maximal sind und eine geringe Änderung der Bedingungen keine signifikanten Unterschiede beim Testablauf oder beim Meßvorgang verursacht. Der systematische Fehler ist bei dieser Zusammensetzung also möglichst gering gehalten.
Die bei der o-Toluidinreaktion entstehende Farbe ist grundsätzlich instabil. Es wird angenommen, daß eine unbekannte sekundäre Reaktion sich anschließt, durch welche die Extinktion bei 640 nm, dem Maxiraum, und bei der Meßwellenlänge 578 nm im Laufe der Zeit abnimmt. Diese Instabilität der Farbe ist bei dem er« findungsgemäßen Reagens vermindert worden. Figur 2 der Zeichnung zeigt die verbleibende Farbintensität in °/° des ursprünglichen Wertes in Abhängigkeit von der Zeit aufgetragen, die die Probe bei Raumtemperatur nach dera Ende der Inkubation gestanden hat. Als Vergleichß3ub3tanz wurde das Glykolsäurereagens verwendet« . Man erkennt deutlich die überlegene Stabilität des erfindun^s^emäßen Reagensec. Diese Verbesserung stellt einen wichtigen Vorteil dar, wenn große Testserien hintereinander durchgemessen werden.
10- /|lc>26 BADORIQiNAL
Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Reagens liegt darin, daß die Stabilität unabhängig von der Glukosskonzentration in den Proben ist. Hierdurch werden die methodischen Pehlerinöglichkeiten minimalisiert.
Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Reagens besteht in seiner Billigkeit. So beträgt der Phthalsäurspreis nur ein Neuntel des Glykolsäurepreises.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter. Beispiel 1
0,2 g Thioharnstoff und 45,0 g Phthalsäure werden in 100 ml Dimethylformamid, Kp 152 bis 1550C, gelöst. Dann werden 50 ml Äthylglykolmonoäthyläther zugegeben und schließlich 18,0 ml o-Toluidin eingerührt.
Zur Enteiweißung werden 0,1 ml Blut in 1,0 ml 3$ Trichloree-sigsäure pipettiert, gemischt und nach wenigen Minuten Stehen zentrifugiert.
Vom Überstand entnimmt man 0,2 ml und mischtmit 2,0 ml des oben beschriebenen erfindungsgemäßen Reagens. Die Mischung aus überstand und Reagens wird 8 Minuten lang im siedenden Wasserbad erhitzt. Nach dem Abkühlen in kaltem Wasser wird der entstandene grüne Farbstoff im Photometer gegen einen Blindwert (Q?richloressigsäure und Reagens) bei 578 nm gemessen. Ein Glukosestandard (100 rag Glukose/100 ml 0,2$ Benzoesäurelösung) wird in gleicher Weise behandelt. Me Berechnung des Blutzuckergeivaltes erfolgt nach der Formel:
Glukosegehalt der Probe (mg$) = ~£2^-£ χ 100
^Standard
/ η 926
Die Bestimmung wurde mit einer Keine von Blutproben mit unterschiedlichem Glukosegehalt wiederholt. Die Ergebnisse sind in Figur 1 der Zeichnung aufgetragen. Sie zeigen die ausgezeichnete lineare Proportionalität der Ergebnisse, die mit dem erfindungsgemäßen Reagens erhalten werden.
In der oben beschriebenen Weise wurde die Standardabveiehung der ermittelten Blutzuckerwerte voneinander durch 10malige Bestimmung im gleichen Serum, ermittelt. Die Standardabweichuiig die zur Beurteilung der Streuung von Einzelwerten um da3 arithmetische Mittel dient - berechnet sich nach der Formel
=11 V
Kx -
υ- ι
Im vorliegenden Falle ist s = + 1,25.mg$. Als arithmetischer Mittelwert (X) bei der 10maligen Bestimmung wurden 163,3 mg$ Glukose gefunden. Die mit dem erfindungsgemäßen Reagens erzielbare Genauigkeit kann auch durch folgenden Ausdruck beschrieben werden:
X + 1 s = 163,3 + 1,25 mg^.
Der Variationskoeffizient (VK) - als Ausdruck für die Standardabweichung in i> des Mittelwertes - beträgt + 0,76 $, berechnet
nach der Pormel
s χ 100
VK =
Beispiel 2
Die p-Toluidinmethode unter Verwendung des erfindungsgemäßen. Reagens wurde mit der bekannten enzymatisehen hochspezifisehen Blutzuckerbestimmungsmethode unter Verwendung des Systems Hexokinase/Zwischenferment verglichen. Hierbei wurden 25 ver-
10 9 8 15/0926
schiedene Yollblutproben wie in Beispiel 1 beschrieben getestet. Die gleiche Zahl von Blutproben wurde mit Hexokinase/ Zwischenferment enzymatisch bestimmt. Die nach den beiden Methoden erhaltenen Blutzuckerwerte wurden verglichen. Das Ergebnis zeigt Figur 3 der Zeichnung. Die gute tJbereinstimmung der Werte, die nach den beiden Methoden erhalten wurden, ist evident. Die Streuung der vergleichbaren Einzelwerte liegt im Mittel bei ± 2,0 fo.
1 CJ * / ' M 2 6

Claims (3)

Patentansprüche
1. Reagens zur Blutzuckerbestimmung, enthaltend o-Toluidin, Thioharnstoff, Äthylenglykolmononiedrigalkyläther und Säure, dadurch gekennzeichnet, daß es
1) als Säure Phthalsäure und
2) als Lösungsvermittler Dimethylformamid enthält.
2. Reagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es 0,1 bis 5 Gew.Tle. Thioharnstoff, 10 bis 65 G-ew.Tle. Phthalsäure, 50 bis 130 Vol.lie. Dimethylformamid, 20 bis 100 VoILTIe« Athylenglykolmonoalkyläther und 5 bis 30 VoLTIe. o-Toluidin enthält.
3. Reagens nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es 0,15 bis 0,3 Gew.Tle. Thioharnstoff, 40 bis 50 Gew.Tle. Phthalsäure, 70 bis 110 Vol.TIe. Dimethylformamid, 40 bis 80 Vol.TIe. Äthylenglykolmononiedrigalkyläther und 15 bis 20 Vol.TIe, o-Toluidin enthält und die Summe von Dimethylformamid und Athylenglykolmonoalkyläther 150 Vol.Tie. beträgt.
109815/0926
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