DE1940869B2

DE1940869B2 - Amylaseaktivitat

Info

Publication number: DE1940869B2
Application number: DE19691940869
Authority: DE
Inventors: Bernard New Hyde Park N.Y. Klein; Ronald Loy Upper Montclair N.J. Searcy
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1968-08-19
Filing date: 1969-08-11
Publication date: 1978-10-05
Also published as: DE1940869A1; BE737479A; SE380628C; AT304768B; SE380628B; SU396036A3; NL6912544A; BR6911601D0; CS181156B2; CH526298A; CA948971A; RO56644A; FR2015894A1; ES370596A1; JPS5114916B1; PL80211B1; GB1275944A; BG17467A3

Description

Bei vielen Krankheiten, bei welchen der Patient im wesentlichen identische Symptome zeigt, ist eine differenzierte Diagnose häufig schwierig. Aus diesem Grunde sucht man angestrengt nach verläßlichen diagnostischen Tests und solche Tests werden auch in immer wachsendem Maße verwendet. Ein Beispiel für ein solches klinisch-d'agnostisches Problem ist die Unterscheidung zwischen Appendicitis und akuter Pankreatitis. Um genau bestimmen zu können, welche dieser beiden Krankheiten vorliegt, ist eine verläßliche chemische Methode erforderlich, welche eine genaue Bestimmung der Serum- oder der Urinamylaseaktivität erlaubt. Diese Aktivität, welche beim Menschen hauptsächlich das Ergebnis einer exokrinen Pankreasfunktion ist, wird im Falle von akuter Pankreatitis wesentlich erhöht.

Unter dem Ausdruck »Amylase« ist eine Gruppe von Enzymen zu verstehen, welche Λ-Amylase und j3-Amylase umfaßt. Diese Enzyme verursachen die Hydrolyse von Stärke und es ist daher möglich, mittels chemischen Methoden die Nebenprodukte der Hydrolyse zu bestimmen. Die Hydrolyse von Amylose, der linearen or-M-Glucosid-stärkekomponente, kann daher zur Bestimmung der x- und /i-Amylaseaktivität verwendet werden. Die Produkte, weiche der enzymatischen Hydrolyse von Amylose durch diese Amylasen entstehen, sind Maltose und Glucose oder Gemische hiervon. Im Falle von «-Amylase ist das Hauptprodukt ein Gemisch von Maltose und Glucose, während im Falle

ίο von /J-Amylase das Hauptprodukt Maltose ist Es wurden bereits Tests entwickelt, mittels welchen die Aktivität der Enzyme aufgrund der durch die Enzyme erzeugten Menge an Maltose und/oder Glucose bestimmt wird. Derartige Tests sind jedoch schwierig durchzuführen und unverläßlich, da reproduzierbare Ergebnisse im allgemeinen nicht erhalten werden.

Aufgabe der Erfindung ist es ein hinsichtlich der Linearität und Ablesbarkeit der Ergebnisse verbessertes Verfahren zur Bestimmung der Ä-Amylaseaktivität mittels Farbstoffkomplexen zur Verfügung zu stellen.

Es wurde festgestellt, daß die Amylaseaktivität mit ausgezeichneter Reproduzierbarkeit, nämlich mit einer durchschnittlichen Fehlergrenze von 2-4%, bestimmt werden kann, wenn man die Farbintensität mißt, welche entsteht wenn ein an sich wasserlöslicher Farbstoff, welcher jedoch durch die Kombination mit Amylose wasserunlöslich gemacht wurde, in einem wäßrigen Medium durch die Wirkung der Amylase solubilisiert wird. Durch Messung der Farbintensität des wäßrigen

jo Mediums und Vergleich dieser Farbintensität mit einer Standardprobe bestimmt man den Grad der Solubilisierung, welcher ein Maß für die durch die Amylase bewirkte Hydrolyse und damit ein Maß für die Amylaseaktivität ist.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung der a-Amylaseaktivität eines Materials, wobei man einen Komplex aus einem wasserlöslichen Reaktivfarbstoff und einem Amylase enthaltenden Material der enzymatischen Wirkung des zu untersuchenden Materials in einem wäßrigen Phosphatpuffer bei einem pH-Wert von etwa 6,9 — 7,1 bei einer Temperatur von 37 bis 40° C unterwirft, die Reaktion abbricht und die Farbe der überstehenden Flüssigkeit mit einem Standard vergleicht, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen wasserunlöslichen Komplex eines Monochlortriazinfarbstoffs verwendet und die enzymatische Einwirkung in Gegenwart eines Alkalimetallchlorid- Katalysators durchführt.
Die Farbstoffe, welche sich im Rahmen der

so vorliegenden Erfindung zur Komplexbildung mit Amylose eignen, sind wasserlösliche Farbstoffe, welche mit Cellulose reagieren, d. h. sogenannte Reaktiv-Farbstoffe, nämlich Monochlortriazinfarbstoffe, und ganz besonders eignen sich solche Monochlortriazinfarbstoffe, welche eine Anthrachinondisulfonatkomponente enthalten. Beispiele für derartige bekannte Farbstoffe sind: Cibacron Brilliant-orange G. E. (Reaktivorange 5) und Cibacron Brilliant-blau F3GA (Reaktivblau 2).

Diese Reaktiv-Farbstoffe sind dadurch gekennzeich-

bo net, daß sie wasserlöslich sind, daß sie einen reaktionsfähigen Halogensubstituenten enthalten und daß sie eine Anthrachinondisulfonatkomponente enthalten. Diese Farbstoffe sind in Form ihrer Schwermetallsalze, beispielsweise in Form ihrer Kupfer-, Mangan-

b^r> od. dgl. Salze, erhältlich.

Der im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendbare unlösliche Komplex wird dadurch erhalten, daß man den Reaktiv-Farbstoff mit Amylose oder einem

Amylose enthaltenden Material, beispielsweise mit Stärke, umsetzt Typische Beispiele von Amylose enthaltenden Materialien sind Stärken von Knollenfrüchten oder Getreide, beispielsweise Maisstärke, Kartoffelstärke, Weizenstärke und Reisstärke.

Der Farbstoff kann mit dem Amylose enthaltenden Material in einem wäßrigen alkalischen Medium umgesetzt werden. Die relativen Mengen der Reaktionspartner sind nicht kritisch, da sich diese in konstanter Weise miteinander verbinden und jeder Überschuß eines der beiden Reaktionspartner entfernt werden kann. Änderungen in den relativen Mengen der Reaktionspartner haben somit keine Änderung des Charakters des Reaktionsproduktes zur Folge. Um eine möglich vollständige Reaktion zu erzielen, wird vorzugsweise einer der beiden Reaktionspartner im Überschuß verwendet

Der Komplex kann durch Umsetzung des Farbstoffes mit dem Amylose enthaltenden Material in einem schwach alkalischen, wäßrigen Medium bei erhöhten Temperaturen, z. B. bei. Temperaturen über 50°C, vorzugsweise bei Temperaturen zwischen etwa 50 und etwa 90⁰C, erhalten werden. Bei zu energischen Reaktionsbedingungen, beispielsweise bei zu hoher Temperatur oder bei zu hoher Alkalinität, wird das Halogenatom eher mit dem Hydroxylion des basischen Mediums, als mit der Amylosekomponente reagieren. Um eine gute Ausbeute innerhalb einer kurzen Reaktionszeit zu erzielen, ist es zweckmäßig, zuerst ein lösliches Salz, beispielsweise Natriumsulfat, Kalziumchlorid, Natriumchlorid, Kaliumchlorid od. dgl., vorzugsweise Natriumsulfat, zuzusetzen. Nach Zusatz des Salzes wird zweckmäßig eine Base zugegeben, um den pH-Wert auf mindestens 9—12 zu bringen, wodurch die Umsetzung eingeleitet wird. Als Base wird vorzugsweise Trinatriumphosphat verwendet, wodurch besonders hohe Ausbeuten erzielt werden können.

Das erhaltene Produkt ist ein stabiler, unlöslicher Komplex, welcher in üblicher Weise, z. B. durch Filtration, Zentrifugieren, Dialyse od. dgl. gewonnen werden kann. Dieser Komplex hat dieselbe Farbe wie der verwendete Farbstoff. Der Farbstoffanteil des Produktes ist mit einer Hydroxylgruppe einer Zuckerkomponente der Amylose verbunden, wobei pro Farbstoffmolekül etwa 7 bis etwa 10 Zuckeranteile vorhanden sind, wie dies durch Messung des Verhältnisses der Menge an solubilisierten Farbstoff enthaltenden Fragmenten zu der Menge an reduzierenden Substanzen (gemessen als durch Hydrolyse mit Endo- und Exoamylaseenzymen produzierte Glucose) bestimmt werden kann.

Die britischen Patentschriften 9 73 891 und 10 09 911 betreffen die Herstellung eines Komplexes durch Reaktion von Amylose enthaltenden Materialien mit wasserlöslichen Reaktiv-Farbstoffen. Die Anwendung eines solchen Komplexes in einem diagnostischen Verfahren wird in diesen Patentschriften jedoch keineswegs erwähnt und ist daher absolut nicht naheliegend.

Aus der FR-PS 15 08 496 ist es bekannt, einen wasserlöslichen Komplex zur Bestimmung der Amylaseaktivität zu verwenden. Der wesentliche Unterschied zwischen dieser bekannten und der erfindungsgemäßen Methode liegt darin, daß die in der FR-PS 15 08 496 beschriebene Methode auf einer Einphasenreaktion zwischen dem verwendeten wasserlöslichen Komplex und der wasserlöslichen a-Amylase beruht, während die anmeldungsgemäße Methode eine Zweiphasenreaktion zwischen dem verwendeten wasserunlöslichen Komplex und der wasserlöslichen «-Amylase betrifft.

Da es allgemein bekannt ist, daß Zweiphasenreaktionen bedeutend schlechter verlaufen als die entsprechende Einphasenreaktion, mußte der Fachmann erwarten, daß das Ersetzen eines wasserlöslichen Komplexes durch einen wasserunlöslichen Komplex nachteilig sein sollte. Das vorbekannte Verfahren ist vollständig von dem löslichen Komplex und von der Stufe der

ίο Entfernung des Proteins in der Probe durch Verwendung eines geeigneten Fällungsmittels abhängig. Die Proteinausfällungsstufe ist bei diesem vorbekannten Verfahren wesentlich, da die Lösung trübe ist und für eine Auswertung geklärt werden muß. Diese Ausfällungsstufe entfernt jedoch auch einige der löslichen Produkte aus der Lösung, wobei die Menge dieser entfernten Produkte einen Einfluß auf die Auswertung besitzt. Wie sich aus Vergleichsversuchen ergibt, liegt bei dem erfindungsgemäßen Verfahren eine klare, überstehende Flüssigkeit von Anfang an vor, da der neue Substratkomplex gemäß der Erfindung unlöslich ist, Unterschiede im Proteingehalt der Probe spielen daher keine Rolle, ferner wird keine Ausfällungsstufe benötigt und das erfindungsgemäße Verfahren liefert wesentlich bessere Ergebnisse hinsichtlich der Linearität und Ablesbarkeit.

Das Verfahren zur Bestimmung der Amylaseaktivität gemäß der vorliegenden Erfindung ist für die Art der betreffenden Amylase spezifisch und muß, um genau und reproduzierbar zu sein, unter den angegebenen Bedingungen durchgeführt werden.

Als Enzymquelle kann jedes Material verwendet werden, welches α- oder /J-Amylase enthält, beispielsweise biologische Flüssigkeit oder Gewebe sowie Pilzeextrakte, Bakterienextrakte oder Pflanzenextrakte. Beispiele von «-Amylase enthaltenden Materialien sind Blutserum, Urin, Speichel u. dgl. Beispiele von Materialien, welche /3-AmyIase enthalten können, sind Pilze, Bakterien und Pflanzen. Im Rahmen der weiteren Beschreibung der Erfindung wird die Bestimmung der α-Amylaseaktivität unter Verwendung von biologischen Flüssigkeiten, nämlich von Pankreasextrakt, und die Bestimmung der j3-Amylaseaktivität unter Verwendung eines Pilzextraktes illustriert.

Der Test zur Bestimmung der «-Amylaseaktivität wird in der Weise ausgeführt, daß man den Farbstoff-Stärkekomplex in einer im wesentlichen neutralen, wäßrigen Pufferlösung suspendiert, welche einen Alkalimetallchloridkatalysator enthält, daß man die

so erhaltene Suspension erwärmt, daß man die Testlösung zusetzt, daß man das Gemisch während einer bestimmten Zeit stehen läßt, daß man die Reaktion abbricht, daß man die überstehende Flüssigkeit entfernt und daß man, zum Zwecke der Bestimmung der Menge an solubilisierten Farbstoff enthaltendem Material, die Farbe der überstehenden Flüssigkeit mit einer Standardprobe vergleicht. Die durch das solubilisierten Farbstoff enthaltende Material hervorgerufene Farbe ist ein Maßstab für die Enzymaktivität.

bo Der Test zur Bestimmung der j3-Amylaseaktivität wird in der Weise durchgeführt, daß man den Farbstoff-Stärkekomplex in eine saure wäßrige Pufferlösung einbringt, daß man die Testlösung hinzugibt, daß man das Gemisch bei Raumtemperatur oder bei einer

b5 Temperatur zwischen 37 und 4O⁰C eine bestimmte Zeit lang stehen läßt, daß man die Reaktion abbricht, daß man die überstehende Flüssigkeit entfernt und daß man, zwecks Bestimmung der Menge des solubilisierten

Farbstoff enthaltenden Materials, die Farbe der überstehenden Flüssigkeit mit einer Standardprobe vergleicht. Auch hier ist die durch das solubilisierten Farbstoff enthaltende Material hervorgerufene Farbe ein Maß für die Enzymaktivität.

Die Mengen der verschiedenen bei diesen Enzymaktivitätstests verwendeten IngredUntien sind für die Durchführbarkeit der Tests nicht kritisch. Vorzugsweise werden jedoch möglichst kleine Mengen dieser Ingredientien verwendet, so daß die Tests in möglichst ökonomischer Weise durchgeführt werden. Die Mengenverhältnisse der Ingredientien sowie die pH- und Temperaturbedingungen sind für die Durchführbarkeit des Verfahrens von Bedeutung, während die Zeit nur insofern von Bedeutung ist, als die Tests in möglichst kurzer Zeit durchgeführt werden sollen und die Zeitdauer jeweils möglichst gleich sein sollte.

Die Reaktionsbedingungen für die Bestimmung der Enzymaktivität können derart festgelegt werden, daß entweder ein statisches oder ein dynamisches System vorliegt. Beim statischen System, welches bevorzugt ist, werden nur geringe Volumina verwendet, wobei die Notwendigkeit des Rührens wegfällt. Die bevorzugten Reaktionsbedingungen für die Bestimmung der α- bzw. ß-Amylaseaktivität sind somit diejenigen, welche darauf gerichtet sind, ein Endvolumen für die spektrophotometrische Messung von etwa 6—10 ml zu erhalten. Bei der Bestimmung der λ- Amylase werden somit vorzugsweise etwa 200 mg des unlöslichen Farbstoff-Amylosekomplexes in etwa 0,8 ml eines 0,04molaren Phosphatpuffers bei einem pH-Wert von etwa 6,9 —7,1, vorzugsweise 7,0, welcher 0,05 Mol Natriumchlorid bei 37-40° C enthält, und 0,1 —0,4 ml, vorzugsweise etwa 0,1 ml, der Enzymlösung verwendet. Wenn die Menge des Farbstoff-Amylosekomplexes erhöht wird, dann muß auch die Menge der anderen zu verwendenden Materialien erhöht werden.

Die relative Menge und Konzentration des Phosphatpuffers im statischen System sollte innerhalb verhältnismäßig enger Grenzen liegen. So können bei der Λ-Amylasebestimmung pro 200 mg Substrat etwa 0,7 bis etwa 1,5 ml des 0,04molaren Phosphatpuffers zugegen sein. Das Volumen und die Konzentration des Puffers sollte jedoch ausreichend sein, um während des gesamten Verlaufes der Bestimmung den pH-Wert zwischen 6,9 und 7,1, vorzugsweise bei 7,0, zu erhalten. Die Verwendung des Phosphatpuffers ist wegen dessen guter Verträglichkeit mit dem System bevorzugt, es können jedoch auch andere übliche Puffer, beispielsweise Trihydroxyaminomethylpropan, Maleatpuffer (ein Gemisch von Natriummaleat und Maleinsäure), verwendet werden. Bei der j3-AmyIasebestimmung sollte das Volumen und die Konzentration des Puffers ausreichen, um den pH-Wert während der ganzen Dauer der Bestimmung zwischen 4,4 und 4,6, vorzugsweise bei 4,5 zu halten.

Die Menge des vorhandenen Natriumchlorids ist beim Ä-Amylasetest kritisch und sollte nicht weniger als 0,01 Mol, vorzugsweise 0,05 Mol, betragen. Die Verwendung von Natriumchlorid ist bevorzugt, es können jedoch auch andere Alkalimetallchloridkatalysatoren, beispielsweise Kaliumchlorid verwendet werden. Bei der /?-Amylasebestimmung gilt hinsichtlich der Menge des verwendeten Natriumchlorids dasselbe wie bei der Λ-Amylasebestimmung.

Beim dynamischen System, bei welchem eine Vorrichtung zum Rühren des Systems erforderlich ist, werden größere Volumina verwendet als beim statischen System. Die Volumsvergrößerung wird dadurch erzielt, daß man das Volumen des Puffers erhöht. So können beim Ä-Amyiasetest anstelle von etwa 0,7 bis etwa 1,5 ml Puffer pro 200 mg unlöslichem Farbstoff-Amylosekomplex, etwa 1,0 bis 5,0 ml, vorzugsweise 4,5 ml, verwendet werden. Alle übrigen Reaktionsbedingungen, Konzentrationen, Mejigen und Materialien sind dieselben wie beim statischen System. Auch bei der /J-Amylasebestimmung unterscheidet sich das dynamische System vom statischen System lediglich im Volumen des verwendeten Puffers.

Sowohl beim dynamischen als auch beim statischen System ist die Einhaltung eines verhältnismäßig engen Temperaturbereiches bei der Ä-Amylasebestimmung von Bedeutung, um zu gewährleisten, daß die Stabilität des Systems nicht beeinträchtigt wird. Dieser Temperaturbereich liegt zwischen 37 und 40° C, wobei eine Temperatur von 40° C bevorzugt ist. Bei der jS-Amylasebestimmung liegt, wenn man einen Schnelltest durchführt, die Temperatur gewöhnlich zwischen 37 und 40° C. Der Test kann jedoch auch bei 20-25° C durchgeführt werden, wobei er dann länger dauert. Die Menge der verwendeten Enzymlösung ist nur im Hinblick auf Ökonomie, einfache Durchführung des Tests und vermutete Größe der Enzymaktivität von Bedeutung. Unter normalen Umständen kann ein zufriedenstellender Farbtest erreicht werden, wenn man etwa 0,¹ bis 0,4 ml Testlösung pro 200 mg Substrat verwendet. Die Dauer des Tests, d. h. diejenige Zeitspanne, während welcher das Gemisch von Enzymlösung und Farbstoff-Amylosekomplex stehengelassen wird, beträgt im allgemeinen etwa 15 Minuten. Diese Zeit reicht aus, um die relative Aktivität und die Menge des vorhandenen Enzyms festzustellen. Eine längere Zeitdauer wäre unökonomisch, während kürzere Zeiten im allgemeinen nicht ausreichen, um eine genügende Menge an Farbstoff zu solubilisieren, um genaue Messungen zu ermöglichen.

Um die Enzymaktivität zu einem bestimmten Zeitpunkt zu stoppen, ist es notwendig, die Reaktion zu unterbrechen, d. h. das System »einzufrieren«. Dies kann auf verschiedene Weise erreicht werden, z. B. durch Veränderung des pH-Wertes des Systems oder durch Entfernung des Produktes. Die bevorzugte Methode zum Unterbrechen der Reaktion bzw. zum »Einfrieren« des Systems besteht in der Änderung des pH-Wertes. Dies kann im Falle der Λ-Amylasebestimmung dadurch bewerkstelligt werden, daß man das Reaktionsgemisch entweder alkalisch macht, z. B. auf einen pH-Wert von 9, vorzugsweise auf einen pH-Wert von 10—11 bringt, oder daß man das Reaktionsgemisch sauer macht, beispielsweise auf einen pH-Wert von 3,5 bis 4,5, vorzugsweise auf einen solchen von 4,0 bringt. Im Falle der /3-Amylasebestimmung wird die Unterbrechung der Reaktion durch Erhöhung des pH-Wertes, vorzugsweise auf 8,5 — 9, bewerkstelligt Die Unterbrechung der Reaktion durch Alkalischmachen eignet sich für Systeme, welche beträchtliche Mengen von Proteinen enthalten, während die saure Unterbrechung für solche Systeme geeignet ist, welche kein oder nur wenig Protein enthalten.

Die alkalische Unterbrechung kann dadurch erreicht werden, daß man eine alkalische Substanz zusetzt, welche derart stark alkalisch ist, daß ein kleines ^volumen zur Erhöhung des pH-Wertes ausreicht. Bevorzugt sind hierbei organische Substanzen, beispielsweise niedere Alkanolamine, wie 2-Amino-2-methyl-1 -propanol und (Trihydroxymethyl)aminomethan.

Die saure Unterbrechung kann dadurch erreicht

werden, daß man eine saure Substanz zusetzt, welche so stark sauer ist, daß man nur ein geringes Volumen zur Senkung des pH-Wertes benötigt, welche aber nicht so stark sauer ist, daß sie die einzelnen Komponenten des Systems in irgendeiner Weise beschädigt Auch hier sind organische Substanzen bevorzugt, beispielsweise niedere Alkancarbonsäure, wie Essigsäure.

Nach der Unterbrechung der Reaktion wird das Gemisch auf ein geeignetes Volumen, auf etwa 10 ml, gebracht und zentrifugiert oder filtriert, um alle unlöslichen Bestandteile zu entfernen. Die aberstehende Flüssigkeit bzw. das Filtrat ist durchscheinend und hat dieselbe Farbe wie der verwendete Farbstoff. Es wird die Adsorption dieser überstehenden Flüssigkeit bzw. dieses Filtrats mit einer Standardprobe verglichen.

Der Farbstoff wird dadurch solubilisiert daß das Enzym den Stärkeanteil des Komplexes angreift Da das Enzym die lineare Stärke in regelmäßiger Weise hydrolysiert, ist die Menge des Farbstoffs, welche zu einem bestimmten Zeitpunkt durch eine bestimmte Enzymaktivität solubilisiert wurde, reproduzierbar. Beim Test gemäß der vorliegenden Erfindung liegt die Reproduzierbarkeit durchschnittlich innerhalb eines Bereiches von 2 —4% des Mittelwertes.

Die bei der obigen Amylasebestimmung verwendeten Substanzen können zweckmäßig zusammen in einem Behälter untergebracht werden, welcher das Substrat, das Verdünnungsmittel und die Standardprobe enthält.

Das Substrat, welches aus dem gefärbten Amylasesubstrat, aus Natriumchlorid und dem Puffer besteht, kann hierbei beispielsweise in einer Kapsel untergebracht sein.

Das Verdünnungsmittel kann ebenfalls in einem geeigneten Behälter, beispielsweise in einem Säckchen, untergebracht sein, welches die Kristalle der Puffersubstanz enthält, welche vor Gebrauch im Wasser aufzulösen sind.

Die Standardlösung kann beispielsweise in einem Proberöhrchen oder in einem Fläschchen untergebracht sein und besteht aus einer abgemessenen Menge der Farbstofflösung.

Der erfindungsgemäße Farbstoff-Amylasekomplex ist für die Amylasebestimmung von Materialien pflanzlichen als auch tierischen Ursprungs geeignet.

Beispiel 1 Herstellung des Farbstoff-Stärkekomplexes

a) 10 g Cibacron Brilliant-blau F3GA in 1 Liter Wasser werden einer Suspension von 100 g Amylose in 1 Liter Wasser bei 50°C unter Rühren zugesetzt. Hierauf werden 200 g wasserfreies Natriumsulfat langsam und unter Rühren während einer Zeitdauer von 30 Minuten und dann 150 ml einer 10%igen Trinatriumphosphatlösung zugesetzt Zum vollständigen Reaktionsablauf rührt man das Reaktionsgemisch bei 5O⁰C 75 Minuten lang. Die erhaltene Suspension wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, in eine Zentrifuge eingetragen und 20 Minuten lang bei 2500-3000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. Der erhaltene Feststoff wird gewaschen, nochmals zentrifugiert und getrocknet. Man erhält auf diese Weise ein blaues pulverförmiges Material, welches einen Komplex von Amylose und Cibacron Brilliant-blau F3GA darstellt und welches pro Mol Farbstoffmolekül etwa 7 bis etwa 10 Zuckeranteile in der Amylose enthält.

b) Wenn man anstelle von Cibacron Brilliant-blau F3GA als Farbstoff Cibacron Brilliant-orange G.E.

verwendet und ansonsten gemäß den Angaben in Beispiel la vorgeht, erhält man ein orangefarbiges pulvriges Material, welches einen Komplex von Amylose und Cibacron Brilliant-orange G. E. darstellt und welches pro Farbstoff molekül etwa 7 bis etwa 10 Zuckeranteile in der Amylose enthält.

Beispiel 2 Bestimmung der Amylaseaktivität

a) In einem 25-ml-Erlenmeyerkolben werden 200 mg des nach den Angaben in Beispiel 1 erhaltenen Cibacron Brilliant-blau F3GA-Atnylosekomplexes in 4,5 ml einer 0,04molaren Phosphatpufferlösung (pH 7,0), welche 0,05

is Mol Natriumchlorid enthält, suspendiert und die Suspension wird auf 40° C erwärmt Dieser Suspension werden hierauf 0,1 -0,4 ml der zu prüfenden Enzymlösung zugesetzt, worauf man das Gemisch bei 40° C 15 Minuten lang in einer Schüttelapparatur ausreagieren läßt Hierauf wird 1 ml 2-Amino-2-methyl-l-propanol (0,5 Mol, pH ist gleich 10,25) zugesetzt und das Gemisch wird auf 10,0 ml verdünnt und zentrifugiert Man mißt nun die Absorption der überstehenden Flüssigkeit im Vergleich zu einer Standardprobe bei 625 mu. Die Standardprobe stellt man nach den obigen Angaben her, wobei man jedoch anstatt der Enzymprobe 0,1 —0,4 ml Wasser verwendet

Durch Messung der Absorption von Lösungen von Cibacron Brilliant-blau F3GA, welche 100 bis 400 μg Farbstoff in 10 ml eines gemischten Phosphat-Alkanolaminpuffers enthalten, wird eine Eichkurve hergestellt

Resultat: «-Amylase aus Schweinepankreas, 1 :10,000 verdünnt, wurde als Enzymquelle verwendet und es ist in der folgenden Tabelle die Aktivität durch die Menge Farbstoff (in mg) ausgedrückt, welche durch 1 ml der Enzymprobe freigesetzt wurde.

Milliliter Enzymlösung

A625 ηιμ Freigesetzter Mittel- Mg. Farb-Farbstoff wert stoff/ml

(mg)

0,1 0,22; 0,21 0,137; 0,131 0,134 1,34

0,2 0,43; 0,41 0,256; 0,269 0,262 Ul

0,3 0,60; 0,61 0,375; 0381 0378 1,26

0,4 0,80; 0,83 0,500; 0,519 0,509 1,27

b) 0,2 ml einer 50-250 ml Amylaseeinheiten (reduk trimetrisch bestimmt) enthaltenden Enzymlösung wer den zu 4,5 ml einer 0,5 —2,5%igen Suspension eines gemäß Beispiel 1 erhaltenen Brilliant-orange G. E.-Amylosekomplexes in einem 0,02-0,1 molaren Phosphatpuffer (pH 7,0), welcher 0,01-0,05 Mol Natrium-

ss chlorid enthält, zugesetzt. Das Gemisch wird 3C Minuten lang auf 40° erwärmt.

Am Ende dieser Reaktionszeit werden 2 ml einei 1 η-Essigsäure zugesetzt und das resultierende unlösli ehe Material wird entfernt Man mißt die Absorptior der zurückbleibenden Lösung im Vergleich mit eine:

Kontrollprobe in einem Spektrophotometer bei 490 ηιμ Die Kontrollprobe wird in der gleichen Weise

hergestellt wobei jedoch anstelle der Enzymprobe destilliertes Wasser verwendet wird.

Resultate: Die Ergebnisse sind in der folgender Tabelle durch die Menge des freigesetzten Farbstoffe: pro Menge reduzierenden Zuckers (als Glucose ausgedrückt) dargestellt.

Enzymeinheiten (Glucose/100 ml)

Farbstoffeinheiten (A490 Χίο³)

Farbstoff/ Glucose

50	80	1,6
125	345	2,76
250	680	2,72

c) 1,0 ml eines 0-Amylase enthaltenden Pilzextraktes (Diazym L30) wird unter Rühren einer Suspension von 2,0 g eines Cibacron Brilliant-blau F3GA-Amylosekomplexes in 100 ml eines 0,04molaren Phosphatpuffers mit einem pH-Wert von 4,5 zugesetzt Ein 2 ml Anteil hiervon wird als Kontrollprobe verwendet und mit 0,5 ml einer 0,1 molaren 2^111^0-2-111611^1-1-propanol-Lösung behandelt.

Man setzt das Mischen bei Raumtemperatur (25°) fort und nimmt in Zeitabständen jeweils 2,0 ml Anteile und behandelt diese mit 0,5 ml einer 0,1 molaren 2-Amino-2-methyl-1-propanol-Lösung, um die Reaktion abzubrechen.

Die einzelnen Anteile werden auf reduzierende Zucker (als Glucose ausgedrückt) und auf die Menge des solubilisierten Farbstoffes analysiert

Resultate: Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle als Menge freigesetzter Farbstoff pro Menge reduzierender Zucker (als Glucose ausgedrückt) dargestellt

Probe	Reaktions	Mg. Glucose	Mg. Farb	Farbstoff/
Nr.	zeit		stoff	Glucose
	(Min.)	100 ml	100 ml
1	15	55	7,0	0,13
2	60	162	23,0	0,14
3	90	227	33,75	0,15
4	120	260	37,25	0,14
5	150	312,5	44,25	0,14
6	180	332,5	50,50	0,15
				ΟΪ4

20

25

10

35

40

c) Standard

10

Beispiel 3

Eine Reagentiengarnitur zur Durchführung von 100 Amylasetests enthält beispielsweise die folgenden Bestandteile:

a) Substrat

200 Kapseln, von welchen jede die folgenden Substanzen (in mg pro Kapsel) enthält:

Amylasesubstrat 200

Einbasisches Natriumphosphat 1,94 Wasserfreies zweibasisches

Natriumphosphat 2,99 Natriumchlorid 0,93

b) Verdünnungsmittel

15 m! einer Standardlösung mit einem Gehalt entsprechend 29,2 mg/100 ml, welche wie folgt hergestellt wird:

Es werden 292,0 mg Cibacron Brilliant-blau F3GA in einem Liter destilliertem Wasser gelöst und diese Lösung wird in 15 ml Anteile aufgeteilt, welche jeweils in verschlossene Glasbehälter abgefüllt werden.

Beispiel 4 Bestimmung der Amylaseaktivität

Der Inhalt einer Substratkapsel (hergestellt nach den Angaben in Beispiel 3) und 0,8 ml destilliertes Wasser werden je in ein Reagenzglas, welches mit »Test« bezeichnet ist, und in ein Reagenzglas, welches mit »Blindprobe« bezeichnet ist, eingebracht. Die erhaltene Aufschlämmung wird gründlich gemischt und beide Reagenzgläser werden 10 Minuten lang bei 37⁰C gehalten.

Dem mit »Test« bezeichneten Reagenzglas werden 0,1 ml Serum zugesetzt und es wird kräftig geschüttelt. Beide Reagenzgläser werden dann genau 15 Minuten lang bei 37⁰C gehalten.

10 ml Verdünnungsmittel, hergestellt durch Auflösung von 138 g NaH₂PO* · H₂O entionisiertem oder destilliertem Wasser auf 100 ml, werden beiden Reagenzgläsern zugesetzt. Hierauf Wird dem mit »Blindprobe« bezeichneten Reagenzglas 0,1 ml Serum zugesetzt Der Inhalt der Reagenzgläser wird gründlich gemischt und zentrifugiert, um eine klare überstehende Flüssigkeit zu erhalten.

Die optische Dichte der mit »Test« bezeichneten Lösung wird hierauf bei 625 ΐημ (Rotfilter) mit der »Blindprobe« verglichen und die Amylaseaktivität wird aus einer Eichkurve bestimmt

In der folgenden Tabelle sind die Ergebnisse, ausgedrückt als Menge freigesetzten Farbstoffs pro 0,1 ml Testlösung, bei Verwendung von verschiedenen Serumproben zusammengestellt:

55

1,38 g NaH₂PO* Wasser (pH 4,2).

H₂O-Kristalle zum Verdünnen mit

Probe Nr.	Mg Farbstoff/ 0,1 ml
1	0,085
2	0,074
3	0,077
4	0,110
5	0,103
6	0,069
7	0,118
8	0,072
9	0,118
Serumkontrollprobe	0,072
Mittelwert	0,089

Claims

Patentansprüche;

1. Verfahren zur Bestimmung der «-Amylaseaktivität eines Materials, wobei man einen Komplex aus einem wasserlöslichen Reaktivfarbstoff und einem Amylose enthaltenden Material der enzymatischen Wirkung des zu untersuchenden Materials in einem wäßrigen Phosphatpuffer bei einem pH-Wert von etwa 6,9-7,1 bei einer Temperatur von 37 bis 40° C unterwirft, die Reaktion abbricht und die Farbe der überstehenden Flüssigkeit mit einem Standard vergleicht, dadurch gekennzeichnet, daß man einen wasserunlöslichen Komplex eines Monochlortriazinfarbstoffs verwendet und die enzymatische Einwirkung in Gegenwart eines Alkalimetallchlorid-Katalysators durchführt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Komplex verwendet, dessen Farbstoffkomponente ein Monochlortriazin mit einem Anthrachinon-disulfonatsubstituenten ist

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Komplex verwendet, dessen Farbstoffkomponente Cibacron Brilliantblau F3GA ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Komplex verwendet, dessen Farbstoffkomponente Cibracron Brilliant-orange G. E. ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1—4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Alkalimetallchloridkatalysator Natriumchlorid verwendet.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1—5, dadurch gekennzeichnet, daß man nach 15 Minuten die Reaktion durch Erhöhung des pH-Wertes des Testmediums auf wenigstens 9 mit einem niederen Alkanolamin abbricht.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als niederes Alkanolamin 2-Amino-2-methyl-1 -propanol verwendet.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reaktion durch Senkung des pH-Wertes des Testmediums mit Essigsäure abbricht.