DE1943580C

DE1943580C - Reagens zur Blutzuckerbestimmung

Info

Publication number: DE1943580C
Authority: DE
Inventors: Wolfgang Dr. phil. nat. 8132 Garatshausen; Bernt Erich 8000 München; Wahlefeld August Wilhelm Dr.rer. nat. 8120 Weilheim; Dollacker Werner 8000 München Gruber
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH

Description

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Die Erfindung betrifft ein Reagenr zur Blutzucker- meidet und zuverlässig, hochempfindlich und wirtschaft-

hestimmung nach der oToluidin-Methode, weiches lieh ist.

keinen Eisessig enthält. Das erfindungsgemäße Reagens zur Blutzucker-

Die Bliitzuckerbesiimmung mit o-Toluidin in Eis- bestimmung, enthaltend o-Toluidin, Thioharnstoff,

essig ist eine der Standardmethoden des klinischen 5 Äthylenglykolmononiedrigalkyläther als Lösungsver-

Labors. Hierbei wird die Blutprobe nach Enteiweißung mittler und eine Säure ist dadurch gekennzeichnet,

mit etwa der lOfachen Menge einer Reagenslösung ver- daß die Säure Phthalsäure ist und daß als zusätzlicher

setz¹., die o-Toluidin und Thioharnstoff in Eisessig ge- Lösungsvermittler Dimethylformamid enthalten ist.

löst enthält. Die Mischung wird erhitzt, wobei sich ein Aus A. Haertel, H. Lang, Ärztl. Lab. 15,

grüner Farbstoff bildet, der im Photometer bei 630 nm io S. 60 (1969), war bekannt, daß nicht hydroxylierte

gemessen wird. Dicarbonsäuren den Eisessig nicht ersetzen können,

Dieses bekannte Verfahren besitzt zwei wesentliche sor.dern die Bildung des gewünschten Farbstoffes Nachteile, die vor allem im großen Routinclabor verhindern. Es war daher höchst überraschend, als erhebliche Probleme aufweisen. Einmal ist die Empfind- gefunden wurde, daß Phthalsäure einen ausgezeichlichkeit verhältnismäßig gering, d. h., die Fehler- 15 neten Katalysator für die aldosespezifische Farbmöglichkeit im unteren Bereich der Empfindlichkeit reaktion von o-Toluidin darstellt, während z. B. ist vergrößert. Zum anderen bewirkt die Verwendung Isophthalsäure und Terephthalsäure unbrauchbar von Eisessig als Reaktionsmedium eine starke und sehr sind.

unangenehme Geruchsbelästigung, sowohl beim Pi- Zweckmäßig besteht das erfindungsgemäße Reagens

pettieren als auch beim Erhitzen der Proben im 20 aus 0,1 bis 5 Gewichtsteilen Thioharnstoff, 10 bis

siedenden Wasserbad oder beim Säubern der Gläser. 65 Gewichtsteilen Phthalsäure, 50 bis 130 Volumteilen

Außerdem wird die Korrosion der Photometer durch Dimethylformamid und 20 bis 100 Volumteilen Äthy-

dic Essigsäuredämpfe nicht unerheblich erhöht. Ienglykolmononiedricalkyläther und 5 bis 30 Volum-

Man hat daher bereits versucht, diese Nachteile teilen o-Toluidin. Die Summe von Dimethylformamid

durch Verwendung eines anderen Lösungsmittels und 35 und Äthylenglykolmononiedrigalkyläther sollte zweck-

Reaktionsmediums zu beseitigen. So wurde schon mäßig 150 Volumteile nicht übersteigen,

vorgeschlagen, halb konzentrierte Essigsäure zu ver- Eine besonders bevorzugte Zusammensetzung besteht

wenden. Die Nachteile konnten hierdurch jedoch aus 0,15 bis 0,3 Gewichtsteilen Thioharnstoff, 40 bis

nicht beseitigt werden. 50 Gewichtsteilen Phthalsäure, 70 bis 110 Volumteilen

Von A. H ä r t e 1 et al. in Z. klin Chem. u. klin. 30 Dimethylformamid, 40 bis 80 Volumteilen Äthylen-Biochem. 7, S 14 (1969), wurde voiges;hlagen, den glykolmononiedrigalkyläther und 15 bis 20 Volum-Eisessig zu ersetzen durch ein Gemisch von Glykol- teilen o-Toluidin.

säure und Apfelsäure, Wasser, Methanol und Äthylen- Unter »Niedrigalkyl« wird im Rahmen der Erfindung

glykolmonomethvlather. Ein entsprechendes Reagens e.ne Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ver-

ist auch im Handel erhältlich. 35 standen.

Bei einem weiteren im Handel erhältlichen Reagens Das erfindungsgemäße Reagens kann bis zu etwa

ist der Eisessig durch organische Ester und Salicyl- 5% Wasser enthalten, ohne daß hierdurch seine

säure ersetzt. Brauchbarkeit beeinträchtigt wird.

Die beiden erwähnten eisessigfreien Reagenzien Das erfindungsgemäße Reagens führt weder zu einer

beseitigen zwar das Problem der Geruchsbelästigung 40 Geruchsbelästigung noch besteht die Gpfahr eines

und verbessern auch die Empfindlichkeit. Diese Lösungsmittelverlustes, wenn zur Ausbildung des

Empfindlichkeit liegt bei den üblichen Normalwerten Farbstoffes erhitzt wird. Es ist farblos bis schwachgelb

für den Blutzuckergehalt im Vollblut von 60 bis gefärbt, die Viskosität ist gering, so daß keine Behin-

100 mg°/o unter dem Wert von E < 0,100 bei der derung des Pipetticrens durdi Luftblasen oder Nach-

üblichcrwcisc verwendeten Meßwellenlänge von 578 nm. 45 lauf eintritt. Der Nachlauf bei normalem Pipettieren

Bei sehr niedrigen Blutzuckerwerten, wie sie bei Hypo- ist < 1 °/₀, bei 2,0 ml Reagens also < 0,02 ml. Das

glykämic auftreten, liegen daher die Extinktions- Reagens erwies sich auch als gut lagerfähig, wobei

differenzen in eier Größenordnung des Blindwertes. bei längerem Lagern bei erhöhter Temperatur O3°C)

Es besteht daher ein Bedarf nach der Schaffung eines zwar eine Verstärkung der Gelbfärbung auftreten

Reagens, welches die Empfindlichkeit der Methode 50 kann. Hierdurch wird jedoch weder die Meßempfind-

noch wesentlich erhöht. lichkeit erheblich beeinflußt, noch die Stabilität der

Ein weiterer Nachteil der beiden Reagenzien besteht gebildeten Farbe.

in der Instabilität des Lösungsmittelgemisches, welche Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Rea-

durch den Gehalt an leichtflüchtigen Bestandteilen gens besieht in seiner ausgezeichneten Empfindlichkeit

bedingt ist. Diese erhöhte Verdampfungsgeschwindig- 55 schon bei niedrigen Glukosegehalten. So wird bereits

keit fällt ins Gewicht, da das Reagens 8 Minuten lang im Bereich von 20 bis 400 mg°/o (und weiter bis über

im siedenden Wasserbad zur Entwicklung der Färbung 1 g%) Glukosegehalten eine sehr gute lineare Pro-

erhiizt werden muß. Bei dem bekannten Salicylsäure portionalilät zwischen den Extinktionswerten bei

enthaltenden Reagens tritt bereits nach etwa 1 stündi- 578 nm und der Glukosekonzentration erhalten,

gern Stehen an der Luft ein Auskrislallisieren der 6u Hierzu wird auf F i g. 1 der Zeichnung verwiesen,

gelösten Substanzen ein. Wenn der Glukosegehalt über 400 mg% liegt, so wird

Ein Nachteil besteht schließlich noch darin, daß die die Probe zweckmäßig verdünnt, beispielsweise im

an Stelle von Eisessig verwendeten Substanzen Verhältnis 1: 10, da bei diesem Gehalt bereits eine

wesentlich teurer sind und dadurch die wirtschaftliche Extinktion von 0,65 gemessen wird.

Konkurrenzfähigkeit beeinträchtigt wird. 65 Die Empfindlichkeit des erfindungsgemäßen Reagens

Ziel der Erfindung ist daher die Schaffung eines übersteigt die Empfindlichkeit der bekannten Reagen-

nciici Reagens zur Blutzuckerbestimmung, welches die zien nicht unbeträchtlich, wie aus der nachstehenden

erwaru.'cn Nachteile der bekannten Reagenzien ver- Tabelle 1 hervorgeht.

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Tabelle 1 Vergleich der Empfindlichkeit verschiedener Bliitzucker-Bestimmimgs-Melhoden (Testkomhinalion)

Bezeichnung	Empfindlichkeit — 200 mg "/„ Glukose E₅₇, Wind j /T₁₇, Probe .If₅₇₁,	0.201 0,285 0,326 0.382	0,117 0,205 0,272 0,333	Empfindlichkeit ⁿ/„, bezogen auf (U
(I) o-Tohiidin-Methode mit Eisessig (2) o-Toluidin-Methüde ohne Eisessig mit Glykolsäure (.1) o-Toluidin-Methode ohne Eisessig mit Salicylsäure (4) erfindungsgemäße Reagensmischling o-Toluidin- Methode/ + Phthalsäure ....	0,084 0,080 0,054 0,049	100"/,, 175,5°_/n 232" ₀ 285°/„*)

·) Vergleich (4) zu (2) = 1,62 zu 1,0
(4) zu (3) = 1,22 zu 1,0.

Die aus der letzten Spalte von Tabelle 1 sich erge- ao bende überlegene Empfindlichkeit des erfindungsgemäßen Reagens hat für die Praxis große Bedeutung, da es hiermit möglich wird, auch in hypoglykanischen Fällen sowie in Fällen, in denen sehr wenig Blut zur Verfügung steht, alo bei Blutzuckermeßwerten von 30 bis 50 mg^c/o, Extinktionen in der Größenordnung von 0,050 bis 0,082 bis 578 nm, gemessen gegen einen Blindwert, zu erhalten, so daß Bestimmungsfrhler beim Ablesen am Photometer stark verringert werden.

Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Reagens liegt darin, daß es im Bereich der besonders bevorzugten Zusammensetzung eine sogenannte »optimale Zusammensetzung« darstellt. Dies bedeutet, daß alle einzelnen Bestandteile der Mischung in der Konzentration vorliegen, bei der die Empfindlichkeit, die Inkubationsdauer des Tests und die Stabilität der entstehenden Farbe maximal sind und eine geringe Änderung der Bedingungen keir^ signifikanten Unterschiede beim Testablauf oder beim Meßvorgang verursacht. Der systematische Fehler ist bei dieser Zusammensetzung also möglichst gering gehalten.

Die bei der o-Toluidinreaktion entstehende Farbe ist grundsätzlich instabil. Es wird angenommen, daß eine unbekannte sekundäre Reaktion sich anschließt, durch welche die Extinktion bei 640 nm, dem Maximum, und bei der Meßwellenlänge 578 nm im Laufe der Zeit abnimmt. Diese Instabilität der Farbe ist bei dem erfindungsgemäßen Reagens vermindert worden. F i g. 2 der Zeichnung zeigt die verbleibende Faiointensitat in % des ursprünglichen Wertes in Abhängigkeit von der Zeit aufgetragen, die die Probe bei Raumtemperatur nach dem Ende der Inkubation gestanden hat. Als Vergleichssubstanz wurde das Glykolsäurereagens verwendet. Man erkennt deutlich die überlegene Stabilität des erfindungsgemäßen Reagenzes. Die Verbesserung stellt einen wichtigen Vorteil dar, wenn große Testserien hintereinander durchgemessen werden.

Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Reagens liegt daiin, daß die Stabilität unabhängig von der Glukosekontentration in den Proben ist. Hierdurch werden die methodischen Fehlermöglichkeiten minimalisiert.

Ein weiter-.r Vorteil des erfindungsgemäßen Reagens besteht in seiner Billigkeit. So beträgt der Phthalsäurepreis nur ein Neuntel des Glykolsäurepreises.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.

Beispiel 1

0,2 g Thioharnstoff und 45,0 g Phthalsäure werden in 100 ml Dimethylformamid, Kp. 152 bis 155 C, gelöst. Dann werden 50 ml Äthylglykolmonoäthyläther zugegeben und schließlich 18,0 ml o-Toluidin eingerührt.

Zur Enteiweißung werden 0,1ml Blut in 1,0 ml 3% Trichloressigsäure pipettiert, gemischt und nach wenigen Minuten Stehen zentrifugiert.

Vom Überstand entnimmt man 0,2 ml und mischt mit 2,0 ml des oben beschriebenen erfindungsgemäßen Reagens. Die Mischung aus Überstand und Reagens wird 8 Minuten lang im siedenden Wasserbad erhitzt. Nach dem Abkühlen in kaltem Wasser wird der entstandene grüne Farbstoff im Photometer gegen einen Blindwert (Trichloressigsäure und Reagens) bei 578 nm gemessen. Ein Glukosestandard (100 mg Glukose/100 ml 0,2% Benzoesäurelösung) wird in gleicher Weise behandelt. Die Berechnung des Blutzuckergehaltes erfolgt nach der Formel:

Glukosegehalt der Probe (mg°/„) =

^£probe

-100.

Die Bestimmung wurde mit einer Reihe von Blutproben mit unterschiedlichem Glukosegehalt wiederholt. Die Ergebnisse sind in F i g. 1 der Zeichnung aufgetragen. Sie zeigen die ausgezeichnete lineare Proportionalität der Ergebnisse, die mit dem erfindungsgemäßen Reagens erhalten werden.

In der oben beschriebenen Weise wurde die Standardabweichung der ermittelten Blutzuckerwerte voneinander durch lOmalige Bestimmung im gleichen Seru"i ermittelt. Die Standardabweichung — die zur Beurteilung der Streuung von Einzelwerten um das arithmetische Mittel dient — berechnet sich nach der Formel

s =

JV-I

Im vorliegenden Falle ist s -= h 1,25 mg°/₀. Als arithmetischer Mittelwert {X) bei der lOmaligen Bestimmung wurden 163,3 mg⁰/,, Glukose gefunden. Die mit dem erfindungsgemäßen Reagens erzielbarc Genauigkeit kann auch durch folgenden Ausdruck beschrieben werden:

Fi Ii= 163,3 :t; 1,25 mg⁰/,,.

Der Variationskoeff'i/icnt (\'K) als Ausdruck für die Standardahwcichung in "'„ des Mittelwertes -beträgt ^; 0.76"·',,. berechnet nach der Formel

IK ^S' ¹⁽⁾°

Beispiel 2

Die o-Toluidinmcthodc unter Verwendung des erlimhinpsgemäßcn Reagens wurde mit der bekannten en/\ malischen hochspezi fischen Blutzuckerbestimmimgsmeihiulc unter Verwendung des Systems Hexokini'-c /wischenfermetU verglichen. Hierbei wurden 25 verschiedene Vollblutproben wie im Beispiel 1 !- ■ chiK'hen getestet. Die gleiche Zahl von Blutproben wurde mit 1 lexokirasc/Zwischenferment enzymatisch bestimmt. Die nach den beiden Methoden erhaltenen Hlut/iK.kerwcrte wurden verglichen. Das Ergebnis zeigt 1 i g. 3 der Zeichnung. Die gute Überein-Stimmung der Were, die nach den beiden Methoden erhalten wurden, iit ovident. Die Streuung der vergleichbaren Einzelkette liegt im Mittel bei ±2,0%.

Claims

Patentansprüche:

1. Reagens zur Blutzuckerbestimmung, enthaltend o-Toluidin. Thioharnstoff, Äthylcnglykolmononicdrigalkyläther als Lösungsvermittler und eine Säure, dadurch gekennzeichnet, daß die Säure Phthalsäure ist und daß als zusätzlicher Lösungsvermittler Dimethylformamid enthalten ist.

2. Reagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es 0,1 bis 5 Gewichtsteile Thioharnstoff, 10 bis 65 Gewichtsteile Phthalsäure, 50 bis 130 Volumteile Dimethylformamid, 20 bis 100 Volumteile Äthylenglykolmonoalkyläther und 5 bis 30 Volumteile o-Toluidin enthält.

3. Reagens nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es 0,15 bis 0,3 Gewichtsteile Thioharnstoff, 40 bis 50 Gewichtsteile Phthalsäure, 70 bis 110 Volumteile Dimethylformamid, 40 bis 80 Volumteile Äthylenglykolmononiedrigalkyläther und 15 bis 20 Volumteile o-Toluidin enthält und die Summe von Dimethylformamid und Äthylenglykolmonoalkyläther 150 Volumteile beträgt.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen