DD143662A5 - Diagnostisches mittel zur bestimmung von ammoniak oder unter bildung von ammoniak reagierenden substraten - Google Patents
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Description
-Λ-
Anwendungsgebiet ,der Erfindung .
Die Erfindung betrifft ein diagnostisches Mittel zur Bestimmung von Ammoniak oder unter Bildung von Ammoniak reagierenden Substraten«,
Das erfindungsgemäße Mittel wird angewandt in der medizinischen Diagnostik zur Bestimmung von Harnstoff in Körperflüssigkeitene
Charakteristik der bekannten technischen Lösungen
Die Bestimmung des Harnstoffs in Körperflüssigkeiten ist von großer Wichtigkeit für die Diagnose und Verlaufskontrolle von Erkrankungen der liiere· Schon seit längerer Zeit stehen dafür eine Reihe vofr naßehemischen Analysenverfahren zur Verfugung, die auf folgenden Prinzipien beruhen: Bei einer direkten Methode wird Harnstoff mit Diacetylmonoizim umgesetzt und die Absorption der neu entstandenen Verbindung photometrisch gemessen· Andere, moderne Methoden schalten vor die Farbreaktion einen enzymatischen Schritt und zersetzen mittels des Enzyms Urease den Harnstoff zu Ammoniumcarbonat. Das Ammoniak wird anschließend ζ·Β. in der bekannten Ueßlerschen Farbreaktion umgesetzt oder nach Berthelot mit Phenol/ Hypochlorit in ein gefärbtes Indophenol überführt· Die Extinktion der jeweils entstandenen farbigen Reaktionsprodukte ist schließlich das Maß für die ursprünglich vorhandene Harnstoffmenge«
Diese Verfahren sind an sich von hinreichender Genauigkeit, erfordern jedoch teure Photometer und geschultes Personal mit ausreichender Erfahrung bei exakten Pipettieren und Umgang mit zum Teil wenig haltbaren und ätzenden Reagenzien« Da diese Verfahren nicht für Vollblut angewandt werden können, sind zusätzliche Laboreinriclitungen zur Gewinnung von Serum bzwe Plasma nötig« · .
E «κ»
Besonders in Notfällen, z.B. bei einem urämischen Koma, ist es für die einzuleitenden therapeutischen Maßnahmen unerläßlich, in kürzester Zeit ein möglichst genaues Analysenergebnis zu erhalten. Deshalb fehlte es nicht an umfangreichen Bemühungen., auch für die Bestimmung von Harnstoff in Körperflüssigkeiten Methoden zu entwickeln, die es ermöglichen, innerhalb kürzester Zeit ein diagnostisch gut verwertbares Analysenergebnis zu bekommen.
Wegen der Einfachheit der Handhabung, der zum Teil kürzeren Reaktionszeit, der Anwendbarkeit am Krankenbett und im Notfall und der Benutzung durch uhgeschultes Personal oder den Patienten selbst haben sich daher in neuerer Zeit Schnellteste in Form von Teststreifen durchgesetzt.
Ein Schnelltest zur Bestimmung von Harnstoff in Körperflüssigkeiten wie Blut, Serum und Plasma wird in der DE-AS 12 40 306 beschrieben. Hierbei sind Urease, pH-Indikator, Puffer und Hilfsstoffe zusammen auf ein Papier imprägniert. Bei Auftropfen einer Körperflüssigkeit wird der darin enthaltene neutral ·. reagierende Harnstoff in alkalisch reagierendes Ammoniumcarbop.at gespalten. Die pH-Änderung wird durch eine Farbänderung des pH-Indikators angezeigt, der Harnstoffgehalt der Probe kann durch Vergleich mit Vergleichsfarben geschätzt werden. Trotz einiger Vorzüge - wie einfacher Handhabung und kurzer Reaktionszeit - ist dieser Teststreifen wegen seiner nur schwer unterscheidbaren Reaktionsfarben und wegen des deutlichen Einflusses des Säure-Basen-Haushalts der Körperflüssigkeit -ß.]if die Reaktionsfarbe nur für orientierende Schätzungen brauchbar.
If
Das Problem der Abhängigkeit vom Säure-Basen-Haushalt der Körperflüssigkeit wurde mit einem in der DE-AS 12 45 619 beschriebenen Teststreifen gelöst, bei dem ein saugfähiger Papierstreifen nebeneinander mit drei unterschiedlichen Lösungen imprägniert ist. Bei diesem Teststreifen wird die harnstoffhaltige Lösung zunächst in einem ureasehaltigen Testbezirk aufgesaugt und der Harnstoff darin in Ammoniumcarbonat umgesetzt. Durch Kapillarkräfte wird die Lösung dann in einen benachbarten alkalischen Testbezirk überführt, der aus den Ammoniumcarbonat gasförmiges Ammoniak freisetzt, das über den den Teststreifen umgebenden Gasraum auf einen dritten Testbezirk übertritt und den darauf befindlichen pH-Indikator entsprechend der Konzentration des Harnstoffs verfärbt.' Durch eine etwa 2 mm breite hydrophobe Zone zwischen dem zweiten und dritten Testbezirk wird ein übertreten der alkalischen Lösung verhindert.· Da so nur gasförmiger Ammoniak auf das dritte Testfeld übertritt, stören andere Basen oder Säuren nicht. Weiterhin kann durch Pufferung das erste Testfeld auf einen für die Urease optimalen pH-Wert eingestellt werden, solange die Alkalisierung auf dem zweiten Testbezirk ausreicht, um das Ammoniak quantitativ freizusetzen.
Trotz diagnostisch gut verwertbarer Ergebnisse besitzt dieser Teststreifen eine Reihe von Nachteilen. Die Bestimmung kann nur mit Serum oder Plasma, nicht jedoch mit Blut durchgeführt werden, da die Blutkörperchen die Chromatographie stören. Das setzt ein Zentrifugieren des Blutes voraus, d.h. die benötigte Probenmenge ist groß und kann nur vom Arzt oder entsprechend gut geschultem Personal gewonnen werden. Um die Überführung des Ammoniaks durch den Gas"raum reproduzierbar zu machen, ΐημβ weiterhin der Teststreifen in eine spezielle Reaktionskammer gehängt und relativ zur Probe während der Reaktionszeit genau fixiert sein. Für die Chromatographie in den Testbezirken 1 und 2 und insbesondere für die Diffusion des Ammoniaks durch den Gasraum ist eine Reaktionszeit von 30 Minuten erforderlich, weshalb dieser Teststreifen kaum noch als Schnelltest zu bezeichnen ist.
In der DE-AS 22 49 647 wird ein ähnlich aufgebauter Teststreifen beschrieben, der einige konstruktive Verbesserungen aufweist. Es können damit auch Bestimmungen in Vollblut vorgenommen· werden. Auch dieser Teststreifen erfordert jedoch im Normalfall eine Reaktionszeit von 30 Minuten und benötigt eine Reaktionskammer. '
Ein weiter Nachteil der beiden obengenannten Teststreifen liegt darin, daß die Konzentration des Harnstoffs durch eine visuelle Längenmessung der umgeschlagenen Zone des Indikatorpapiers mit seiner schwer zu beurteilenden, undeutlichen Grenzzone erfolgt und nicht durch die visuelle oder präzise Messung der Farbtiefe mit einem Remissionsphotometer vorgenommen werden kann.
In der DE-OS 26 26 367 wird eine Vorrichtung mit mehreren übereinanderliegenden Schichten beschrieben. Zum Nachweis von Harnstoff bestehen diese aus einer urease- und einen alkalischen Puffer enthaltenden Schicht und einer gasförmiges Ammoniak nachweisenden Indikatorschicht. Um zu verhindern, daß von der Ureaseschicht außer dem gasförmigen Ammoniak uner- * wünschterweise auch Probenflüssigkeit zur Indikatorzone diffundiert,-werden die Ureaseschicht und die darunter befindliche Indikatorschicht durch einen hydrophoben, gasdurchlässigen Film getrennt oder die Indikatorschicht als hydrophober Film gestaltet. Die je nach Harnstoffgehalt der Probe unterschiedlich intensiv gefärbte Indikatorschicht wird remissionsphotometrisch durch die Trägerfolie vermessen und so die Konzentration des Harnstoffs bestimmt.
Um zu Reaktionszeiten von etwa 10 Minuten zu gelangen, muß diese Testvorrichtung wegen der relativ hohen Undurchlässigkeit der Trennschicht bei 40 - 50°C inkubiert werden. Wegen des damit verbundenen apparativen Aufwandes ist der Einsatz dieser Testvorrichtung als .Schnelltest nicht möglich.
' · -5- . 3*10.1979
AP G 01 1/212 892 . (55 422/11)
Alle bisher bekannten Teststreifen zur Bestimmung.von Harnstoff weisen also noch wesentliche-Mangel auf© .
Ziel der Erfindung
Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines diagnosti-sehen Mittels, insbesondere für die Bestimmung von Harnstoff in Körperflüssigkeiten, mit dem innerhalb kurzer Zeit sehr genaue Ergebnisse erzielt werden können·
Darlegung des Wesens der Erfindung
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, für den Nachweis von Harnstoff in Körperflüssigkeiten einen Teststreifen zu entwickeln, der : ' .
- einfach, in der Handhabung ist und ohne zusätzliche Reaktionskammern auskommt,
- eine Harnstoffbestimmung nicht nur in Serum bzw« Plasma,, sondern auch in geringen Mengen Vollblut erlaubt,
- bei Raumtemperatur eine Reaktionszeit von höchstens 10, . vorzugsweise etwa 5 Minuten benötigt,
~ bei visueller Beurteilung semiquantitative Ergebnisse liefert,
- bei remissionsphotometrischer Auswertung eine quantitative Harnstoffbestimmung ermöglicht.
-6- . 3.10.1979
AP G 01 M/212 892 (55 422/11)
Diese Aufgabe wird gelöst durch die Bereitstellung eines diagnostischen Mittels zur Bestimmung von Ammoniak oder unter Bildung von Ammoniak reagierenden Substraten bestehend aus einem Handgriff, einer darauf befestigten Indikatorschicht für gasförmiges Ammoniak und einer alkalischen Puffer enthaltenden Reaktionsschicht, die gegebenenfalls zusätzlich mit dem Substrat unter Bildung von Ammoniak reagierende Reagenzien enthält, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die Indikatorschicht fest mit dem
Handgriff verbunden und darüber die Reaktionsschicht mittels eines Abstandshalters in einem Abstand von 10 - 200/u angeordnet ist und daß Abstandshalter und Reaktionsschicht leicht von der Indikatorschicht abgelöst werden können.
Erfindungsgemäß ist der Abstandshalter' ein gewebtes oder gewirktes Wetz oder eine Lochfolie mit einer Dicke von 10 — 200 ^u und einer freien Lochfläche von mindestens 25 %. ' ·
Die Reaktionsschicht ist erfindungsgemäß durch eine hydrophile, flüssigkeitsdurchlässige Abdeckschicht, vorzugsweise durch ein gewebtes oder gewirktes Hetz auf dem Handgriff befestigt. Die Reaktionsschicht enthält vorzugsweise zusätzlich Hetzmittel oder Stabilisatoren* Der Handgriff besteht aus einer Kunststoffolie»
Darüber hinaus lassen sich mit nach diesem Prinzip arbeitenden Teststreifen jedoch auch Ammoniak selbst sowie Ammoniaksalze und unter Bildung von -Ammoniak reagierende Substrate nachweisen und,mengenmäßig bestimmen, indem'statt der Urease mit dem jeweiligen Substrat unter Bildung von Ammoniak reagierende Reagenzien eingesetzt werden. Beispielhaft seien folgende Substrat/Reagenz-Kombinatioiien genannt:
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AP G 01 N/212 892 (55 4 22/11)
Harnstoff/Urease
Creatinin/Creatinindeiminase
AminosäureAiminosäure-Dehydrogenase
Aminosäure/Aminosaure/Oxydase
Aminosäure/Aminosäure-Dehydratase
Aminosäure/Ammonia-Lyase
Amin/Amin-Oxydas e
Diamin/Amin-Oxydase
Glucose/Phosphoramidathexosephosphortransferase und Phosphoramidat
ADP/Carbamatkinase und Carbamoylpliosphat Säur earnid/Amidohy dr ο las e
Nucleobase/Deaminase
Uucleosid/Deaminase .
Nucleotid/Deaminase
ic
Die Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß eine Ammoniak bildende und gleichzeitig Ammoniak austreibende Reaktionsschicht in einem kleinen aber exakt reproduzierbaren Abstand über einer Indikatorschicht fixiert wird, ohne daß die freie Diffusion des Ammoniaks durch Filme, Schichten uoä, behindert wird· Freie Diffusion und kleiner Abstand sind Voraussetzungen für eine kurze Reaktionszeito Nur mit einem auch bei technischer Fertigung exakt reproduzierbaren Abstand beider Schichten kann ein solcher Teststreifen quantitativen Anforderungen genügen*
Zum Nachweis von Ammoniak oder unter Bildung von Ammoniak reagierenden Substraten in wässrigen Lösungen v/ird erfindungsgemäß in der Weise verfahren, daß man die Reaktionsschicht des beschriebenen diagnostischen Mittels mit einem Tropfen Ammoniak oder der unter Bildung von Ammoniak
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AP G 01 N/212 892 (55 .422/11)
reagierenden Substrate tränkt, die Freisetzung von Ammoniak abwartet, die Indikatorschicht durch Abziehen der Reaktionsschicht und der Abstandsschicht freilegt und ihre Verfärbung visuell oder photometrisch bestimmt.
Insbesondere wird derart verfahren, daß man die Reaktionsschicht mit einem Tropfen der harnstoffhaltigen oder der creatinhaltigen Losung tränkt, mit einem Tropfen der
ι harnstoffhaltigen Lösung tränkt, die Freisetzung von Ammoniak abwartet, die Indikatorschicht durch Abziehen der Reaktionsschicht und der Abstandsschicht freilegt und ihre Verfärbung visuell oder photometrisch bestimmt.
Brfindungsgemäß ist die Reaktionsschicht während der Reaktion mit einer Abdeckschicht verschlossen,,
Ausf ührungsb* ei spiel
Die Erfindung wird nachstehend an einem Ausführungsbeispiel näher erläutert. In der beiliegenden Zeichnung zeigt Abb0 1 das erfindungsgemäße diagnostische Mittel,
Wie in Abb0 1 gezeigt, enthält der Teststreifen eine Indikatorschicht 1, die vorzugsweise aus einem saugfähigen Träger, z«B* Papier, einem porösen Kunststoff etc» besteht und ein Reagenzgemisch enthalt, dessen remissionsphotometrische Eigenschaften sich bei Einwirkung von Aimnoriiakgas in Abhängigkeit von der Arnrnonialanenge abgestuft ändernd Vorzugsweise enthält die Indikatorschicht einen geeigneten pH-Indikator, bevorzugt aus der Reihe der Tetranitrodiphenylmethyl-pyridine (gemäß der gleichzeitig eingereichten Patentanmeldung AP C 07 D/212 893) und einen Puffer wie z,B, Citrat-, Tartrat- und Malonat-Puffer, aber auch polymere Puffer wie
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- AP G 01 N/212 892 (55 422/11)
z.B. Polyacrylate oder Polymethacrylate bzv/. deren Copolymere oder andere carboxylgruppenhaltige Polymere„
Über die Indikatorschicht 1 wird ein Abstandshalter 2 gelegt, bestehend aus einer Schicht, die sich sowohl durch eine konstante Dicke von ca. 10 - 200/u als auch durch eine konstant offene Lochfläche von mindestens 25 % auszeichnet. Sie kann aus hydrophobieren gewebten oder gewirkten .Netzen oder Lochfolien bestehen, die die vorstehenden Forderungen erfüllen. Vorzugsweise wird ein hydrophobiertes Gewebe verwendet. Solche Netze sind beispielsweise als Siebdruckgewebe oder Müllergaze bekannt.
Als Lochfolie kann eine Folie mit vielen relativ kleinen Löchern gewählt v/erden, die dann praktisch'den gewebten Netzen entspricht, es kann Jedoch auch eine Folie verwendet werden, die nur ein großes Loch genau über der Mitte des Testbezirks aufweist0
Über dem Abstandshalter 2 befindet sich die Reaktionsschicht 3» die vorzugsweise aus einem saugfähigen Träger, z.Be Papier, besteht. Sie enthält die Ammoniak bildenden Reagenzien, einen alkalischen Puffer, z.B. Ethylendiaminotetraacetat (EDTA), Tris(hydroxymethyl)aminomethan (TRIS) oder Phosphat, vom pH 7 - 9,5, vorzugsweise TRIS-Puffer pH 8,5 und Hilfsstoffe, ü.B. Netzmittel und Stabilisatoren«
Die Reaktionsschicht wird vorzugsweise mit einem Netzwerk 4 (Gewebe, Gewirke o.äo) gemäß DE-AS 21 18 455 festgehalten, kann jedoch auch in üblicherweise auf dem Abstandshalter festgeklebt oder angesiegelt sein.
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AP G 01 K/212 892 (55 422/11)
Indikatorschicht 1, xYbstandshalter 2 und Reaktionsschicht 3 werden mit dem Netzwerk 4 abgedeckt und auf das Ende einer mit Schmelzkleber beschichteten Folie 5 als Handgriff gesiegelt.
Zur Substratbestimmung wird die Reaktionsschicht mit einem Tropfen Testflüssigkeit gefüllt. Um ein Entweichen des Ammoniaks nach oben zu verhindern, kann die Oberseite der Reaktionsschicht zweckmäßigerweise mit einer Abdeckschicht, beispielsweise einem Klebeetikett o.a. verschlossen werden.
Nach einer Reaktionszeit von 2-10 Minuten, normalerweise 5-7 Minuten, werden Reaktionsschicht und Abstandsha.lter abgezogen. Die Färbung der dadurch freigegebenen Indikatorschicht wird quantitativ mit einem Remissionsphotometer gemessen oder semiquantitativ durch visuellen Vergleich mti Vergleichsfarben bestimmt.
Die vorliegende Erfindung wird in den folgenden Beispielen weiterhin erläutert.
a) üreasepapier
Filterpapier wird mit einer Lösung folgender Zusammensetzung getränkt, getrocknet und in 6 mm breite Bänder zerschnitten.
Urease (5 U/mg) . 6g
Dithioerythrit 0,1 g 0,3 jm TRIS.HCl-Puffer
pH 8|,5 100 ml
b) Indikatorpapier
Filterpapier wird mit einer Lösung folgender Zusammensetzung getränkt, getrocknet und ebenfalls in 6 mm breite Streifen geschnitten.
'ifc
N-(Bis-(2,4-dinitrophenyl)-methyl)-
4-t.butyl-pyridiniumchlorid 0,39 g
Ethylenglykolmonomethylether 42 ml
0,25 m Na-Malonat-Puffer pH 2,8 48 ml
c) Abstandshalter
Mit Silikonharz hydrophobiertes Siebdruckgewebe von ca. 100 ,u Fadendicke und mit einer offenen Siebfläche von 35 % wird in 25 - 40 mm breite Bänder geschnitten.
d) Abdecknetz
Hydrophiles Nylonnetz von ca. 60 ,u Dicke, Fadenstärke ' 40 /U, freie Lochfläche ca. 65 % wird in 15 nun breite; Bänder geschnitten.
e) Folie
Als Trägerfolie und Handgriff wird ein 60 - 100 mm breites, ca. 0,2 - 0,3 mm dickes Band aus schmelzkleberbeschichteter Polyesterfolie verwendet.
Ureasepapier (3), Indikatorpapier (1) und Abstandshalter (2) werden zusammen mit einem das ureasepapier abdeckenden Netz (4) wie in Abb. 1 gezeigt auf das Ende der mit Schmelzkleber beschichteten 6 - 10 cm breiten Folie .(5) gesiegelt und das entstehende Band in 6 mm breite Streifen" geschnitten,' so daß. 6 χ 6 mm-Testbezirke an einem 6 - 10 cm langen Handgriff entstehen. *
Ein solcher Streifen wird auf das Abdecknetz mit 10 ,ul Serum betropft und mit einem Klebeetikett verschlossen. Nach einer Reaktionszeit von 7 Minuten werden Ureasepapier. und Abdecknetz zusammen mit der Trennschicht entfernt. Die Verfärbung der Indikatorschicht wird von oben mit einem Remissionsphotometer vermessen. In Abhängigkeit von der Harnstoffkonzentration werden folgende Meßwerte erhalten:
mg Harnstoff/ ' Meßsignal (Skalenteile) + 1 s ml Serum Mittelwert aus 10 Werten
20 12,9 + 0,75
AO 27,5 + 1,5
60 46>1 + 1,9
80 61,5 + 1,4
100 69,0+0,4
150 77,2 + 0,5
200 V 79,4 + 0,5'
a) üreasepapier siehe Beispiel 1
b) Indikatorpapier
Filterpapier wird mit einer Lösung folgender Zusammensetzung getränkt und getrocknet :
N-(Bis-(2,4-dinitrophenyl)-methyl)-4r-t.butyl-pyridiniumchlorid 0,44 g
Ethylenglykolmonomethylether . 40 ml Polyacrylat (Acrytex SL 865R der Firma Röhm) . 6g Wasser · 60 ml
c) Abstandshalter
20 ,u dicke Polypropylenfolie mit 35 - 45 % offener Lochfläche
d) Abdecknetz siehe Beispiel 1
e) Folie . ' siehe Beispiel 1 -
Verarbeitung und Harnstoffbestimmung werden wie in Beispiel 1 durchgeführt (jedoch unter Verwendung von AEDTA-Blutplasmen), wobei folgende Meßwerte erhalten werden:
mg Harnstoff/ Meßsignal (Skalenteile) + 1 s 100 ml Plasma Mittelwerte aus 10 Werten '-
20 11,6'+ 0,6
40 23,0 +1,3
60 41,2 + 1,9
80 56,7+1,5
100 66,4 + 0,5
150 75,3+0,5
200 78,2 +0,4
Semiguant'itativer Nachweis von Harnstoff in Blut a ^ Ureasepapier "' ·
siehe Beispiel 1
b) Indikatorpapier
Filterpapier wird mit einer Lösung folgender Zusammensetzung getränkt und bei 70 C getrocknet
Bromphenolblau | 0,1 g |
Ethylenglykolmono- | |
methylether | 9 ml |
Weinsäure | 0,4 g |
Wasser | 21 ml |
Abstandshalter |
Mit Silikonharz hydrophob ausgerüstetes Polyamidvlies, Dicke ca. 80 ,u
d) Abdecknetz
siehe Beispiel 1 ·
Verarbeitung siehe Beispiel 1. „
Zur Harnstoffbestimmung in Vollblut wird mit einem Tropfen Blut betropft. Nach einer Reaktionszeit von 7 Minuten entstehen je nach Harnstoffgehalt visuell gut unters.cheidbare Reaktionsfarben:
20 mg Harnstoff/100 ml Blut gelb
40 mg Harnstoff/100 ml Blut grünlich-gelb
60 mg Harnstoff/100 ml Blut gelbgrün
• 80 mg Harnstoff/100 ml Blut grün
mg Harnstoff/100 ml Blut blaugrün
rag Harnstoff/100 ml Blut grünlich-blau
mg Harnstoff/100 ml Blut blau
a) Creatinin-Deiminase-Papier
Filterpapier wird mit einer Lösung folgender Zusammensetzung getränkt, getrocknet und in 6 mm breite Bänder zerschnitten.
Creatinin-Deiminase 2000 ü
Dithioerythrit 0,1 g
1 0,3 m TRIS-HCl Puffer pH 8,5 100 ml
b) Indikatorschicht
Eine Masse folgender Zusammensetzung wird in einer Stärke von 0,1 mm auf eine Polycarbonat-Folie beschichtet, getrocknet und in 6 mm breite Bänder zerschnitten.
N- (Bis- (2, 4-dinitrophenyl) -methyl-
4-t-butylpyridiniumchlorid 0,15 g
Hydroxypropylcellulose
Culminal PK 82®(Henkel) 0,18 g
Wasser . 30 ml
0,01 η HCl 1,5 ml
c) Abstandshalter
Mit Silikonharz hydrophobiertes Siebdruckgewebe von ca. 100 ,u Fadenstärke und mit einer offenen Siebfläche von ca. 3 5 % wird in 25 - 40 mm breite Bänder geschnitten,
./
-IT--
d) Abdecknetz
Hydrophiles Nylonnetz von ca. 60 ,u Dicke/ Fadenstärke 40 ,u, freie Lochfläche ca. 65 % wird in 15 mm breite Bänder geschnitten. ·
e) Folie
Als Trägerfolie und Handgriff wird ein 60 - 100 mm breites, ca. 0,2 - 0,3 mm dickes Band aus schmelzkleberbeschichteter Polyesterfolie verwendet.
Creatinin-Deiminase-Papier (3), Indikatorschicht (1) und Abstandshalter (2) werden zusammen mit einem das Creatinin-Deiminase-Papier abdeckenden Netz (4) wie in Abb. 1 gezeigt auf das Ende der mit Schmelzkleber beschichteten 6 - 10 cm breiten Folie (5) gesiegelt und das entstehende Band in 6 mm breite Streifen geschnitten, so daß 6x6 mm-Testbezirke an einem 6 - 10 cm langen Handgriff entstehen.
Ein solcher Streifen wird auf das Abdecknetz mit 10 ,ul Serum betropft und mit einem Klebeetikett verschlossen. Nach einer Reaktionszeit von 7 Minuten werden Greatinin-Deiminase-Papier und Abdecknetz zusammen mit der Trennschicht entfernt. Die Verfärbung der Indikatorschicht wird von oben mit einem Remissionsphotometer vermessen. In Abhängigkeit von der Creatinin-Konzentratiom. werden folgende Meßwerte erhalten:
-48-
mg Creatinin/100 ml . Meßsignal (Skalenteile)
0 28 0,5 3.7
1 47
2 60
3 68
4 73
5 76
6 " 78
7 80
8 . , 82
10 I 84
Die auf diese Weise ermittelten Creatininkonzentrationen sind naturgemäß noch durch den im Serum ebenfalls vorhandenen Ammoniak verfälscht. Die wahren Creatininwerte erhält man, wenn man die gemäß Beispiel 5 erhaltenen Ammoniakkonzentrationen abzieht oder den Ammoniak durch geeignete Maßnahmen (z.B. Ionenaustauscher) vor der Messung aus dem Serum entfernt.
Anmerkung
Die Verfälschung durch NH~ fällt nur bei der Creatininbe™ Stimmung nicht jedoch bei der Harnstoffbestimmung gemäß Beispiel 1 und 2 ins Gewicht und zwar wegen des günstigeren Verhältnisses der vorkommenden Normalwerte im Serum:
NH3 : 0,016 - 0,038 mmol/1 Creatinin : 0,044 - 0,097 mmol/1 Harnstoff : 3,5-8,3 mmol/1
1 2 β* * . - is-
Beispiel 5 . '
a) Ammoniakaustreibendes Papier
Filterpapier wird mit einer wässrigen Lösung von 0,3 m TRIS-HCl Puffer pH 9
getränkt, getrocknet und in 6 mm breite Bänder zerschnitten.
b) - e) Analog Beispiel 4
Herstellung und Anwendung des Teststreifens ebenfalls analog Beispiel 4.
In Abhängigkeit von der Arnmoniakkonz entr ation werden folgende Meßwerte erhalten:
/ag NH3/100 ml Meßsignal (Skalenteile)
O 27
50 41
100 50
150 54
200 59
300 - 65
600 75
1500 85
Claims (3)
- 3.10.1979AP G 01 N/212 892(55 422/1.1)Erfindungsanspruch1· Diagnostisches Mittel zur Bestimmung von Ammoniak oder ιννΐ·er. Bildung von Ammoniak reagierenden Substraten bestehend aus einem Handgriff, einer darauf befestigten Indikatorschicht für gasförmiges Ammoniak und einer alkalischen Puffer enthaltenden Reaktionsschicht, die gegebenenfalls zusätzlich mit dem Substrat unter Bildung von Ammoniak reagierende Reagenzien enthält, gekennzeichnet dadurch, daß die Indikatorschicht fest mit dem Handgriff verbunden und darüber die Reaktionsschicht mittels eines Abstandshalters in einem Abstand von 10 200 fa angeordnet und das Abstandshalter u nd Reaktionsschicht leicht von der Indikatorschicht abgelöst werden könnenβ2« Diagnostisches Mittel nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß der Abstandshalter ein gewebtes oder gewirktes. Wetz oder eine Lochfolie mit einer Dicke von 10 - 200 g\i und einer freien Lochfläche von mindestens 25 % ist*3· Diagnostisches Mittel nach Punkt 1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, daß die Reaktionsschicht durch 'eine hydrophile, flüssigkeitsdurchlässige Abdeckschicht, vorzugsweise durch ein gewebtes oder gewirktes Hetz auf dem Handgriff befestigt ist·4· Diagnostisches Mittel nach einem der Punkte 1-3» gekennzeichnet dadurch, daß der Handgriff aus einer Kunststoffolie besteht«,-21- 3.10c 1979AP G 01 H/212 (55 422/11)Diagnostisches Mittel nach einem .der Punkte 1 - 4s gekennzeichnet dadurch, daß das Substrat Harnstoff ist und das damit reagierende Reagenz Urease ist*
- 6. Diagnostisches Mittel nach einem der Punkte 1-4» gekennzeichnet dadurch, daß das Substrat Creatinin ist und das damit reagierende Reagenz Creatinine Deiminase; ist»-1·7· Diagnostisches Mittel nach einem der Punkte 1-6, gekennzeichnet dadurch, daß die Reaktionsschicht zusätzlich Netzmittel oder Stabilisatoren enthält .8, Verfahren zum Nachweis von Ammoniak oder unter Bildung von Ammoniak reagierenden Substraten in wässrigen Lösungen, gekennzeichnet dadurch, daß man die Reaktionsschicht einer Vorrichtung nach den Punkten 1-4 mit einem Tropfen Ammoniak oder der unter Bildung von Ammoniak reagierenden Substrate tränkt, die Freisetzung von Ammoniak abwartet, die Indikatorschicht durch Abziehen der Reaktionsschicht und der Abstandsschicht freilegt und ihre Verfärbung visuell oder photometrisch bestimmt,9« Verfahren zum Nachweis von Harnstoff in wässrigen Lösungen, gekennzeichnet dadurch, daß man die Reaktionsschicht einer Vorrichtung nach den •Punkten 1-4 mit einem Tropfen der harnstoff-, haltigen Lösung tränkt, die Freisetzung von Ammoniak abwartet, die Indikatorschicht durch Abziehen der-2.2.- .. 3.10.1979AP G 01 N/212 (55.422/11.)Reaktionsschicht und der Abstandsschicht freilegt und ihre Verfärbung visuell oder photometrisch bestimmt»10o Verfahren zum Nachweis von Creatinin in wässrigen Lösungen, gekennzeichnet dadurch, daß man die Reaktionsschicht einer Vorrichtung nach den Punkten 1-4 mit einem Tropfen der creatininhaltigen Lösung tränkt, die Freisetzung von Ammoniak abwartet, die Indikatorschicht durch Abziehen der Reaktionsschicht und der Abstandsschicht freilegt und ihre Verfärbung visuell oder photometrisch bestimmt.
- 11. Verfahren gemäß den Punkten 8-10, gekennzeichnet dadurch, daß die Reaktipnsschicht während der Reaktion mit einer Abdeckschicht verschlossen ist*Hierzu ή Seite Zeichnung
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