DE1598756C3

DE1598756C3 - Mittel zum Nachweis von Harnstoff in Körperflüssigkeiten

Info

Publication number: DE1598756C3
Application number: DE19651598756
Authority: DE
Inventors: Edward K. Harvill (Verstorben); William Fred Hendershot; Raymond L. Mast; Elsie June Shrawder
Original assignee: Miles Laboratories Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1964-07-20
Filing date: 1965-07-20
Publication date: 1975-12-18
Also published as: BE667092A; ES315287A1; JPS494673B1; CH465916A; FR1472956A; BR6571425D0; DE1598756B2; DE1598756A1; GB1112251A

Description

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der Ammoniumionen freigebende Puffer natürlich dere Konzentrationen für diese Zusätze einhält. Vor-

auch dazu, in dem Diagnostizierungsmittel den für zugsweise wird der Gummi mit dem Albumin in

die bekannte Urease-Reaktion erforderlichen opti- einem Gewichtsverhältnis von 2:1 kombiniert. Mit

malen pH-Werte.aufrechtzuerhalten. anderen Worten soll in dem Stabilisierungsmittel auf

Unter den verschiedenen Verbindungen, die in Lö- 5 je 2 g Gummi 1 g Albumin vorhanden sein. Gewichts-

sung Ammoniumionen abgeben und daher erfin- Verhältnisse von Gummi zu Albumin zwischen 0,5:1

dungsgemäß benutzt werden können, sind die Am- und 4:1 können ebenfalls angewendet werden,

moniumsalze von schwachen Säuren besonders be- Auch die Gesamtkonzentration des dual aufgebau-

vorzugt, z. B. Ammoniumeitrat, Ammoniumlactat, ten Farbstabilisierungsmittels, falls ein solches in die

Ammoniumbenzoat, Ammoniumacetat, Ammonium- io Zubereitungen eingearbeitet wird, muß innerhalb ge-

butyrat, Ammoniumphosphat usw. wisser Grenzen gehalten werden. Vorzugsweise ist

Zur weiteren Steigerung der Empfindlichkeit weist der Farbstabilisator in den erfindungsgemäßen Zu-

das Mittel nach der Erfindung bevorzugt einen zu- bereitungen in einer Konzentration von etwa 2%,

sätzlichen Gehalt an einem Amid als Sensibilisierungs- bezogen auf das Gesamtgewicht, anwesend, wobei

mittel auf. Geeignet sind z. B. aliphatische Amide 15 ein Konzentrationsbereich von 1 bis 4% möglich ist.

mit einem Schmelzpunkt von unterhalb etwa 150⁰C, Das Mittel nach der Erfindung kann in den ver-

1. B. die Amide gesättigter und ungesättigter ali- schiedensten Zubereitungsformen vorliegen, wie z.B.

phatischer Säuren mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen, wie auf einem saugfähigen Träger oder in lyophilisierter

unter anderem Acetamid, Propionamid, Acrylamid Form zur Anwendung als flüssiges System. Zur nähe-

und Butyramid. 20 ren Erläuterung seien im folgenden einige Ausfüh-

Die Konzentration des Sensibilisierungsmittels rungsbeispiele der Erfindung beschrieben,
kann über einen weiten Bereich variiert werden. Im „ . . j ₁
allgemeinen kann man den Sensibilisator in einer eispie
Konzentration von etwa 0,5 bis 10% und höher, be- Aus folgenden Bestandteilen wurde eine Zubereizogen auf das Gesamtgewicht der Zubereitung, ver- 25 tung hergestellt:
wenden, ohne daß die Urease denaturiert wird. Bevorzugt ist allerdings ein Konzentrationsbereich für Gelatine 0,5 g

beispielsweise Acetamid als Sensibilisator von etwa Urease 0 5 ε

In gewissen Fällen ist es zweckmäßig, wenn die bei 30 Acetamid 1,0 g

der Einwirkung von Harnstoff auf die Zubereitung 4%igesPolyäthyIenglykolM.G.4000 11,5 ml

nach der Erfindung entwickelte Färbung von solcher . ,-...,. _Ώ _α

Beschaffenheit ist, daß sie 60 Sekunden oder langer 0,1 M Ammomum-Citrat-Puffer

nach ihrem Auftreten nicht verblaßt. Zu diesem (,zweiDasiscü) zp ml

Zweck weist das Mittel nach der Erfindung bevor- 35 l,6%ige wäßrige Lösung von

/.ugt einen zusätzlichen Gehalt eines als Farbstabili- Bromthymol-Blau 3,8 ml

sator dienenden Stoffes auf. Geeignete Farbstabilisa-

loren sind unter anderem Stoffe vom Proteintyp, die Die Gelatine wurde in 11,5 ml Wasser unter Er-Albuminoideigenschaften aufweisen, wie Bovin- wärmen vollkommen aufgelöst. Die übrigen Bestandalbumin (Rinderbluteiweiß) und Eialbumin. Andere 40 teile wurden kombiniert und dann mit der Gelatine-Stoffe vom Proteintyp, die man in den Säften von lösung zu einer klaren Lösung von etwa 30° C verpflanzen und Tieren findet und die Albuminoid- mischt. Durch Zusatz einer geringen Menge verdünn-•jigenschaften aufweisen, können ebenfalls verwendet ter Natronlauge wurde der pH-Wert der Lösung auf werden. Die Konzentration an zugefügtem Albumin 6,5 eingestellt. Etwa 5 cm lange und 6 mm breite liegt im allgemeinen unter 10% und über 0,1%, be- 45 Papierstreifen wurden in die Lösung eingetaucht und zogen auf das Gesamtgewicht der Zubereitung. Be- bei 85° C getrocknet. Die trockenen Streifen wurden vorzugt ist eine Albuminkonzentration zwischen 1 dann mit einem Polymerfilm überzogen, indem sie und 5 Gewichtsprozent. ganz oder teilweise in eine l,25%ige Lösung von

Falls eine noch stärker stabilisierte Färbung ge- Äthylcellulose in Benzol eingetaucht und an der Luft

wünscht oder notwendig ist, kann ein zweiteiliges 50 getrocknet wurden bis zur völligen Verdunstung des

(duales) Stabilisationsmittel verwendet werden. Die- Benzols.

>es Farbstabilisationsmittel besteht aus zwei Haupt- Zum Vergleich wurde eine weitere Zubereitung bestandteilen, von denen einer ein Stoff vom Protein- hergestellt, deren Zusammensetzung der obigen entiyp mit Albuminoideigenschaften ist. Wie oben, gilt sprach, in der jedoch der Ammoniumeitratpuffer erauch hier, daß Bovinalalbumin, Eialbumin u. dgl. be- 55 setzt worden war durch einen Natriumeitratpuffer,
vorzugt sind, wobei jedoch auch andere Proteinstoffe, Zur Bestimmung des BUN-Spiegels wurden nun wie man sie in den Säften von Pflanzen und Tieren beide Zubereitungen auf folgende Weise benutzt:
findet, verwendet werden können. Der andere Be- Die überzogenen Enden der Streifen wurden bestandteil ist ein Heteropolysiccharid, wie beispiels- feuchtet mit einem Tropfen Blut, das eine bekannte weise Gummi arabicum (Acacia Senegal), Mesquite- 60 Harnstoffkonzentration aufwies. Nach einer 2minüti-■;ummi (Prosopsis juliflora), Damsongummi, Traga- gen Inkubationsperiode bei Raumtemperatur wurde -anthgummi (Astragalus gummifer), Indischgummi das Blut durch Abwaschen mit Wasser entfernt. Die (Anogeissus latifolia) u. dgl. Diese Gummiarten er- nun entwickelten Färbungen an beiden Streifenserien hält man gewöhnlich aus Pflanzen in Form einer dik- wurden sofort mit standardisierten Musterfärbungen ken, schleimigen, wasserlöslichen Ausscheidung. 65 verglichen, die vorher derart eingestellt worden

Es wurde gefunden, daß man eine optimale Färb- waren, daß sie der Konzentration des Blutharnstoff-

■tabilisation der diagnostischen Zubereitungen erhält, Stickstoffs bei den Blutproben entsprachen. Die Re-

•venn man gewisse Gewichtsverhältnisse und beson- sultate gehen aus Tabelle I hervor.

Tabelle I

	Konzentration	Ablesungen, auf der Farbtabelle	Natriumcitrat-
Versuch ΧΤτ·	BUN in mg°/o	in Konzentration BUN (rngVo)	Puffer
IN Γ.		Ammonium-	20
	10,0	citrat-Puffer	40
1	22,1	10	50
2	23,8	20	75
3	34,4	25	60
4	35,4	30	100
5	75,6	35	100
. 6	81,0	75	95
7	84,8	80	100
8	107,2	80	100 +
9	162,0	100
10	100+

Wie ersichtlich, erhielt man bei der Zubereitung mit Natriumeitrat als Puffer falsche Werte. Dagegen \var die Zubereitung mit Ammoniumcitrat als Puffer außerordentlich empfindlich, insbesondere in den niedrigeren Bereichen, und stimmte recht gut mit der vorbestimmten BUN-Konzentration überein.

Beispiel 2

Es wurde nach Beispiel 1 gearbeitet, wobei jedoch das als Sensibilisierungsmittel benutzte Acetamid in diesem Fall durch Acrylamid ersetzt worden war. Die Resultate entsprachen etwa denjenigen von Beispiel 1 und zeigen, daß die BUN-Konzenration in den Blutproben genau wiedergegeben wurde.

B eispiel 3

Es wurde wieder nach Beispiel 1 gearbeitet, wobei jedoch der Ammoniumeitratpuffer durch Ammoniumacetat ersetzt worden war. Die Resultate entsprachen etwa denjenigen, die sich bei Verwendung des Ammoniumcitratpuffers ergeben. In allen Fällen betrug die Abweichung von den tatsächlichen Harnstoff-Stickstoff konzentrationen weniger als 10%.

Beispiel 4

Aus den folgenden Bestandteilen wurde eine Zubereitung hergestellt:

Gelatine 0,5 g

Urease _; 0,5 g

Acetamid 1,0 g

4% Polyäthylenglykol M. G. 4000 11,5 ml

0,1 M Ammoniumcitrat-Puffer

(zweibasisch) 2,5 ml

l,6%ige wäßrige Lösung von
Bromthymol-Blau 3,8 ml

Bovin-Albumin 0,5 g

' Wie in Beispiel 1 wurde die Gelatine zunächst in 11,5 ml Wasser unter Erwärmen völlig gelöst, worauf die übrigen Bestandteile gemeinsam der Gelatinelösung zugemischt wurden, bis eine klare Lösung erreicht war, deren Temperatur etwa 30° C betrug. Die Zubereitung wurde auch hier durch Zugabe von verdünnter Natronlauge auf einen pH-Wert von etwa 6,5 eingestellt. Papierstreifen von etwa 5 X 6 cm wurden in die Lösung eingetaucht und bei 85° C an der Luft getrocknet, worauf sie mit einem Polymerfilm überzogen wurden, indem sie in eine l,25%ige Lösung von Äthylencellulose in Benzol eingetaucht und an der Luft getrocknet wurden.

Auch in diesem Fall wurde eine Vergleichszubereitung hergestellt, bei welcher bei sonst gleichen Bestandteilen das Bovinalbumin weggelassen worden war.
Die überzogenen Enden der Streifen wurden mit

ίο einem Tropfen Blut befeuchtet, das 28 mg% Harnstoff enthielt. Nach 2 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur wurde das Blut abgewaschen. Die entwickelten Färbungen wurden sofort verglichen mit Standardfärbungen, die vorher auf die in den Blutproben anwesende Stickstoffkonzentration eingestellt worden waren. Nach 60 see wurden die an' beiden Streifen entwickelten Färbungen neuerlich mit den Standardfärbungen verglichen.

Die Zubereitung mit Albumin sowohl wie diejenige ohne Albumin zeigten an, daß in dem untersuchten Blut eine Harnstoffkonzentration von 25 bis 30 mg% vorhanden war. 60 see nach der ersten Ablesung wurden die aufgetretenen Farbtöne bei beiden Zubereitungen neuerdings ausgewertet. Hierbei zeigte die albuminhaltige Aufbereitung immer noch eine Harnstoffkonzentration zwischen 20 und 25 mg°/o an, während die Färbung der Zubereitung ohne Albumin auf eine scheinbare Harnstoffkonzentration von nur 5 bis 10 mg°/o schließen ließ. Färbungs-

bestimmungen in Zeitabständen von 30 und 90 see ergaben bei der albuminhaltigen Zubereitung annähernd den gleichen Genauigkeitsgrad.

Beispiel 5

Es wurde nach Beispiel 4 gearbeitet, wobei jedoch das Sensibilisierungsmittel Acetamid durch Acrilamid und das Bovinalbumin durch Eialbumin ersetzt wurde. Die Resultate entsprachen ungefähr denjenigen des Beispiels 4.

Aus den obigen Beispielen geht deutlich hervor, daß die albuminhaltige Zubereitung ihre analytische Wirksamkeit über längere Zeit aufrechterhielt, während bei den Zubereitungen ohne Albumin bei einer verzögerten Auswertung der Färbung gewisse analytische Ungenauigkeiten auftraten.

Beispiele

Aus folgenden Bestandteilen wurde eine erfindungsgemäße Zubereitung hergestellt:
Gelatine 0,5 g

Urease (wasserlöslich) *)

(225,6 SU-Einheiten)**) 0,04 g

Acetamid 0,5 g

4% Polyäthylenglykol M. G. 4000 6,0 ml

0,1 M Ammoniumcitrat-Puffer
(zweibasisch) 1,8 ml

1,6 % wäßrige Lösung von
Bromthymol-Blau 3,8 ml

Bovin-Albumin 0,2 g

Gummiarabicum 0,4 g

*) Wasserlösliche Urease ist ein aus Bohnenmehl gewonnenes hochgereinigtes Enzym.

**) Eine »SU-Einheit« (Sumner Unit) für die Urcascaktivität ist diejenige Einheit, die aus Harnstoff in Phosphatpuffer vom pH 7,0 bei 20° C in 5 Minuten 1 mg Ammoniakstickstoff bildet.

Die Prüfflüssigkeiten wurden wie oben durch Auflösung der Gelatine in Wasser bereitet, worauf die anderen Bestandteile zugefügt wurden und der pH-Wert auf 6,5 eingestellt wurde. Wie oben wurden Papierstreifen in der Zubereitung getränkt und getrocknet. Sie erhielten auch hier wieder einen Überzug aus einem Polymerfilm, der aus einer l,25°/oigen Äthylcellülose in Benzol aufgebraucht wurde.

Zum Vergleich wurde eine zweite Zubereitung hergestellt, die der obigen entsprach, wobei jedoch die Farbstabilisatoren, Gummiarabicum und Albumin, weggelassen und die völlig wasserlösliche Urease durch eine nur teilweise wasserlösliche Urease ersetzt wurde.

Die überzogenen Enden der Streifen wurden wiederum mit einem Tropfen der Blutproben mit bekannter Harnstoffkonzentration befeuchtet. Nach einer Inkubationszeit von 1 Minute bei Raumtemperatur wurde das Blut abgewaschen und die Farbumschläge mit den standardisierten Färbungen verglichen. Ein zweiter Vergleich wurde nach Verlauf von weiteren 60 see angestellt. Die Prüfung wurde mit Blutproben von verschiedenen Harnstoffkonzentrationen mehrere Male wiederholt. Die Resultate gehen aus Tabelle II hervor.

Tabelle Π

	Be	Ablesungen auf der Farbtabelle	Zuberei	Ablesezeit: 60 see	Zuberei
	kannte	in Konzentration BUN (mg%>)	tung ohne	Zuberei	tung ohne
Versuch	Konz.	Ablesezeit: 0 see	Faibstabi-	tung mit	Farbstabi
Nr.	in mg°/o	Zuberei	lisator	Farbstabi	lisator
		tung mit	10	lisator	0
		Farbstabi	20	5	0
	13	lisator	20	10	0
11	19	10	50	25	10
12	30	20	75	30	10+
13	54	30	75	50	30
14	61	50	75
15	105	75
16	100

Die Resultate lassen die Verbesserung erkennen, die man erhalten kann, wenn man einen Farbstabilisator mit einem Gehalt an Gummiarabicum und Albumin in eine Zubereitung einarbeitet, die wasserlösliche Urease enthält. In diesen Fällen war die Färbung bei der zweiten Ablesung nach 60 see nur wenig verblaßt.

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