DD137384B1

DD137384B1 - Indikator-kapillar-roehrchen zur harnstoff-bestimmung

Info

Publication number: DD137384B1
Application number: DD20187377A
Authority: DD
Inventors: Karl-Heinz Kallies
Original assignee: Kallies Karl Heinz
Priority date: 1977-11-04
Filing date: 1977-11-04
Publication date: 1981-07-29
Also published as: SE7811419L; FR2408144A1; BG36593A1; DD137384A1; GB2007838A; US4252903A; CS222957B1; HU179400B; DE2843485A1; GB2007838B; CH635939A5; US4248973A

Description

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Titel der Erfindung;

Indikator-Kapillar-Röhrchen zur Harnst off-Bestimmung

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Indikator-Kapillar-Röhrchen zur Harnstoff-Bestimmung.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Die enzymatische Eeaktion von Harnstoff mit Urease, die zur bildung von Ammoniak und Kohlendioxid führt, ist bereits für Schnellteste beschrieben worden. Gemessen wird die durch die Ammoniak-Bildung eintretende pH-Änderung und Verfärbung von geeigneten Indikatoren. Der Nachweis erfolgt entweder in der Urease-Zone direkt durch einen gleichseitig mit eingebrachten pH-Indikator (DE-AS 1 498 601 und DE-AS 1 598 756) oder auf einem getrennt von der Urease-Zone angebrachten Indikator nach Freiwerden des Ammoniaks als Gas (DE-AS 1 245 619 und DE-AS 2 249 647).

Durch bestimmte Zusätze wird die Empfindlichkeit der Reaktion und die Farbstabilität verbessert bzw. durch eine alkalische Pufferung unter Zusatz von organischen Säuren und Stabilisierungsmitteln die Reaktionsfähigkeit und Haltbarkeit erreicht.

Die Einstellung der Indikator-Zone erfolgt mit organischen Säuren.

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Zunehmend wird die Harnstoff-Bestimmung im Vollblut im Rettungswesen, am Krankenbett oder als Serie in der Ambulanz eingesetzt. Die bisher beschriebenen und hergestellten Streifen erfordern für eine genaue Aussage, d. h. quantitative Bestimmung bzw. halbquantitative Bestimmung eine genaue Pipettierung zwischen 0,01 bis 0,1 ml. Die Streifen müssen, um sie längere Zeit verwenden zu können, im Kühlschrank gelagert werden und sind empfindlich gegen basische Bestandteile der Luft.

Die Auswertung erfordert Hilfsmittel für die Abmessung, die entweder aufgedruckt sind oder es wird eine Schablone verwendet. Die Indikator-Zone färbt sich mit einem Ubergangsbereich, der von blau über grün verwaschen angezeigt wird. Die Festlegung der Grenzlinie sowie der sich ausbildende Meniskus machen den Ungeübten bei der Auswertung unsicher.

Die Produktion von geteilten Streifen mit so vielen verschiedenen Heagenzzusätzen ist kompliziert. Um eine gute Eeproduzierbarkeit der ProduktionsChargen zu erhalten, ist ein sehr sorgfältiges Arbeiten und Einstellen der verschiedenen Bestandteile notwendig.

Da die Urease-Aktivität bereits durch Spuren bestimmter Metallionen gehemmt wird, müssen an die Chemikalien hohe Reinheitsforderungen gestellt werden.

Ziel der Erfindung

Es ist deshalb Ziel der Erfindung, ein Indikator-Röhrehen zu entwickeln, das zur Abnahme einer bemessenen Blut- oder Serumraenge am Körper und zur Gehaltsbestimmung des Harnstoffes in dem abgenommenen Blut oder Serum dienen kann und keines weiteren Hilfsmittels bedarf.

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Darlegung; des Wesens der Erfindung

Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein markiertes Kapillar-Röhrehen mit einem Indikator-Signalband zu schaffen, das die Möglichkeit der Abnahme einer bestimmten Menge einer harnstoffhaltigen Lösung mit einer raschen Anzeige bei hoher Genauigkeit vereint·

Die genannte Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß zur Eeaktionsdurchführung ein Kapillar-Röhrehen aus Glas oder Kunststoff dient.

Das Kapillar-Röhrchen ist am unteren Ende mit einer farbigen Markierung versehen, bis zu der Blut oder Serum für die Prüfung aufzunehmen ist.

Die Markierung richtet sich nach der aufzunehmenden Flussigkeitsmenge und wird bestimmt durch den Innendurchmesser des Kapillar-Röhrchens, das verwendete Trägermaterial und die Länge der Reaktionszone des Indikatorstreifens. Das Kapillar-Röhrchen mit einer Länge von 40 bis 120 mm, vorzugsweise 60 mm, kann mit einem gleichbleibenden Innendurchmesser von 1 bis 3 cim, vorzugsweise 2,5 mm, ausgeführt sein. Es kann aber auch oberhalb der Markierung einen erweiterten Reaktionsraum durch teilweise Vergrößerung des Innendurchmessers auf bis zu 10 mm. aufweisen.

Im Inneren des Kapillar-Röhrchens befindet sich ein Indikator-Signalband, auf dem hinter der Reaktionszone eine oder im Wechsel mehrere Indikator-Lösungen als Signalzonen in Streifen nebeneinander mit einer Breite von 1 bis 5 mm, vorzugsweise 2 mm, so aufgetragen sind, daß Zwischenräume von 1 bis 10 mm zwischen den Indikator-Signalzonen verbleiben, die unbehandelt sind.

Das Indikator-Signalband für das Kapillar-Röhrchen kann aus unterschiedlichem Trägermaterial aus natürlichen oder synthetischen Fasern hergestellt sein, vorausgesetzt, daß

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das Trägermaterial keinen Einfluß auf die Reaktion hat und ausreichend saugfähig ist.

Vorzugsweise wird filterpapier mit einem Gewicht von 60

bis 400 g/m verwendet. Die Einteilung des Indikator-Signalbandes in Reaktionszone und Indikator—Signalzone richtet sich nach der Papierstärke und der aufgetragenen Enzymaktivität.

Durch die Verwendung eines Kapillar-Röhrchens ist eine ausreichende Dosierung, z. B. von 10 bis 30^uI Serum oder Blut auch durch ungeübte Kräfte oder Laien möglich. Die Bestimmung ist durch das Kapillar-Röhrchen ohne jedes weitere Hilfsmittel am Krankenbett ausführbar. Die äußeren Einflüsse, z. B. durch alkalische Luft auf den Indikator sind durch den Schutz im Kapillar-Röhrchen nur unter extremen Bedingungen möglich.

Das Kapillar-Röhrchen schafft gleichbleibende Reaktionsbedingungen, die zu einer gesteuerten Gas-Entwicklung und Diffusion führen.

Da die Gasentwicklung nicht linear mit der Harnstoffmenge verläuft, sind die Indikator-Signalzonen entweder so ausgeführt, daß sie dem Verlauf entsprechen oder jede Zone wird entweder durch einen anderen geeigneten Indikator oder Zusätze einer organischen Säure so eingestellt, daß dieser Umstand berücksichtigt wird. Die Reaktion verläuft so, daß bereits die unterste Grenze im physiologischen Bereich mit erfaßt wird und so immer eine Kontrolle der Wirksamkeit der Kapillar-Röhrchen und des Indikator-Signalbandes gegeben ist.

Durch die Aufteilung der Indikator-Zone in Signal-Zonen aus verschiedenen Streifen wird die Auswertung für ungeübte Kräfte verbessert.

Eine Markierung der Indikator-Signalzonen mit verschiedenen, abwechselnd aufgetragenen Indikatoren gibt einen besseren Farbkontrast, erleichtert die Auswertung und macht diese präziser.

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Der Indikatorstreifen zeichnet sich weiterhin dadurch aus, daß das zur Harnstoff-Bestimmung in der Reaktionszone befindliche Urease-Präparat einen Zusatz eines Monosaccharides von 1 bis 15 %t vorzugsweise Glukose, enthält.

Nicht hochgereinigte Urease-Präparate, z. B. Rohurease entsprechend 'Worthington Enzymes for Research¹, Preislisten 1967, Seite 17 bzw. 1970, Seite 20 (Worthington Biochemical Corporation, Freehold, New Jersey, U.S.A.), in denen drei Qualitäten angegeben werden, eine höchste mit I5OO bis 2000 units per mg, eine mittlere mit 120 units per mg und eine Rohurease mit 50 units per mg, die unseren Ansprüchen genügt, führen beim Auftragen auf einen saugfähigen Träger zu einer Hydrophobierung, so daß die Eeaktionszone das Serum oder Blut nicht schnell genug aufsaugen kann. Der Zusatz von Monosaccharideη beseitigt diesen Mißstand und wirkt sich gleichzeitig auf die Beständigkeit der Snzymaktivität bei der Lagerung unter ITonnalbedingungen stabilisierend aus. Eine Aufbewahrung im Kühlschrank kann entfallen.

Der Indikatorstreifen zeichnet sich auch dadurch aus, daß die Eeaktionszone keine Pufferung, keinen Zusatz von Alkalikarbonat und/oder Alkalihydroxid und eine nicht hochgereinigte Urease enthält.

Damit kann eine Verkürzung der Reaktionszeit ohne Einschränkung der Genauigkeit erreicht werden.

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Ausführungsbeispiel

Die Erfindung soll in mehreren Ausfuhrungsbeispielen näher erläutert v/erden.

In der dazugehörigen Zeichnung zeigen:

Fig. 1: ein Indikator-Röhrchen mit gleichbleibendem Innendurchmesser des Kapillar-Röhrchens,

Fig. 2, 3* ein Indikator-Röhrehen mit teilweise vergrößertem Innendurchmesser des Kapillar-Röhrchens.

Beispiel 1

Für das in Figur 1 dargestellte Kapillar-Röhrchen wird eine Kapillare aus Kunststoff mit einem Innendurchmesser von 2,5 nm und einer Länge von 60 nm gewählt, die eine Llarkierung 2 bei 4 кт besitzt. Für das Indikator-Signalband 3

ρ wird ein Filterkarton mit einem Flächengewicht von 200 g/m gewählt.

Die Reaktionszone 4 wird wie folgt imprägniert:

Urease, nicht hochgereinigt 100 mg

Glukose s. A. 1 g

Aqua dest. 10 ml.

Eine 20 mm breite Kante des Filterkartons wird mit dieser Lösung getränkt. Gleichzeitig wird anschließend an dieses Reaktionssintern 4 ein 4 mm breiter Streifen einer 20 %igen Lösung von Stearinsäure in Tetrachlorkohlenstoff gezogen. Diese Hydrophobierungszone verhindert das Eindringen der Untersuchungsflüssigkeit in die Indikator-Signalaonen 5· Sie kann unterschiedlich mit den bekannten Hydrophobierungsmitteln für Textilien oder Papier ausgeführt sein und in ihrer Breite zwischen 2 und 5 ^m schwanken. Gleichzeitig mit der Urease-Lösung und der EydrophobierungslÖsung werden die Indikator-Signalzonen 5 oberhalb der Hydrophobierungszone gemäß den Beispielen 2 bis 4 aufgetragen. Ihre Anordnung richtet sich danach, ob eine halbquantitative oder quantitative Bestimmung durchgeführt werden soll.

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Der so vorbereitete Filterkarton wird in schmale Indikator-Signalbänder 3 geschnitten. Jeweils ein Indikator-Signalband 3 wird in ein Kapillar-Röbrchen 1 eingeschoben. Soll eine Prüfung auf Harnstoff erfolgen, so wird das Indikator-Signalband 3 etwa 10 mm über die Markierung 2 hochgezogen. Das markierte Ende des Kapillar-Röhrchens 1 wird in die zu untersuchende Flüssigkeit getaucht. Ist die Füllung versehentlich über die Markierung 2 erfolgt, so wird mit einem Filterpapierstreifen vorsichtig die überschüssige Flüssigkeitsmenge abgesaugt und so leicht und genau eingestellt.

Durch Zurückschieben des Indikator-Signalbandes 3 an die Markierung 2 wird die Bestimmung eingeleitet. Die Reaktion wird bei 25 ⁰C durchgeführt und nach 15 Minuten ausgewertet.

Beispiel 2

Brilliant-gelb 10 mg Äthanol 10 ml

Die Indikator-Lösung wird in 2 bis 3 nim breiten Streifen oberhalb der Hydrophobierungszone so aufgetragen, daß immer ein 1 bis 2 mm breiter Zwischenraum verbleibt. Mit diesem Indikator-Signalband 3» das 5 Indikator-Signalzonen 5 enthält, wird die Bestimmung in der unter Beispiel 1 beschriebenen Kapillare 1 mit Blut oder Serum bei 25 ⁰C durchgeführt und nach 15 Minuten die Auswertung vorgenommen. Eine erste Einschätzung höherer Konzentrationen kann nach 5 Minuten erfolgen. Jede Indikator-Signalzone 5 entspricht je nach eingestellter Breite und dem eingestellten Zwischenraum einer bestimmten Menge Harnstoff. Die Werte dazu werden von einer mitgegebenen Tabelle abgelesen oder können auf dem Streifen bzw. der Kapillare aufgedruckt sein.

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Beispiel 3

Als Kapillar-Rährchen 1 wird eine Kapillare gemäß Beispiel

1 verwendet.

Lösung a) Bromkresolgrün 40 mg

Weinsäure 100 mg

Äthanol 10 ml

Lösung b) Brilliant-gelb 40 mg

Äthanol 10 ml

Die so hergestellten Indikator-Lösungen werden oberhalb der Hydrophobierungszone in folgender Anordnung aufgetragen:

1. Indikator-Signalzone Lösung a) 2 bis 3 ^n breit Zwischenraum 1 mm

2. Indikator-Signalzone Lösung b) Zwischenraum 1 mm

3· Indikator-Signalzone Lösung a)

Zwischenraum 2 mm 4. Indikator-Signalzone Lösung a)

Zwischenraum 3 илі 5· Indikator-Signalzone Lösung a)

Die Zwischenräume б können ebenso wie die Breite der Indikator-Signalzonen 5 auch anders gewählt werden. Je nach ihrer Einstellung sind die Werte auf der Kapillare 1 oder auf dem. Indikator-Signalband 3 bzw. der Ablese-Tabelle entsprechend anzugeben.

Die Verwendung eines nach rot umschlagenden Indikators für die 2. Indikator-Signalzone soll den Beginn erhöhter Harnstoff-Stickstoff-Werte signalisieren. Die Reaktion wird bei 25 ⁰C durchgeführt und nach 15 Minuten ausgewertet.

2	bis	3	yum breit
2	bis	3	τη τη breit
2	bis	3	•mm breit
2	bis	3	mm breit

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Beispiel 4

BroEkresolgrün 30 mg Weinsäure 60 mg Äthanol 10 ml

Die in bekannter Weise hergestellte Indikator-Lösung wird in Signalzonen 5 "von 1 bis 3 ^m. Breite in unterschiedlichen Abständen oberhalb der Hydrophobierungszone aufgetragen. Der Zwischenraum 6 und die Zahl der Indikator-Signalzonen 5 bestimmen die Genauigkeit und die bestimmbare Menge. Wird zwischen der 1. und 2. Signalzone ein Abstand von 1 mm, zwischen der 2. und 3· ein Abstand von 2 mm und zwischen der 3· und 4-. ein Abstand von 4 mm eingestellt, so zeigt beispielsweise die 1. Signalzone bis 20 mg Harnstoff/Stickstoff an. Die 2. Signalzone zeigt 3° ^g Harnstoff/Stickstoff, die 3· Signalzone 45 mg Harnstoff/Stickstoff und die 4. Signalzone 60 mg Harnstoff/Stickstoff an.

Verwendet wird gemäß Pigur 2 eine Kapillare mit erweitertem Keaktionsraum 7» die im Bereich der Markierung 10 mm lang ist und einen Innendurchmesser von 2,5 ша besitzt· Daran schließt sich ein 30 mm langes, erweitertes Stück von 7 Innendurchmesser an und es folgt ein 20 mm langes Stück Kapillare von 2,5 cm Innendurchmesser. Die Reaktionszeit verkürzt sich auf 7 Minuten.

Claims

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Erfindungsanspruch

1· Indikator-Kapillar-Röhrchen zur Harnstoff-Bestimmung mittels Urease, auf dessen Indikator-Signalband eine oder mehrere streifenförmige Indikator-Signalzonen angeordnet sind, wovon ein Indikator ein im alkalischen Bereich umschlagender Farbstoff ist, gekennzeichnet dadurch, daß auf einem in einem als Pipette ausgebildeten Kapillar-Röhrchen (1) befindlichen Indikator-Signalband (3) ein Teil mit einem ungepufferten, alkalikarbonat- und/oder alkalihydroxidfreiem ßeaktionssystem (4) mit nicht hochgereinigter Urease und 1 bis 15 % eines Monosaccharides angeordnet ist und die Zwischenräume (6) der Indikatorzonen 1 bis 10 mm breit sind.

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