DE69215808T2 - Bestimmungsverfahren für Serum-Cholinesterase-Aktivität - Google Patents
Bestimmungsverfahren für Serum-Cholinesterase-AktivitätInfo
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Description
- Die Erfindung betrifft allgemein diagnostische Tests zur Bestimmung der Aktivität von Serum-Cholinesterase. Insbesondere betrifft die Erfindung ein trockenes Element und ein Verfahren zur Bestimmung der Serum- Cholinesterase-Aktivität in unverdünnten wäßrigen Flüssigkeiten.
- Die Bestimmung der Aktivität von Serum-Cholinesterase (CHE) ist von Bedeutung bei der frühen Diagnose verschiedener Krankheitszustände, wie degenerativen Leberstörungen und durch toxische Mittel, wie Insektizide und Herbizide mit einem Gehalt an Carbamaten oder organischen Phosphorsäureestern, verursachten Vergiftungen. Diese Verbindungen hemmen CHE, so daß eine verringerte CHE-Aktivität im Serum eines Patienten ein diagnostisches Anzeichen für eine chemische Vergiftung darstellen kann. Im Fall von Carbamat-Pestiziden kann die Hemmwirkung dieser toxischen Mittel aufgehoben und die Cholinesterase-Aktivität wieder hergestellt werden, wenn man beispielsweise das Serum des Patienten verdünnt und die Konzentration des toxischen Mittels im Testreagenz verringert. In derartigen Fällen kann die in vitro-Messung der CHE-Aktivität in verdünnten Proben zu einer verfälsohten Wiedergabe der Schwere des in vivo-Zustands führen.
- Zur Bestimmung der CHE-Aktivität im Serum ist es üblich, die Testserumprobe vorzuverdünnen, da die in Humanseren normalerweise vorhandene CHE-Aktivität sehr hoch ist. Da eine derartige Verdünnung die CHE-Hemmung durch toxische Mittel aufheben kann, sollte vorzugsweise ein Verfahren angewandt werden, das dazu befähigt ist, einen Bereich an CHE-Aktivität ohne Vorverdünnung der Testproben zu bestimmen. Ein derartiges Verfahren wurde von Thomsen, Kewitz und Pleul beschrieben; J. Clin. Chem. Clin. Biochem., Bd. 26, Nr. 7 (1988), S. 469-475. Dieses Verfahren bedient sich jedoch einer manuellen Technik, bei der Reagenzien in einer nassen Lösung eingesetzt werden. Dieses Verfahren ist daher nicht ebenso zweckmäßig oder reproduzierbar, wie automatisierte Methoden oder Methoden unter Verwendung von trockenen analytischen Elementen.
- Ferner gehören zu den Reagenzien radioaktiv markiertes Acetylcholin, was gewisse Gefahren in sich birgt.
- Es ist daher wünschenswert, über ein trockenes, analytisches Element zur Bestimmung der Serum-Cholinesterase-Aktivität in unverdünnten wäßrigen Flüssigkeiten, wie biologischen Fluiden, zu verfügen.
- Demgemäß ist es eine Aufgabe der Erfindung, ein trockenes, analytisches Element zur CHE-Bestimmung von verdünnten und unverdünnten wäßrigen Flüssigkeiten, wie Körperfluiden, bereitzustellen.
- Kurz zusammengefaßt, wird gemäß einem Aspekt der Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung der Serum-Cholinesterase-Aktivität in einer wäßrigen Flüssigkeit bereitgestellt, das folgende Stufen umfaßt:
- A) Kontaktieren einer Probe der wäßrigen Flüssigkeit mit einem analytischen Element zur Bestimmung der Serum-Cholinesterase-Aktivität, umfassend einen Träger mit mindestens einer darauf befindlichen Schicht, wobei das Element ferner folgendes umfaßt:
- a) Butyrylthiocholin;
- b) Ferricyanid in einer Beschichtungsmenge von 0,02 bis 2,0 g/m²;
- c) ein Bindemittelmaterial in einer Beschichtungsmenge von 3 bis 12 g/m²; und
- d) einen Puffer zur Einstellung eines pH-Werts im Bereich von 7,0- 8,5; und
- B) Überwachen der Geschwindigkeit der Veränderung der Reflexionsdichte zur Bestimmung der Aktivität von Serum-Cholinesterase in der Probe.
- Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird das im vorstehenden Verfahren beschriebene analytische Element zur Bestimmung der Serum-Cholinesterase-Aktivität bereitgestellt.
- Ein vorteilhaftes Merkmal der Erfindung besteht darin, daß der Test mit unverdünntem Serum durchgeführt werden kann, wodurch die Erholung der Enzymaktivität bei Verdünnung vermieden werden kann.
- Ein weiteres vorteilhaftes Merkmal besteht darin, daß sich das erfindungsgemäße Element für automatisierte Analysengeräte eignet und daß dadurch die Gefahr von Fehlern und Unstimmigkeiten minimiert wird.
- Ein weiterer Vorteil der Erfindung besteht darin, daß es sich um "trockene" Chemie handelt und im Vergleich zur "nassen" Durchführung größere Bequemlichkeiten in bezug auf Handhabung und Lagerung gegeben sind.
- Der erfindungsgemäße Test ist nicht-enzymatisch und bietet daher im Vergleich zu vergleichbaren enzymatischen Tests eine bessere Reagenzienstabilität und Kostenvorteile. Unter "nicht-enzymatisch" ist zu verstehen, daß im erfindungsgemäßen Element kein Enzym enthalten ist, obgleich in der Probe CHE vorhanden sein kann.
- Um das trockene analytische Element zur Bestimmung von CHE in unverdünnten wäßrigen Flüssigkeiten bereitzustellen, mußten verschiedene Schwierigkeiten überwunden werden. Es war besonders schwierig, die Menge an Ferricyanid zu bestimmen, die dem erfindungsgemäßen trockenen Element einzuverleiben ist, was auf den in unverdünntem Humanserum auftretenden sehr breiten CHE-Bereich zurückzuführen ist. Die Menge an Ferricyanid ist kritisch, da dann, wenn es in einer zu großen Menge im Streifen vorhanden ist, die anfängliche Dichte zu hoch ist und eine Ablesung nicht durchgeführt werden kann. Ist eine zu geringe Menge vorhanden, so wird das Ferricyanid verbraucht, bevor der Endpunkt der Reaktion erreicht ist, so daß auch hier eine genaue Ablesung nicht vorgenommen werden kann. Herkömmliche Verfahren überwinden diese Schwierigkeit durch Verdünnung der Proben mit sehr hohen CHE-Spiegeln, wobei aber die mit einer Verdünnung verbundenen, vorstehend erörterten Schwierigkeiten auftreten.
- Aufgrund von Forschungsarbeiten haben wir festgestellt, daß der Bereich an Ferricyanid, der optimal als Indikator der CHE-Aktivität in einem trockenen Element wirkt, von der Konzentration der übrigen Bestandteile im Streifen, insbesondere vom Bindemittelmaterial, wie Gelatine, abhängt. Wir stellten fest, daß der geeignete Bereich für Ferricyanid im Element 0,2 bis 2,0 g/m² beträgt und der geeignete Bereich für das Bindemittelmaterial, der eine Funktion beim vorstehend erwähnten Bereich an Ferricyanid gewährleistet, 3 bis 12 g/m² beträgt. Der Fachmann ist dazu in der Lage innerhalb dieser Bereiche zu optimalen Konzentrationen zu gelangen, die sich für spezielle Testzwecke eignen. Uns ist keine Lehre bekannt, die aussagt, daß durch die Menge des Bindemittelmaterials im Streifen die vorstehend beschriebene Schwierigkeit überwunden werden kann. Es war überraschend, daß ein trockenes Element hergestellt werden konnte, mit dem die Bestimmung eines sehr breiten Bereichs der CHE-Aktivität in unverdünnten Humanseren ermöglicht wird.
- Eine weitere Schwierigkeit, die überraschenderweise gelöst werden kann, besteht in der Störung durch Bilirubin, einen natürlichen Bestandteil von Serum. Es ist bekannt, daß das natürliche gelbe Pigment in Bilirubin eine Verfälschung der Ablesung der optischen Dichte bewirkt. Da erfindungsgemäß unverdünntes Serum verwendet wird, geht bei dem System die volle Störung durch Bilirubin ein. Wir haben diese Schwierigkeiten überwunden und kommen zu genauen Ergebnissen, indem wir den Anteil der Gelvernetzung verringert haben. Wir setzen eine geringe Menge an Härter ein (beispielsweise 0,02 bis 2 g/m² BVSME). Eine gewisse Vernetzung ist jedoch erforderlich, so daß BVSME nicht vollkommen weggelassen werden kann.
- Ein weiteres überraschendes Ergebnis, das erzielt werden kann, besteht darin, daß die Reproduzierbarkeit von Beschichtung zu Beschichtung erheblich verbessert werden kann, wenn ein anionisches Tensid, vorzugsweise Olin 10G , gemäß der nachstehenden Definition den die Reagenzien enthaltenden Schichten einverleibt wird.
- Fig. 1 ist ein Diagramm zur Darstellung der Kinetik unter Auftragung der optischen Dichte gegen die Zeit, das zeigt, daß die negative Steigung des Kinetikverlaufs mit steigender CHE-Aktivität zunimmt.
- Fig. 2 ist ein Diagramm zur Darstellung der Ergebnisse von Tests an Serumproben von Patienten unter Verwendung eines EKTACHEM 700-Analysengeräts für die klinische Chemie. Dieses Diagramm zeigt, daß die bei Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens erzielten Ergebnisse gut mit den Ergebnissen übereinstimmen, die unter Anwendung eines Referenzverfahrens zur Bestimmung der CHE-Aktivität erhalten wurden.
- Der hier verwendete Ausdruck "Fluidkontakt" und ähnliche Ausdrücke beziehen sich auf Zonen oder Schichten eines Elements, die miteinander so verbunden sind, daß unter den Anwendungsbedingungen, ein Fluid, sei es flüssig oder gasförmig, in dem Element zwischen diesen Schichten oder Zonen passieren kann. Ein derartiger Fluidkontakt bezieht sich daher auf das Vermögen des Elements, den Durchgang von mindestens einigen Komponenten einer fluiden Probe zwischen Zonen oder Schichten des Elements, die in "Fluidkontakt" stehen, zu ermöglichen. Zonen, die in Fluidkontakt stehen, können benachbart sein, sie können aber auch durch zwischenliegende Zonen oder Schichten getrennt sein. Derartige zwischenliegende Zonen oder Schichten stehen aber in diesem Fall ebenfalls in Fluidkontakt und verhindern nicht den Durchgang des Fluids zwischen den Fluidkontaktschichten oder -zonen.
- Der hier verwendete Ausdruck "trocken" zur Beschreibung von analytischen Verfahren bezieht sich auf analytische Verfahren und Techniken, die unter Verwendung von chemischen Reagenzien durchgeführt werden, die in verschiedenen "berührungstrockenen" Testelementen, wie "Eintauch- und Ablese-"-Teststreifen, mehrschichtigen Testelementen und dergl. enthalten sind. "Trockene" Verfahren benötigen keine Flüssigkeit für die Rekonstitution oder Analyse.
- Der hier verwendete Ausdruck "trockene Beschichtungsmenge" bedeutet, daß die Beschichtungsmenge als "Trockengewicht" nach normalen Beschichtungs- und Trocknungsverfahren bestimmt wird.
- Der hier verwendete Ausdruck "porös" bedeutet, daß das Produkt Voller Poren ist, so daß ein Fluid durch Kapillarwirkung absorbiert und in andere Schichten, die mit der porösen Schicht in Fluidkontakt stehen, gelangen kann.
- Der hier verwendete Ausdruck "reflektiv" bedeutet, daß auf das Element gerichtetes, einfallendes Licht nicht durch das Element durchgelassen wird, sondern zu einem Photodetektor reflektiert wird, wo die Reflexionsdichte gemessen werden kann.
- Die chemische Basis für diesen Test besteht darin, daß Butyrylthiocholin durch CHE hydrolysiert wird und Buttersäure und Thiocholin freigesetzt werden. Das freigesetzte Thiocholin reduziert sodann Ferncyanid zu Ferrocyanid. Die Geschwindigkeit des Übergangs von Ferricyanid zu Ferrocyanid wird durch Reflexionsdensitometrie gemessen. Die Messung ist möglich, da Ferricyanid ein Absorptionsmaximum bei 405 nm aufweist, während Ferrocyanid bei dieser Wellenlänge nur eine geringe Absorption zeigt. Das Maß der Cholinesterase-Aktivität ist sodann direkt proportional zur Geschwindigkeit der Absorptionsänderung.
- Die vorstehend beschriebene Serie von chemischen Reaktionen wird in einem automatischen Analysengerät, beispielsweise dem EKTACHEM -Analysengerät, unter Verwendung des erfindungsgemäßen trockenen analytischen Elements, auf das eine Probe, in der die CHE-Aktivität bestimmt werden soll, aufgesetzt ist. Die für den Test von Flüssigkeiten geeigneten trockenen, analytischen Elemente lassen sich gemäß US-A-3 992 158 und US-A-4 357 363 herstellen.
- Kurz zusammengefaßt, enthält das erfindungsgemäße analytische Element eine oder mehrere Schichten, die auf einen geeigneten Träger aufgebracht sind. Enthält das Element mehr als eine Schicht (ein mehrschichtiges Element), so handelt es sich bei der dem Träger nächsten Schicht um eine Reagenzschicht, die von einer oder mehreren weiteren Reagenzschichten überlagert sein kann. Beliebige oder sämtliche Reagenzschichten können die Bestandteile Butyrylthiocholin oder Ferricyanid enthalten. Gegebenenfalls können diese beiden Bestandteile in der gleichen Reagenzschicht enthalten sein. In einem mehrschichtigen Element des beschriebenen Typs handelt es sich bei der vom Träger am weitesten entfernten Schicht um eine Verteilungsschicht, die die wäßrige Flüssigkeit, in der CHE bestimmt werden soll, aufnimmt und verteilt. Die Verteilungsschicht kann ebenfalls die Bestandteile Butyrylthiocholin und/oder Ferricyanid enthalten. Ein Puffer ist für das Element wesentlich. Er kann in beliebigen oder sämtlichen Schichten des Elements enthalten sein. Gegebenenfalls befinden sich sämtliche Bestandteile des Elements in einer einzigen Schicht. Unabhängig davon, ob sämtliche Bestandteile in der gleichen oder in unterschiedlichen Schichten des Elements enthalten sind, müssen sie in Fluidkontakt zueinander stehen, was bedeutet, daß Reagenzien und Reaktionsprodukten innerhalb einer Schicht und zwischen übereinander liegenden Bereichen von benachbarten Schichten der Durchgang ermöglicht wird.
- Der Träger kann ein beliebiges geeignetes, formbeständiges und vorzugsweise nicht-poröses und durchsichtiges (d. h. strahlungsdurchlässiges) Material sein, das für elektromagnetische Strahlung mit einer Wellenlänge von 200 bis 900 nm durchlässig ist. Ein strahlungsdurchlässiger Träger wird besonders bevorzugt, um die in diesen Elementen ablaufenden nachweisbaren Veränderungen zu verstärken und ihren Nachweis durch verschiedene Strahlungsnachweisverfahren zu erleichtern. Ein Träger der Wahl für ein bestimmtes Element soll mit dem beabsichtigten Nachweisverfahren (Reflexions-Transmissions- oder Fluoreszenzspektroskopie) verträglich sein. Zu geeigneten Trägermaterialien gehören Polystyrol, Polyester [z. B. Poly-(ethylentherephtalat)], Polycarbonate, Celluloseester (z. B. Celluloseacatat) und dergl.
- Eine Reagenzschicht ist auf den Träger aufgebracht. Die Reagenzschicht kann die Indikatorzusammensetzung mit einem oder mehreren Reagenzien (z. B. Ferricyanid oder Ferricyanid und Butyrylthiocholin) in Dispersion in einem oder mehreren synthetischen oder natürlichen Bindemittelmaterialien, wie Gelatine oder andere natürlich auftretende Kolbide, sowie verschiedene synthetische hydrophile Polymere, wie Poly(acrylamid), Poly- (vinylpyrrolidon), Poly- (acrylamid-co-N-vinyl-2-pyrrolidon), Copolymere der vorstehenden Produkte und Polymere oder Copolymere, an die vernetzbare Monomere addiert sind, enthalten.
- Die Reagenzschicht kann einen Puffer, der erfindungswesentlich ist, enthalten. Zu geeigneten Puffern gehören Phosphat, Pyrophosphat, Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (TRIS), 2-{[Tris- (hydroxymethyl)-methyl]- amino}-1-ethansulfonsäure (TES) und andere Puffer mit einem pH-Wert im Bereich von 7,0 bis 8,5. Der Puffer kann in einer beliebigen oder in sämtlichen vorstehend erwähnten Schichten enthalten sein oder er kann in einer getrennten Schicht vorhanden sein, die frei von Ferricyanid und Butyrylthiocholin ist.
- Verschiedene anionische Tenside, wie Olin-10G , TX-405 , Zonyl FSN (eine Familie von nicht-ionogenen Tensiden auf der Basis von Octylphenoxypolyethoxyethanol der Fa. Rohm und Haas) und dergl., können gegebenenfalls in der Reagenzschicht enthalten sein. Ferner sind gegebenenfalls verschiedene unterschiedliche Vernetzungsmittel enthalten, wie Bisvinylsulfonylmethan, Glutaraldehyd und dergl.
- Bei der Verteilungsschicht handelt es sich um eine poröse, reflektierende Schicht zur gleichmäßigen Verteilung der flüssigen Testprobe über das Element. Die Verteilungschicht kann die Bestandteile Butyrylthiocholin und/oder Ferricyanid enthalten. Materialien zur Verwendung in Verteilungsschichten sind auf dem Gebiet der Herstellung von trockenen analytischen Elementen bekannt, z. B. aus US-A-4 258 001 und den vorerwähnten Patenten.
- Eine beispielhafte Verteilungsschicht wird in der nachstehenden Tabelle I aufgeführt. Von Banumsulfat abweichende Pigmente können verwendet werden, beispielsweise Titandioxid. Ferner können von Celluloseacetat abweichende Bindemittel, beispielsweise verschiedene Polynrethane und andere Polymere, verwendet werden. Von TX-405 abweichende Tenside können verwendet werden, beispielsweise TX-100 . Von Iodid abweichende Halogenidionen, beispielsweise Butyrylthiocholinchlorid, können verwendet werden. Ferner können andere Thiocholine, wie Acetyl- oder Propionylthiocholin, anstelle von Butyrylthiocholin eingesetzt werden.
- Weitere fakultative Schichten, z. B. Unterschichten, strahlungsblockierende Schichten und dergl., können gegebenenfalls vorgesehen sein. Die Schichten des Elements können eine Vielzahl von weiteren wünschenswerten, jedoch fakultativen Komponenten enthalten, z. B. Tenside, Verdickungsmittel, Puffer, Härter, Antioxidantien, Kuppler, Lösungsmittel und andere aus dem Stand der Technik bekannte Materialien. Die Mengen dieser Komponenten liegen ebenfalls innerhalb des fachmännischen Wissens.
- Veränderungen im Element können mit einer geeigneten spektrophotometrischen Vorrichtung, üblicherweise einem Reflektometer, unter Anwendung allgemein bekannter Verfahrensweisen erfaßt werden, beispielsweise gemäß US-A-3 992 158, Spalten 14-15 und US-A-4 357 363, Spalte 27. Bei einer enzymatischen Reaktion wird das erhaltene Produkt gemessen, indem man beispielsweise die Geschwindigkeit der Reflexionsänderung oder der Transmissionsdichte in einer begrenzten Fläche des erfindungsgemäßen Elements, die mit dem Testmedium kontaktiert worden ist, mißt. Die gemessene Fläche beträgt im allgemeinen bis 5 mm.
- Nachstehend wird ein repräsentatives erfindungsgemäßes Element vorgestellt. Es ist darauf hinzuweisen, daß der Fachmann das erfindungsgemäße Prinzip einem beliebigen analytischen Element unter Verwendung des im vorliegenden Fall bereitgestellten Verfahrens einverleiben kann. Ferner ist darauf hinzuweisen, daß die CHE-Aktivität in anderen Proben als Seren ebenfalls mit diesem Element bestimmt werden kann. Tabelle 1 Erfindungbgemäßes Testelement
- Die im vorstehenden Element und im Text verwendeten Bezeichnungen und Symbole haben die folgenden Bedeutungen:
- Zonyl FSN : Nicht-ionogenes, fluoriertes Tensid der Fa. E. I. du Pont de Nemours
- TX-100
- TX-405
- Olin10G : Familie von nicht-ionogenen Tensiden auf der Basis von octylphenoxypolyethoxyethanol der Fa. Rohm und Haas.
- BVSME: Bis-(vinylsulfonylmethyl)-ether-Gelatinehärter
- Die Reagenzschicht wurde auf einen grundierten, mit Gelatine gestrichenen Poly-(ethylenterephthalat)-Träger aufgebracht. Die Verteilungsschicht wurde auf die Reagenzschicht aufgebracht. Sämtliche vorerwähnten Schichten wurden unter Anwendung herkömmlicher Beschichtungstechniken zur Herstellung der vorerwähnten trockenen Testelemente, wie sie beispielsweise in US-A-4 357 363 und US-A-3 992 158 beschrieben sind, aufgebracht.
- Das erfindungsgemäße Element ist zur Verwendung für Serum- oder Plasmaproben vorgesehen, jedoch können beliebige Fluide, die eine ausreichende Ähnlichkeit mit Serum haben, verwendet werden. Hierzu gehören typische Kontroll- und Standardfluide.
- Abgesehen von der Abtrennung von Serum oder Plasma aus Vollblut ist keine spezielle Probenvorbereitung erforderlich. Eine Vedünnung ist nicht erforderlich, jedoch unter der Voraussetzung, daß die verdünnte Aktivität zur Ablesung ausreicht, zulässig. Die Proben können eingefroren werden und behalten ihre Aktivität über lange Zeiträume hinweg. Sie sollen vor dem Test aufgetaut und auf Raumtemperatur gebracht werden.
- Beim erfindungsgemäßen Test werden vorzugsweise 5 bis 20 jil Probe eingesetzt. obgleich die Erfindung Variationen im Volumen der aufgesetzten Proben zuläßt, wird eine Probenmenge von 11 µl besonders bevorzugt. Unterschiedliche Eichkurven sind für unterschiedliche Probenvolumina erforderlich. Ein physikalischer Kontakt wird zwischen der flüssigen, zu analysierenden Probe und dem analytischen Element hergestellt. Ein derartiger Kontakt kann auf beliebige geeignete Weise hergestellt werden, beispielsweise indem man einen Tropfen der Probe auf die Verteilungsschicht mit einer geeigneten Abgabeeinrichtung von Hand oder maschinell aufsetzt.
- Nach dem Probenauf trag wird das Element einer etwaigen Konditionierung ausgesetzt, beispielsweise durch Inkubieren und Erwärmung oder dergl., was erwünscht sein kann, um die chemische Reaktion zu beschleunigen oder anderweitig zu erleichtern. Eine derartige Konditionierung wird vorzugsweise bei 25-40ºC und insbesondere bei 37ºC durchgeführt. Das Element wird während der Konditionierung üblicherweise für 3 bis 7 Minuten und vorzugsweise für 5 Minuten auf etwaige Veränderungen der Reflexionsdichte überwacht, wobei aber Veränderungen schon nach 20 bis 25 Minuten oder auch erst nach 30 bis 60 Minuten auftreten können.
- Nachstehend wird das Verfahren zur Bestimmung der CHE-Aktivität anhand von Beispielen erläutert. Das in sämtlichen Beispielen verwendete analytische Element entspricht den Angaben von Tabelle 1.
- Die Durchführbarkeit der Erfindung beim Testen auf CHE-Aktivität wird folgendermaßen nachgewiesen. Ein Humanserum-Pool wurde zur Beseitigung der endogenen CHE-Aktivität mit Säure behandelt und sodann mit Pferde-CHE aufgestockt, wodurch man eine Reihe von Fluiden mit einer CHE- Aktivität von 532, 3388, 5935, 8303, 11259, 13453 und 15968 U/Liter erhielt. Die CHE-Aktivitäten für die vorstehenden 7 Proben wurden mit dem Butyrylthiocholin/Ellman-Reagenz bestimmt. Dieses Verfahren wird von der British Association of Clinical Biochemists als Referenzmethode bezeichnet (Proposed Methods for Determination of Some Enzymes in Blood Serum, News Sheet Assoc. Clin. Biochem., Bd. 202 (1980), S. 31).
- Die vorstehenden Fluide und Wasser wurden jeweils auf das Element von Tabelle 1 aufgesetzt und einer Bestimmung der CHE-Aktivität an einem EKTACHEM 700-Analysator gemäß der vorstehend beschriebenen Vorgehensweise getestet. Die Reflexionsdichte (Dr) bei 400 nm wurde während einer 5-minütigen Inkubationsdauer bei 37ºC überwacht. Die Geschwindigkeit der Veränderung von Dr wurde durch das Analysengerät ermittelt. Geeignete Nachweisvorrichtungen und -verfahren sind aus dem Stand der Technik bekannt.
- Kinetische Kurven des Verlaufs der Reflexionsdichte gegen die Zeit sind in Fig. 1 dargestellt. Es zeigt sich, daß die negative Steigung der kinetischen Verlauf skurve (Dr/min) mit zunehmender CHE-Aktivität ansteigt.
- Die Geschwindigkeit (Dr/min) wurde durch lineare Regression über den linearen Bereich der Kurve der Dichte bestimmt.
- 35 Patientenproben wurden gewonnen. 15 von offensichtlich gesunden Personen, 10 von Personen mit Anzeichen einer Leberfunktionsstörung (hohes Bilirubin) und 10 von Pestizidanwendern. Sämtliche Proben wurden auf die CHE-Aktivität mit dem vorerwähnten Ellman-Reagenz getestet. Sie wurden sodann auf das erfindungsgemäße Element aufgesetzt und unter Verwendung eines EKTACHEM 700-Analysengeräts getestet. Die Steigung des linearen Bereichs der kinetischen Kurve wurde auf die vorstehend beschriebene Weise berechnet (Dr/min). Dieser Wert wurde wie bei der Referenzmethode gegen die Konzentration (Aktivität) aufgetragen. Die Ergebnisse sind in Fig. 2 dargestellt.
- Da diese Proben allgemein auf eine einzige Kurve fallen, ist ersichtlich, daß diese Technik der vorerwähnten Referenzmethode (Butyrylthiocholin/Ellman-Reagenz) entspricht und sogar mit dieser Methode geeicht werden kann.
Claims (14)
1. Verfahren Zur Bestimmung der Serum-Cholinesterase-
Aktivität in einer wäßrigen Flüssigkeit, umfassend folgende
Stufen:
A) Kontaktieren einer Probe der wäßrigen Flüssigkeit mit
einem analytischen Element zur Bestimmung der Serum-
Cholinesterase-Aktivität, umfassend einen Träger mit
mindestens einer darauf befindlichen Schicht, wobei das Element
ferner folgendes umfaßt:
a) Butyrylthiocholin;
b) Ferricyanid in einer Beschichtungsmenge von 0,02 bis
2,0 g/m²;
c) ein Bindemittelmaterial in einer Beschichtungsmenge
von 3 bis 12 g/m²; und
d) einen Puffer zur Einstellung eines pH-Werts im Bereich
von 7,0-8,5; und
B) Überwachen der Geschwindigkeit der Veränderung der
Reflexionsdichte zur Bestimmung der Aktivität von Serum-
Cholinesterase in der Probe.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die wäßrige
Flüssigkeit unverdünnt ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die
Überwachung durch Reflexionsdensitometrie bei 375-450 nm erfolgt.
4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Element einen
Träger umfaßt, auf dem sich in der nachstehenden Reihenfolge
folgende Bestandteile befinden:
a) eine Reagenzschicht mit einem Gehalt an Ferricyanid in
einer Beschichtungsmenge von 1,5 bis 2,0 g/m², Gelatine in
einer Beschichtungsmenge von 6 bis 10 g/m² und ein Puffer zur
Bereitstellung eines pH-Werts im Bereich von 7,0-8,5; und in
Fluidkontakt dazu
b) eine Verteilungsschicht mit einem Gehalt an
Butyrylthiocholiniodid.
5. Analytisches Element zur Bestimmung der Serum-
Cholinesterase-Aktivität, umfassend einen Träger mit
mindestens einer darauf befindlichen Schicht, wobei das Element
ferner folgende Bestandteile umfaßt:
a) Butyrylthiocholin;
b) Ferricyanid in einer Beschichtungsmenge von 0,02 bis
2,0 g/m²;
c) ein Bindemittelmaterial in einer Beschichtungsmenge
von 3 bis 12 g/m²; und
d) einen Puffer zur Bereitstellung eines pH-Werts im
Bereich von 7,0-8,5.
6. Element nach Anspruch 5, umfassend eine oder mehrere
Reagenzschichten und eine Verteilungsschicht, wobei (a), (b)
(c) und (d) sich befinden in
i) einer oder mehreren Reagenzschichten;
ii) einer oder mehreren Reagenzschichten und einer
Verteilungsschicht; oder
iii) der Verteilungsschicht.
7. Element nach Anspruch 6, umfassend:
a) eine oder mehrere Reagenzschichten mit einem Gehalt an
einem Bindemittelmaterial in einer Beschichtungsmenge von 3
bis 12 g/m² und mindestens eine Verbindung aus der Gruppe
Butyrylthiocholin, Ferricyanid in einer Beschichtungsmenge von
0,02 bis 2,0 g/m² und ein Puffer mit einem pH-Wert im Bereich
von 7,0-8,5; und
b) eine Verteilungsschicht.
8. Element nach Anspruch 6, wobei die
Verteilungsschicht eine oder mehrere Materialien aus der Gruppe
Butyrylthiocholin, Ferricyanid in einer Beschichtungsmenge von
0,02 bis 2,0 g/m², ein Bindemittelmaterial in einer
Beschichtungsmenge von 3 bis 12 g/m² und einen Puffer mit einem
pH-Wert im Bereich von 7,0-8,5.
9. Element nach einem der Ansprüche 3 bis 5, ferner
umfassend einen Härter.
10. Element nach Anspruch 9, wobei der Härter in einer
Beschichtungsmenge von 0,02 bis 2 g/m² enthalten ist.
11. Element nach einem der Ansprüche 5 bis 10, ferner
umfassend ein anionisches Tensid in einer Beschichtungsmenge
von 0,001 bis 2 g/m².
12. Element nach einem der Ansprüche 5 bis 11, wobei es
sich beim Butyrylthiocholin um Butyrylthiocholiniodid
handelt.
13. Element nach einem der Ansprüche 5 bis 12, wobei es
sich beim Bindemittelmaterial um Gelatine handelt.
14. Element nach Anspruch 6, umfassend einen Träger, auf
dem sich in der nachstehenden Reihenfolge folgende
Bestandteile befinden:
a) eine Reagenzschicht mit einem Gehalt an Ferricyanid in
einer Beschichtungsmenge von 1,5 bis 2,0 g/m², Gelatine in
einer Beschichtungsmenge von 6 bis 10 g/m² und einem Puffer
zur Bereitstellung eines pH-Werts im Bereich von 7,0-8,5; und
in Fluidkontakt dazu
b) eine Verteilungsschicht mit einem Gehalt an
Butyrylthiocholiniodid.
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