DE3686071T2

DE3686071T2 - Polarisierter fluoreszenztest von makromolekularen hydrolasen.

Info

Publication number: DE3686071T2
Application number: DE8686102035T
Authority: DE
Inventors: Mark Raymond Shaffar
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1985-02-25
Filing date: 1986-02-18
Publication date: 1993-01-07
Anticipated expiration: 2006-02-19
Also published as: ES8708261A1; EP0194472B1; ES552374A0; ES557135A0; AU5381086A; ATE78517T1; ES8801518A1; DE3686071D1; CA1279242C; JPH0687795B2; EP0194472A3; EP0194472A2; AU596574B2; JPS61234797A

Description

TECHNISCHES GEBIET:

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Durchführung eines Fluoreszenz-Polarisationstests unter Verwendung von Reagentien, zum Bestimmen des Vorliegens und/oder der Menge makromolekularer Hydrolasen in einer Flüssigkeit, insbesondere in biologischen flüssigen Proben, wie z.B. Vollblut, Serum, Plasma oder Urin.

GRUNDLEGENDER STAND DER TECHNIK:

Es gibt viele Situationen, in welchen es wünschenswert ist, auf die Aktivität makromolekularer Hydrolasen zu analysieren. Aus dem Buch "Fundamentals of Clinical Chemistry" W.B.Saunders (Hsg.), Philadelphia, Pennsylvania,S. 625 - 643 (1976) sind Verfahren zum Messen der Hydrolasenaktivität bekannt. In der Vergangenheit umfaßten Tests auf solche Hydrolasen typischerweise die Verwendung einer Mehrzahl von Enzymen und Substraten als Reagentien. Solche Tests sind insofern auf Schwierigkeiten gestoßen, als die Beständigkeit der verschiedenen Enzyme und Substrate, welche in einer einzigen Reagenslösung vereinigt waren, von miteinander unverträglichen Erfordernissen hinsichtlich solcher Bedingungen wie der Temperatur, des PH-Wertes, des Salzgehaltes und dgl. mehr abhängig war. Beispielsweise mögen die Substrate in Lösungen mit einem relativ niedrigen pH-Wert beständiger sein, während die Enzyme in Lösungen mit einem höheren pH-Wert beständiger sein mögen, sodaß sich ein ernstes Problem aus der mangelnden Verfügbarkeit einer für beide Teile annehmbaren Umgebung für das Substrat und für das Enzym ergibt. Andere potentielle Schwierigkeiten bei der Druchführung solcher Tests ergeben sich aus der Möglichkeit von Kreuzreaktivität zwischen den verschiedenen Enzymen, die für die Analyse erforderlich sind.
Eine besonders vorteilhafte Anwendung für einen Test auf eine makromolekulare Hydrolase ist die quantitative Bestimmung einer Polysaccharid-Hydrolase, wie z .B. der alpha-Amylase, alpha-Amylase ist ein Enzym, welches alpha-glukosidische Bindungen in Stärke und in verwandten Polysacchariden hydrolysiert. Bei verschiedenen Krankheitszuständen zeigt sich ein erhöhter Amylasespiegel, darunter bei Pankreatitis, Ulcus pepticum, Verstopfung des Pankreasganges, Pankreaskarzinom, akuter Alkoholeinnahme oder -vergiftung und bei Speicheldrüsenkrankheiten, wie z.B. Mumps, wie dies in dem Buch von Bradley et al, "Textbook of Surgery", W.B.Saunders (Hsg.), Philadelphia, Pennsylvania, S.1294 (1981), beschrieben ist.
Gemäß einer zum Stande der Technik gehörenden Verfahrensweise wird auf die Aktivität von alpha-Amylase dadurch geprüft, daß man den Grad der Lichtabsorption von NADH (reduziertem Nicotinamidadenindinukleotid) bei einer Wellenlänge von 340 nm mißt, nachdem eine Probe mit Phosphorylase, Phosphoglucomutase, Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase und einem Limit-Dextrin umgesetzt worden ist, wie dies in Hanson et al, Clin. Chem., Bd.24, S.762 - 768 (1978) beschrieben ist.
Eine andere Anwendung für einen Test auf eine markomolekulare Hydrolase ist die quantitative Bestimmung von Endoproteasen, wie z.B. Trypsin. Trypsin ist eine Endoprotease, welche in dem Pankreas vorkommt. Typischerweise wird auf das Trypsin unter Verwendung eines chromogenen Substrates, wie z.B. von N-α-Benzoylargininethylester (BAEE), geprüft. Da der BAEE ein relativ kleines, synthetisches Substrat ist, sind in dieser Weise durchgeführte Tests nicht äußerst spezifisch.
Obgleich kleine synthetische Substrate relativ einfach herzustellen sind, so zeigen sie doch wegen ihrer Größe die Tendenz in die Richtung einer mangelnden Spezifität. Große synthetische Substrate zeigen die Tendenz, für ein gegebenes Enzym in höherem Maße spezifisch zu sein, doch können sie äußerst schwer herzustellen sein. Dafür ist eine genaue Kenntnis der Chemie des Spaltens des Enzyms erforderlich, und sobald man sich dieses Wissen einmal erworben hat, kann die Synthese als solche kompliziert sein.
Alternativ ist auf Trypsin dadurch analysiert worden, daß man eine Probe davon auf einen Gelatinefilm aufgebracht hat. Ein positiver Wert für das Trypsin wird dann angegeben, wenn sich die Gelatine verflüssigt. Dieses letztgenannte Verfahren krankt an dem Nachteil, daß es die Tendenz zeigt, bloß eine qualitative Art von Analyse zu sein. Eine weitere Testmethode, welche auf einige Proteasen anwendbar ist, ist das häufig angewendete Verfahren des radioaktiven Markierens. Ein Hauptnachteil dieses Verfahrens besteht darin, daß das nicht-umgesetzte Substrat von dem umgesetzten Substrat abgetrennt werden muß, bevor man durch Messen der Radioaktivität die Testergebnisse ermitteln kann.
Auf dem Fachgebiet ist auch ein Fluoreszenz-Polarisationstest zur Bestimmung der Hydrolasenaktivität einer bekannten Trypsinmenge, welche auf mit Fluoresceinisothiocyanat markiertes Casein,in Gegenwart einer unbekannten Menge eines Trypsin-Inhibitors einwirkt, bekannt, welcher Test von Spencer et al (1973), Clin. Chem.19, 838 - 844, beschrieben worden ist.
Noch eine andere Anwendung ist die quantitative Bestimmung von Lipasen. In der Vergangenheit ist auf Lipasen typischerweise nach Verfahren analysiert worden, welche auf einem synthetischen chromogenen Substrat oder auf der Trübungsklärung basierten. Solche Techniken sind nicht ohne Nachteile, und diese Verfahren leiden unter Problemen der Beständigkeit, Reinheit und Kennzeichnung des Substrates, sowie unter Problemen der Spezifität und Reproduzierbarkeit.
Demgemäß besteht derzeit ein Bedarf nach einem einfachen und genauen Mittel zur quantitativen Analyse von Flüssigkeiten auf makromolekulare Hydrolasen, wie z.B. Amylasen, Endoproteasen und Lipasen.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG:

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Analysenverfahren zur Durchführung eines Fluoreszenz-Polarisationstests zum quantitativen Bestimmen des Vorliegens makromolekularer Hydrolasen, welche aus Amylasen und Lipasen ausgewählt sind.
Die in dem erfindungsgemäßen Verahren verwendeten Reagentien umfassen ein Substrat, welches von der zu bestimmenden Hydrolase gespalten werden kann, und welches Substrat an ein Fluorophor gekuppelt ist, welches seinerseits befähigt ist, eine Fluoreszenz-Polarisationsantwort auf in einer Ebene polarisiertes Licht zu erzeugen.
Die Verfahren zum Synthetisieren dieser Reagentien umfassen das Kuppeln eines Substrates, welches durch eine makromolekulare Hydrolase gespalten werden kann, an ein Fluorophor, welches befähigt ist, eine Fluoreszenz-Polarisationsantwort zu erzeugen. Die allgemein Formel für ein solches Substrat läßt sich mit P-(x-F)n angeben, worin P für das makromolekulare Substrat steht, welches aus einer Gruppe ausgewählt werden kann, welche aus Polysacchariden, Polypeptiden, Lipopolypeptiden und Polynukleotiden besteht; worin x für eine stabile Verknüpfungsgruppe steht, welche ans einer Gruppe ausgewählt werden kann, welche aus Alkylen, Arylen, Amiden, Aminen, Thioaminen, Carbonaten, Thiocarbonaten, Carbonylen, Sulfonaten, Imiden, Estern, Thioestern, Ethern, Thioethern besteht; worin F für ein Fluorophor steht; und worin n für die Anzahl der Fluorophore und Verknüpfungsgruppen auf dem Substrat steht.
Gemäß der Erfindung werden Verfahren zur Durchführung von Fluoreszenz-Polarisationstests auf makromolekulare Hydrolasen, welche aus Amylase und Lipase ausgewählt sind, zur Verfügung gestellt. Diese Analysenverfahren umfassen das Herstellen einer Testlösung,welche eine den Analyten enthaltende Probe und ein Substrat enthält, welches letztgenannte von der zu analysierenden, makromolekularen Hydrolase gespalten werden kann, und welches Substrat an einen fluorophoren (Fluoreszenz verursachenden) Rest gekuppelt ist, der befähigt ist, eine Fluoreszenz-Polarisationsantwort zu erzeugen. Dann läßt man die Testlösung während einer Zeitspanne inkubieren. Nach der Inkubation wird in einer Ebene polarisiertes Licht durch die so entstandene Lösung geführt, und die Fluoreszenz-Polarisationsantwort wird als Hinweis auf das Vorliegen der makromolekularen Hydrolase in der Probe festgestellt.
Weitere Ziele und damit verbundene Vorteile der vorliegenden Erfindung werden am besten unter Bezugnahme auf die nachstehende, eingehende Beschreibung und die Beispiele verständlich sein.

ElNGEHENDE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG:

Diese Erfindung betrifft einen Fluoreszenz-Polarisationstest zum Bestimmen des Vorliegens makromolekularer Hydrolasen, welche aus Amylasen und Lipasen ausgewählt sind, in einer Probe. Durch die Erfindung werden Reagentien, und Verfahren zur Herstellung der in dem Test verwendeten Reagentien, sowie Verfahren für die Durchführung des Tests zur Verfügung gestellt. Der Test der vorliegenden Erfindung kann für die qualitative oder quantitative Bestimmung makromolekularer Hydrolasen verwendet werden, und demgemäß soll sich der Ausdruck "Bestimmen" im Rahmen der vorliegenden Unterlagen sowohl auf qualitative als auch auf quantitative Analysen beziehen.
Der Fluoreszenz-Polarisationstest der vorliegenden Erfindung bietet viele Vorteile gegenüber Tests auf makromolekulare Hydrolasen, welche Tests schon früher bekannt gewesen oder vorgeschlagen worden sind. Mehrere dieser Vorteile ergeben sich daraus, daß in dem Testsystem der Erfindung nur ein einziges Substrat erforderlich ist, während sich weitere Vorteile aus der bevorzugten Verwendung eines natürlichen statt eines synthetischen Substrates ergeben.
Weil in dem Testsystem der vorliegenden Erfindung nur ein einziges Substrat erforderlich ist, sind dabei Probleme, welche mit der Stabilisierung des Testsystems einhergehen, auf ein Minimum herabgesetzt. Wie oben bereits erörtert worden ist, weisen bei anderen Testsystemen die verschiedenen verwendeten Substrate und Enzyme häufig miteinander unverträgliche Erfordernisse hinsichtlich der Beständigkeit auf. Ein Begleitvorteil ist darin gelegen, daß nur ein einziges Substrat für den Gebrauch in dem Testsystem hergestellt werden muß.
Bei dem Test der vorliegenden Erfindung wird vorzugsweise ein natürliches statt eines synthetischen Substrates angewendet. Die Herstellung eines natürlichen Substrates ist eine relativ einfache Aufgabe, weil es nicht notwendig ist, chemisch die Struktur eines synthetischen Substrates zu bestimmen, welches für die zu bestimmende makromolekulare Hydrolase spezifisch sein wird, und weil es auch nicht notwendig ist, eine komplizierte Syntheseverfahrensweise zu entwerfen und auszuführen, welche Syntheseverfahrensweise auf die Erzeugung eines solchen Substrates gerichtet ist. Ein wichtiges Ergebnis der Verwendung eines einzigen Substrates, welches als solches leicht herstellbar ist, sind die relativ niedrigen Reagenskosten. Noch weitere Vorteile sind darin gelegen, daß die gemäß der vorliegenden Erfindung durchgeführten Teste hochgradig empfindlich und äußerst gut reproduzierbar sind. Natürliche Substrate sind auch deshalb besonders vorteilhaft, weil sie die Tendenz zeigen, im Vergleich zu synthetisierten Materialien eine sogar noch bessere Testspezifität zu ergeben.
Der Test der vorliegenden Erfindung beruht auf den Prinzipien der Fluoreszenz-Polarisation. Gemäß diesen Prinzipien gilt, daß ein Fluorophor dann, wenn es durch einen Strahl von in einer Ebene polarisiertem Licht angeregt wird, seinerseits polarisiertes Licht emittieren wird. Der Grad der Polarisation des emittierten Lichtes wird in umgekehrter Relation zum Rotationsgrad des das Fluorophor enthaltenden Moleküls in der Zeitspanne zwischen dem Zeitpunkt der Anregung und demjenigen der Emission stehen. Die Zeit, welche ein Molekül dazu braucht, um sich um einen Winkel von annähernd 68,5º zu drehen, wurde als die Rotationsrelaxationszeit des Moleküls definiert. Die Rotationsrelaxationszeit ist relativ klein (in der Größenordnung von etwa 1 ns) für kleine Moleküle (wie z.B. Fluorescein), und sie ist groß (in der Größenordnung von etwa 100 ns) für große Moleküle (wie z .B. Immunglobuline). Die Rotationsrelaxationszeit eines Moleküls hängt in erster Linie von dessen Volumen ab, sodaß die beobachtete Polarisation der Fluoreszenz des Moleküls in Lösung einen direkten Hinweis auf dessen Größe gibt.
Noch ein weiterer Vorteil des Tests der vorliegenden Erfindung ist darin gelegen, daß es sich dabei um einen homogenen Test handelt, was bedeutet, daß es nicht notwendig ist, die abgespaltenen Produkte von dem nicht-umgesetzten Substrat abzutrennen, bevor man das Ausmaß der Fluoreszenz-Polarisation abliest.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann auf makromolekulare Hydrolasen dadurch analysiert werden, daß ein Substrat zur Verfügung gestellt wird, welches von der zu bestimmden mahromolekularen Hydrolase gespalten werden kann, wobei das Substrat mit einem Fluorophor markiert ist. Dadurch, daß man das Reaktionsgemisch nacheinander zuerst mit vertikal polarisiertem Licht und dann mit horizontal polarisiertem Licht anregt und nur die vertikale Komponente des emittierten Lichtes analysiert, kann die Polarisation der Fluoreszenz in dem Reaktionsgemisch sehr genau bestimmt werden. Ist das Substrat intakt, dann ist das Fluorophor Teil eines sehr großen Moleküls, sodaß die Fluoreszenz-Polarisationsantwort einen hohen Wert ergibt. Wurde das Substrat durch das Hydrolase-Enzym gespalten, dann ist das Fluorphor ein Teil eines kleineren Moleküls, und die diesem Fluorophorrest zuzuschreibende Fluoreszenz-Polarisationsantwort wird wesentlich reduziert sein. Ist viel Enzym vorhanden, dann wird die Geschwindigkeit der Fluoreszenz-Depolarisation eine wesentliche sein, während die makromolekularen Substrate dann, wenn wenig oder gar kein Enzym vorhanden ist, relativ langsam oder überhaupt nicht gespalten werden, und die Geschwindigkeit der Fluoreszenz-Depolarisation entsprechend langsam sein wird.
Die Prinzipen der vorliegenden Erfindung sind auf die breitgefaßte Kategorie von Verbindungen anwendbar, welche als makromolekulare Hydrolasen bekannt sind,und welche Kategorie die folgenden Verbindungen umfaßt, aber nicht darauf beschränkt ist: alpha- und beta-Amylasen; Lipasen; Esterasen; Pektinasen; Nukleotidase; Laminarinase; Dextranase; Polygalacturonase; Chitinase; Lysozyme; Neuraminidase; Hyaluronidase; Nukleosidasen; Aminopeptidase; Carboxypeptidasen; Glutamylcarboxypeptidase; Proinsulinase; Insulinase; Renin; Pepsin; Trypsin; Chymotrypsin; Pancreatopeptidase; Cathepsin; Papain; Chymopapain; Ficin; Thrombin; Plasmin; Subtilopeptidase; Aspergillopeptidase; Streptococcus-Peptidase; Streptokinase; Clostridiopeptidase; Bromelain; Keratinase; Urokinase; Enteropeptidase; Kallikrein, Apopyridoxalenzym-Hydrolase; und Pectat-Lyase. Die breitgefaßten Klassen makromolekularer Hydrolasen, welche von besonderem Interesse für die Zwecke dieser Erfindung sind, umfassen die Amylasen und die Lipasen, welche in den vorliegenden Unterlagen als Beispiele angeführt sind.
In dem Verfahren der vorliegenden Erfindung kann eine umfassende Vielfalt von Fluorophoren verwendet werden. Wie vorstehend bereits erwähnt worden ist, wird die Auswahl des Fluorophors von der besonderen, zu bestimmenden makromolekularen Hydrolase und von dem besonderen, verwendeten Reagentiensystem abhängen. Repräsentativ für die Klassen von brauchbaren Fluorophoren sind Fluoresceine, Rhodamine, Flavine, Cumarine, Napthaline, Acridine, Anthracene, mehrkernige kondensierte Kohlenwasserstoffe, Stilbene, Anthranilsäuren, Aminostyrylpyridine, Chinoline, Salicylsäuren, Cyanine, Oxonole, Phenanthidine, Fluorescamine sowie Derivate und Salze hievon. Erläuternde Beispiele von spezifischen Fluorophoren, welche verwendet werden können, umfassen, z.B. Eosin, Rhodamin, Aminonaphthalinsulfonat, Acriflavin, Fluorescein, Dihydroxybenzoesäure, Hydroxychinolin, NADH, Riboflavin, Brilliant-Sulfaflavin, Chinin, Naphtholsulfonsäure, Thioflavin, Cumarin, Acridinorange, 8-Anilino-1-naphthalinsulfonsäure, Oxazin, Umbelliferon, Acridin, Resorufin, sowie Derivate und Salze hievon. Bei den derzeit bevorzugten Ausführungsformen werden Fluoresceine verwendet; insbesondere haben sich 4,6-Dichlortriazin-2-(yl)aminofluorescein (DTAF) und Fluoresceinisothiocyanat (FITC) als besonders wirksam und vorteilhaft erwiesen.
Veranschaulichende Beispiele für das Verfahren sind jene, wobei das Substrat Amylose, Gelatine, Haemoglobin, Casein oder Lipoprotein umfaßt und an einen Fluoresceinrest gekuppelt ist. Veranschaulichende Beispiele für in einem solchen Verfahren zu verwendende Fluoresceinreste sind 4,6-Dichlortriazin-2-(yl)-aminofluorescein, ein Derivat von 4,6-Dichlortriazin-2-(yl)-aminofluorescein, Fluorescein-isothiocyanat oder ein Derivat von Fluorescein-isothiocyanat.
Dem Fachmann wird klar sein, daß die Auswahl des zu verwendenden Fluorophors von solchen Faktoren wie:
(1) den Anregungs- und Emissionswellenlängen des Fluorophors und des verwendeten Gerätes;
(2) der Verknüpfungsfunktionalität zwischen dem Fluorophor und dem Substrat;
(3) der Rotationsrelaxationszeit des freien Labels;
(4) der Quantenausbeute; und
(5) dem Extinktionskoeffizienten abhängen wird.
Darüberhinaus ist die richtige Auswähl der Wellenlängen der Anregung bzw. der Emission des Fluorophors auch wichtig für die Verringerung der Störung auf Grund verschiedener Komponenten in der zu analysierenden Probe, wie z.B. Hämoglobin und Bilirubin. Demgemäß sollte das Fluorophor so ausgewählt werden, daß seine Wellenlängen der Anregung bzw. Emission sich nicht dem Spektrum für die dekadische Extinktion von solchen Substanzen, wie z.B. Hämoglobin und Bilirubin, überlappen.
Die Verknüpfungsfunktionalität beeinflußt die Auswahl des Fluorophors insofern, als gewisse Substrate funktionelle Gruppen aufweisen, von denen es bekannt ist, daß sie mit gewissen Fluorophoren reagieren. Beispielsweise reagiert DTAF stark mit dem Aminrest auf Lysingruppen; demgemäß kann das DTAF dann, wenn Lysingruppen auf dem Substrat leicht verfügbar sind, das Fluorophor der Wahl sein. Andere Beispiele können von einem Fachmann leicht festgestellt werden. Manchmal können verbindende Gruppen, wie z.B. aliphatische Ketten, zum Verknüpfen der betreffenden Verknüpfungsfunktionalität des Fluorophors und des Substrates verwendet werden. Eine Liste von Typen von als Beispiele herangezogenen Verknüpfungsgruppen ist vorstehend bereits angeführt worden.
Die Rotationsrelaxationszeit wird nach der Perrin-Gleichung berechnet, welche dem Fachmann wohlbekannt ist. Dies ist ein wichtiger Faktor, weil die Genauigkeit des Tests von der Feststellung der Unterschiede in der Fluoreszenz-Polarisationsantwort über eine Zeitspanne abhängen wird. Erzeugt das gespaltene Fluorophor-Substrat eine Polarisationsantwort, welche sich nicht nennenswert von jener unterscheidet, welche von dem intakten Fluorophor-Substrat erzeugt wird, dann wird es schwierig sein, eine signifikante Depolarisationsantwort nachzuweisen. Die Quantenausbeute und der Extinktionskoeffizient des Fluorophors sind wichtig, weil sie einen Einfluß auf das Mindestausmaß der Substitution des Substrates mit dem Fluorophor haben; nämlich das Mindestausmaß dafür, daß eine ausreichende Fluoreszenzintensität für eine Arbeitskonzentration des Substrates beobachtet werden kann. Sind die Quantenausbeute und der Extinktionskoeffizient schlecht, dann mag eine für eine genaue Messung der Fluoreszenz-Polarisation einer Lösung ungenügende Fluoreszenzintensität beobachtet werden. Eine schlechte Quantenausbeute erfordert ein hohes Ausmaß von Substitution auf dem Substrat.
Die Substrate sollten im Hinblick darauf ausgewählt werden, wie gut sie von der zu analysierenden makromolekularen Hydrolase gespalten werden. Es ist wichtig, daß dieses Spalten so vor sich geht, daß die Größe des Substrates innerhalb einer relativ kurzen Zeitspanne durch die Hydrolase beträchtlich reduziert sein wird. Das derzeit bevorzugte Substrat für einen Test auf z.B. alpha-Amylase gemäß der Erfindung ist Kartoffelamylose, welche gute Ergebnisse liefert, wenn sie an die oben beschriebenen Fluorophorenreste DTAF und FITC gekuppelt ist. Andere Substrate, welche in diesem Test gute Ergebnisse geliefert haben, sind Amylopektin, Kartoffelstärke, Litners Lösliche Stärke, und Maltrin 040, 050,100, 250, 500 und 550, die von der Firma Grain Processing Corporation, Muscatine, Iowa, erhältlich sind. Andere nützliche Substrate sind Stärken, wie z.B. Weizen-, Reis-, Maisstärke und Dextrin.
Eine geeignete Verfahrensweise zum Kalibrieren des Enyms besteht darin, daß man eine Reihe von Lösungen herstellt, welche unterschiedliche Mengen des Enzyms enthalten, und daß man dann auf Grund des Testens dieser Lösungen mit einem Bezugsverfahren einen Enzym-Aktivitätswert erhält. Die kalibrierten Enzymlösungen werden dann nach der oben beschriebenen Fluoreszenz-Polarisationsverfahrensweise analysiert. Die Polarisationswerte werden gegen die Werte für die Enzym-Aktivität aufgetragen, um eine Standardkurve zu konstruieren.
Die Testparameter werden dadurch optimiert, daß man die Variablen der Verfahrensweise aufeinander abstimmt. Die Parameter des Tests betreffend die Menge der Probe und die Inkubation werden dadurch optimiert, daß man die Variablen der Testspanne (ausgedrückt als Millipolarisation zwischen dem niedrigsten und dem höchsten, für das Kalibrieren verwendeten Wert), der Störung durch die Probenmatrix, des Testdurchsatzes, der Inkubationszeit und der Genauigkeit aufeinander abgleicht. Die derzeit bevorzugte optimale Probenmenge sind 25 ul/2ml des Reaktionsvolumens. Ein optimaler Durchsatz wird dann erhalten, wenn man die Inkubationszeit bei etwa 5 min oder darunter hält. Zur Erzielung einer Genauigkeit mit einem Variationskoeffizienten von unter 5 % wird eine Testspanne von mehr als 50 Millipolarisationseinheiten bevorzugt. Die Substratkonzentration in dem Reagentiengemisch wird dadurch optimiert, daß man die Testspanne, die Photometer-Intensität und die Störung durch die Probenmatrix aufeinander abgleicht.
Ein Test auf Amylase, der gemäß der bevorzugten Verfahrensweise durchgeführt worden ist, wie dieselbe im Rahmen der vorliegenden Unterlagen beschrieben ist, hat sich als hochgradig genau erwiesen. Es wurde eine Übereinstimmungsuntersuchung durchgeführt, wobei ein im Handel erhältlicher Amylasetest (Agent von Abbott Laboratories, North Chicago, Illinois) mit den Ergebnisse verglichen wurde, die bei der bevorzugten Verfahrensweise erhalten wuden, und zwar unter Verwendung von 36 Patientenproben mit unterschiedlichen Mengen von Amylase. Diese Korrelationsstudie ergab gute Ergebnisse, wobei die Genauigkeit eines Amylase-Tests demonstriert wurde, der gemäß der vorliegenden Erfindung durchgeführt worden ist.
Selbstverständlich ist es klar, daß die derzeit bevorzugten Verfahrensweisen und Testparameter nur zum Zwecke der Veranschaulichung angeführt sind und nicht als einschränkend angesehen werden dürfen, und daß dieselben innerhalb weiter Bereiche variiert werden können, um an besondere Verwendungszwecke angepaßt zu werden, wie dies für einen Fachmann auf der Hand liegt. Demgemäß können - obgleich die derzeit in höchstem Maße bevorzugten Testbedingungen eine Testtemperatur von 35ºC oder von etwa 35ºC, Inkubationszeiten von 5 min oder von etwa 5 min, einen pH-Wert von 7,5 oder von etwa 7,5, und eine Substratkonzentration von 50 ug/ml oder von etwa 50 ug/ml umfassen, diese Bedingungen innerhalb weiter Bereiche variiert werden. So kann z.B. die Testtemperatur innerhalb des Bereiches von etwa 15ºC bis etwa 45ºC gehalten werden; kann die Inkubationszeit in Abhängigkeit von der gewünschten Empfindlichkeit des Tests innerhalb eines Bereiches von etwa 1 s bis zu etwa mehreren Stunden ausgewählt werden (obgleich Inkubationszeiten bevorzugt werden, die innerhalb eines Bereiches von etwa 1 min bis etwa 1 h ausgewählt sind); kann der pH-Wert - in Abhängigkeit von der Enzym-Aktivität bei dem spezifizierten pH-Wert - in einem Bereich von etwa 3 bis etwa 11 gehalten werden; und kann die Substratkonzentration in einem Bereich von etwa 0,01 ng/ml bis etwa 300 mg/ml in der Endtestlösung ausgewählt werden, und zwar in Abhängigkeit von der Löslichkeit und der Quantenausbeute des Fluorophors.
Weiterhin kann der bevorzugte Fluoreszenz-Depolarisationstest der Erfindung z.B. dadurch variiert werden, daß man die Fluoreszenz-Polarisationsantwort in Zeitabständen untersucht, welche nicht unbedingt sofort nach der Inkubationszeit beginnen. Beispielsweise kann ein einzelner Wert zu einem Zeitpunkt nach der Inkubation abgelesen werden, und mit einem bei einer Kontrolle abgelesenen Wert verglichen werden, welche das Substrat aber kein Enzym enthalt. Noch eine andere Technik kann zusammengestellt werden, wobei die Probe und das Reagens vereinigt und während einer Zeitspanne vorinkubiert werden, noch bevor der Anfangswert abgelesen wird. Die Lösung kann dann während einer festgesetzten Zeitspanne weiter inkubiert werden, bevor der zweite Wert abgelesen wird. Dann wird die Fluoreszenz-Polarisationsantwort zwischen den zwei Zeitpunkten herangezogen.
Es sollen daher die vorstehende, eingehende Beschreibung und die nachstehenden Beispiele als veranschaulichend und nicht als einschränkend angesehen werden, und der Schutzumfang der Erfindung soll einzig und allein durch die angeschlossenen Patentansprüche, einschließlich sämtlicher Äquivalente derselben, definiert sein.

BEISPIEL 1:

Im nachstehenden Beispiel ist eine bevorzugte Verfahrensweise angeführt, um ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Herstellung eines an einen Fluorophorrest gekuppelten Substrates zu veranschaulichen. 1 g Kartoffelamylose wird in 10 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) aufgelöst. Es werden zwei Tropfen Pyridin, 700 ul Dibutylzinndilaurat und 10 mg Fluoresceinisothiocyanat (FITC) zugesetzt. Die Lösung wird während etwa 3 h auf etwa 100ºC erhitzt und abkühlen gelassen. Nach dem Abkühlen wird das markierte Substrat durch Zugabe von 100 ml Ethanol (EtOH), zum Ausfällen der Stärke, gereinigt. Das Gemisch kann weiter abgekühlt werden, um das Ausfällen zu erleichtern.Die ausgefällte Stärke wird abfiltriert und erneut in 10 ml DMSO aufgelöst, und sie wird dann erneut mit 100 ml Ethanol ausgefällt. Schließlich wird die ausgefällte Stärke filtriert, getrocknet, und das Produkt wird gelagert.
Gemäß einer derzeit bevorzugten Verfahrensweise zur Durchführung des Tests werden drei Reagentien hergestellt, welche der Einfachheit halber mit A, B und C bezeichnet werden:
A = 300 mg/ml fettsäurefreies Rinderserumalbumin;
B = 10 mg/ml mit Fluorescein markierte Amylose in 85%igem DMSO mit 0,1 M NaCl; und
C = 3,6 M NaCl.
Eine Pufferlösung, welche nachstehend als "TDx -Puffer" bezeichnet wird, enthält bei einem pH-Wert von 7,5 0,1 M Nafriumphosphatpuffer mit 0,01 % Rinder-Gammglobulin und 0,10 % Natriumazid. Bemerkt sei auch, daß bei dieser bevorzugten Ausführungsform der Test vorzugsweise auf einem Gerät für die Fluoreszenzpolarisationsanalyse (einem Fluoreszenzspektrometer) vom Typus "Abbott TDx" durchgeführt werden kann. 12,5 ul des Reagens C werden mit 25 ul des Reagens A in 962,5 ml des TDx-Puffers eingemengt. In einer Ebene polarisiertes Licht wird durch das Gemisch geführt, und die Horizontal- bzw. Vertikalintensitäten werden abgelesen. Dann werden 12,5 ul des Reagens C, zusammen mit 25 ul des Reagens B, 20 ul der Probe und weiteren 942,5 ul des TDx-Puffers zu der Lösung zugegeben, um eine Testlösung zu erhalten. Die Testlösung wird während 5 min bei 35ºC inkubieren gelassen In einer Ebene polarisiertes Licht wird durch die Lösung geführt, und die Fluoreszenzpolarisation wird gemessen. Die endgültige Polarisationsantwort wird berechnet und mit Polarisationen aus einer Kalibrationskurve verglichen.

BEISPIEL 2:

3 g Amylose ans süßen Kartoffeln wurden zu einer Lösung von annähernd 2 mg DTAF in etwa 100 ml des TDx-Puffers gegeben. Die Amylose löste sich nicht vollständig auf. Nach Zeitspannen von 5 und 30 min wurden je 20 ul entfernt und auf 1 ml verdünnt. Dann wurden 20 µl des verdünnten Gemisches in 1 ml des Puffers weiter verdünnt. Diese Lösung wurde in eine Küvette gegeben, und die Fluoreszenzintensität und die Netto-Millipolarisation wurden bei einem Verstärkungsfaktor von 5 auf dem Gerät für die Fluoreszenzpolarisationsanalyse vom Typus"Abbott TDx" abgelesen. Fünf Minuten nach dem Einleiten der Kupplungsreaktion wurde ein Anstieg der Fluoreszenzpolarisation beobachtet, was ein Kuppeln des DTAF an die Amylose anzeigt. Dann wurden 10 ul einer Lösung, welche 10 mg/ml an bakterieller Amylase enthielt, zu der Küvette hinzugefügt, welche das an die Amylose gekuppelte DTAF enthielt. Dann fiel die Polarisation wegen der Hydrolyse der Amylose zu kleinen Fragmenten sofort ab, womit das Prinzip dieser Technik demonstriert wird.

BEISPIEL 3:

Das Substrat aus Beispiel 2 wurde weiterhin durch Zugabe von etwa 100 ml EtOH und 100 ml Aceton zum Ausfällen der mit Fluorescein markierten Amylose präpariert. Dann wurde das Material in einem Büchner-Trichter, unter Verwendung von etwa 50 ml EtOH filtriert, um das freie DTAF wegzuwaschen. Die Amylose wurde getrocknet und erneut in Wasser suspendiert. Die Lösung wurde dann filtriert, um unlösliche Amylose zu entfernen.

BEISPIEL 4:

Zu 1 ml von TDx-Puffer wurden 90 ul von gesättigter NaCl-Lösung, 25 ul von Substrat aus Beispiel 3 und 25 ug der Probe zugegeben. Die Lösungen wurden vermischt und bei 35ºC inkubiert. Zu verschiedenen Zeitpunkten der Inkubation wurde die Fluoreszenzpolarisation auf dem "TDx"-Fluoreszenzspektrometer abgelesen. Die verwendeten Proben wiesen einen normalen, in Sigma-Einheiten ausgedrückten Gehalt an Enzym, bzw. einen erhöhten Gehalt daran auf. Diese Proben enthielten annähernd 1.700 bzw. 4.500 Sigma-Einheiten je Liter an Amylase. Da bei wurden die folgenden Daten erhalten: INKUBATIONSZEITPUNKTE: kein Enzym Sigma-normal Sigma-erhöht
Diese Daten zeigen, daß die Schweine-Amylase (in den Sigma-Kontrollen) das Substrat gespalten hat. BEISPIEL 5: 1 g von aus süßen Kartoffeln stammender Amylose wurde in 10 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) aufgelöst. Zu der Lösung wurden zwei Tropfen Pyridin, 700 ul Dibutylzinndilaurat und 10 mg FITC zugegeben. Nachdem die Komponenten aufgelöst waren, wurde die Lösung auf einem Wasserdampfbad von 100ºC während 3 h erhitzt. Nach dem Abkühlen wurden 100 ml Ethanol zugesetzt, um die Amylose zu fällen. Die ausgefällte Amylose wurde unter Verwendung eines Sinterglastrichters filtriert. Das nicht-umgesetzte FITC in dem Ethanolfiltrat wurde verworfen. Dann wurde die markierte Amylose erneut in DMSO aufgelöst und zwei weitere Male erneut ausgefällt.

BEISPIEL 6:

2 ml einer Lipoproteinlösung (Miles Laboratories, Inc. Code 82-018) wurden mit 2 ml DMSO vermischt. Dann wurden 40 ul einer Lösung zugesetzt, welche 100 mg/ml von FITC in DMSO enthält. Es wurden 2 Tropfen Pyridin, zusammen mit 200 ml Dibutylzinndilaurat, zugesetzt. Die Lösung wurde während 2 h auf ein Wasserdampfbad gegeben.
Nach 2 h wurden 10 ul der Lösung in 1 ml DMSO verdünnt. Diese Lösung wurde in TDx-Puffer auf 1/100 weiter verdünnt. Es wurde gefunden, daß die Millipolarisation der Lösung 183 betrug.

BEISPIEL 7:

Das mit Fluorescein markierte Lipoprotein-Substrat aus Beispiel 6 wurde in 1 ml von TDx-Puffer verdünnt, und verschiedene Konzentrationen von Lipoprotein- Lipase wurden zugesetzt. Die Lösung wurde dann bei 35ºC während 5 min inkubiert, bevor die Fluoreszenzpolarisation bestimmt wurde. Es wurde eine zu der Enzymkonzentration proportionale Abnahme in der Polarisation beobachtet. Dabei wurden die folgenden Daten erhalten: zugesetzte Lipase keine Einheiten
Es versteht sich von selbst, daß verschiedene Modifikationen und Veränderungen an den spezifischen, im Rahmen der vorliegenden Unterlagen beschriebenen Ausführungsformen der Erfindung vorgenommen werden können, ohne den Erfindungsgedanken und den Schutzumfang zu verlassen, welcher einzig und allein in den nachstehenden Patentansprüchen definiert ist.

Claims

1. Verfahren zum Bestimmen der Aktivität einer aus Amylase und Lipase ausgewählten makromolekularen Hydrolase, welches die folgenden Stufen umfaßt:

a) Herstellen einer Testlösung, welche eine Probe enthält, von welcher vermutet wird, daß sie die makromolekulare Hydrolase enthält, und welche Testlösung ein mit einem Fluorophor markiertes Substrat enthält, welches von der makromolekularen Hydrolase gespalten werden kann;

b) Inkubieren der Testlösung während einer Zeitspanne;

c) Hindurchführen von in einer Ebene polarisiertem Licht durch die Testlösung der Stufe b); und

d) Feststellen der Fluoreszenz-Polarisationsantwort aus der Stufe c) als Hinweis auf die Aktivität der makromolekularen Hydrolase in der Probe.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Substrat Amylose, Gelatine, Haemoglobin, Casein oder Lipoprotein umfaßt und an einen Fluoresceinrest gekuppelt ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Substrat an 4,6-Dichlortriazin-2- (yl)-aminofluorescein, ein Derivat von 4,6-Dichlortriazin-2-(yl)-aminofluorescein, Fluorescein-isothiocyanat oder ein Derivat von Fluorescein-isothiocyanat gekuppelt ist.