DE2834713C2

DE2834713C2 - Element zur Analyse von Flüssigkeiten

Info

Publication number: DE2834713C2
Application number: DE19782834713
Authority: DE
Inventors: John Victor N.Y. Figueras; Margaret Jeannette Pittsford N.Y. Smith-Lewis
Original assignee: Eastman Kodak Co
Current assignee: Ortho Clinical Diagnostics Inc
Priority date: 1977-08-08
Filing date: 1978-08-08
Publication date: 1985-09-19
Also published as: JPS5429700A; GB2002514A; GB2002514B; JPS6129460B2; FR2400202B1; FR2400202A1; DE2834713A1; CA1122889A

Description

le le le

—Z— für —N— oder —P— steht:

die Reste R¹, R² und R³, die gleich oder verschieden sein können, für Alkyl, Alkenyl, Aralkyl oder Aryl mix jeweils weniger als 8 Kohlenstoffatomen stehen;

die Reste R⁵, R⁶, R⁷ und R⁸, die gleich oder verschieden sein können, jeweils für H oder den wie zuvor definierten Rest R¹ stehen und

D die zur Vervollständigung eines heterocyclischen Ringes notwendigen Atome bedeutet;
gebildet ist. .

10. Element nach einem der Ansprüche 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die eine Wanderung des Farbstoffs hemmende Schicht (14, 26) ein hydrophiles Kolloid enthält.

11. Element nach einem der Ansprüche 3 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die eine Wanderung des Farbstoffs hemmende Schicht (14, 26) ein hydrophiles Kolloid und eine Beize für den Farbstoff enthält.

12. Element nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Strahlungsblockierende Ausbreitschicht (18) ein »Blush«-Polymer (blushed polymer) und ein Pigment enthält.

13. Element nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagensschicht (12,24) ein hydrophiles Kolloid enthält, in dem das reaktive Mittel verteilt ist.

14. Element nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagensschicht für Glucose permeabel

ist und das in der Reagensschicht enthaltene reaktive Mittel Glucoseoxidase, Peroxidase und eine Indikatorzusammensetzung enthält, die eine in Gegenwart von Wasserstoffperoxid und Peroxidase unter Bildung eines Farbstoffs oxidierbare Verbindung umfaßt.

15. Element nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagensschicht für Calcium permeabel ist und das reaktive Mittel in der Reagensschicht einen Indikator für Calcium aufweist.

Die Erfindung betrifft ein Element zur Analyse von Flüssigkeiten gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1.

Es ist bekannt, z. B. aus der DE-OS 25 32 918, der US-PS 40 42 335 und der US-PS 39 92 158, zur Durchführung quantitativer diagnostischer Analysen biologischer Flüssigkeiten, wie Blut oder Urin, analytische Elemente mit einem Schichtträger und mindestens zwei hierauf aufgetragenen Schichten zu verwenden. Wird eine Flüssigkeitsprobe, die eine zu analysierende Substanz enthält, mit einem solchen Element in Kontakt gebracht, so erfolgt die Bildung eines Farbstoffs oder das Auftreten einer anderen erfaßbaren Änderung im E.'ement stetig und gleichmäßig im Verhältnis zur Konzentration des Analyten in der Flüssigkeitsprobe. Die Analytkonzentration kann dann z. B. durch eine spektrophotometrische Messung der optischen Dichte des im Element gebildeten Farbstoffs bestimmt werden.

Die bekannten Elemente weisen mindestens eine Reagensschicht und eine äußere Ausbreitschichf. auf. Wird die zu analysierende Flüssigkeitsprobe auf die Ausbreitschicht aufgebracht, so wird die Probe von dieser Schicht absorbiert, ausgebreitet und in die Reagensschicht überführt. Nach den Angaben der US-PS 39 92 158 ist die Ausbreitschicht vorzugsweise isotrop porös und überträgt den in der Flüssigkeitsprobe enthaltenen Analyten in gleichmäßiger Konzentration (gemessen durch eine Einheitsquerschnittsfläche der Ausbreitschicht) auf die darunter befindliche Reagensschicht. In der Reagensschicht sind bestimmte Reagentien gleichmäßig verteilt, die durch Reaktion mit dem Analyten ein bestimmbares Reaktionsprodukt liefern, beispielsweise einen Farbstoff in einer Konzentration, die der Konzentration des Anaiyten in der Flüssigkeit proportional ist. Reagensschicht und Schichtträger sind strahlungsdurchlässig, so daß eine spektrophotometrische Bestimmung der optischen Dichte des in der Reagensschicht gebildeten Farbstoffs durchgeführt werden kann. Zusätzlich kann die Ausbreitsschicht ein »Biush«-Polymer (blushed polymer), sowie ein Pigment enthalten, um einerseits eine

gleichmäßige Übertragung der Flüssigkeitsprobe auf die Reagensschicht zu bewirken und andererseits oberhalb der Reagensschicht eine opake, reflektierende, d. h. Strahlungsblockierende Schicht zu schaffen, wodurch die Messung der Reflexionsschicht des Farbstoffs gefordert wird. Bei diesem Element kann jedoch ein Teil des in der Reagensschicht gebildeten Farbstoffs in die opake Ausbreitschicht wandern, wo er während der Farbdichte-S keitsmessung nicht entdeckt wird, wodurch die Empfindlichkeit und Genauigkeit der Analyse vermindert wird. Bei den aus der DE-OS 25 32 918 und der US-PS 40 42 335 bekannten analytischen Elementen ist zwischen der Reagensschicht und dem Schichtträger eine für den in der Reagensschicht gebildeten diffundier- und erfaßbaren Stoff permeable Registrierschicht für die Erfassung dieses Stoffes und ggf. eine strahlungsblockicrcnde Schicht vorgesehen. Während der Analyse diffundiert ein beträchtlicher Anteil des erfaßbaren Produkts, beispielsweise ein Farbstoff, der in der Reagensschicht gebildet wurde, durch die Strahlungsblockierende Schicht in die Registrierschicht, in der die Farbdichte bestimmt wird. In der Registrierschicht kann eine Beize für dun Färbstoff enthalten sein, um sicherzustellen, daß der in diese Schicht diffundierte Farbstoff dort fixiert wird. Hier-

durch läßt sich der Farbstoff leicht ermitteln und kann nicht mehr aus der Registrierschicht herausdiffundieren. ■;

Elemente dieser Art werden in den Fällen zur Anwendung vorgeschlagen, in denen auf andere Weise eine zuver- |

is lässige Messung der Farbstoffdichte in der Reagensschicht selbst nicht praktierbar ist, beispielsweise in analytischen Elementen, in denen andere Reagcntien und Reaktionsprodukte in der Reagensschicht ebenfalls 7,u einer Dichteveränderung führen, wodurch jegliche genaue spektrophotometrische Messung der optischen Dichte des Farbstoffs allein in dieser Schicht nicht möglich ist. Ein derartiges Element kann zuverlässige Analysenwerte liefern, jedoch liegt auf der Hand, daß ein beträchtlicher Anteil des während der Analyse gebildeten Farbstoffs in der Reagensschicht verbleiben oder in die Strahlungsblockierende Schicht wandern und dort verbleiben kann. Hierdurch werden Empfindlichkeit und Genauigkeit des analytischen Elemente verringert.

Weitere Elemente, die beispielsweise aus den US-PS 35 85 112 und 39 17 453 bekannt sind, offenbaren Wege zur Lösung dieser Probleme. Beide Druckschriften schlagen die Verwendung von Beizen in der Reaktionszone oder -schicht vor, um dem gebildeten Farbstoff eine gewisse Unbeweglichkeit zu verleihen. Diese Elemente sind ebenso wie die anderen Elemente des Standes der Technik jedoch gegenüber dem zusätzlichen Problem anfällig, daß die Beize bei der Bildung des Farbstoffs oder bei Reaktionen, die eine Voraussetzung für die Bildung des Farbstoffs darstellen, stört. Derartige Störungen können dazu führen, daß völlig unzuverlässige Analysenwertc erhalten werden.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Element für die Analyse von Flüssigkeiten des eingangs angegebenen Typs anzugeben, das die Vorteile der z. B. aus der US-PS 39 92 158 bekannten Elemente aufweist, d. h. in einfacher Weise verwendbar und leicht herstellbar ist sowie reproduzierbare quantitative Ergebnisse liefert, jedoch gleichzeitig die Nachteile, mit denen die Elemente des Standes der Technik behaftet sind, vermeidet. Hierbei ist zu nennen verringerte Empfindlichkeit und Genauigkeit der Ergebnisse, hervorgerufen durch

(a) Wanderung des erfaßbaren Produkte in poröse, Strahlungsblockierende Schichten und

(b) Störung bei der Bildung oder Freisetzung erfaßbarer Produkte durch die zur Hemmung derartiger Wanderungen eingesetzten Beizen.

Gelöst wird die gestellte Aufgabe mit einem Element, wie es in Anspruch 1 gekennzeichnet ist. Bevorzugte Ausgestaltungen ergeben sich aus den Unteransprüchen 2 bis 15.

Mit den erfindungsgemäßen Elementen lassen sich die Nachteile der analytischen Elemente des Standes der Technik vermeiden und quantitative Analysen durchführen, die äußerst genau und empfindlich sind. Erreicht wird dies erfindungsgemäß dadurch, daß eine Wanderung des erfaßbaren Produkte aus der Reagensschicht in andere Schichten des Elemente, in denen ein derartiges Produkt nicht ohne weiteres gemessen werden kann, gehemmt wird. Ferner wird eine Störung der Reaktion oder Reaktionen, die zur Bildung des erfaßbaren Produkte in der Reagensschicht oder zu dessen Freisetzung aus der Reagensschicht führen, vermieden.

Erfindungsgemäße Elemente können für diagnostische Zwecke verwendet werden. Sie weisen auf: eine strahlungsdurchlässige Reagensschicht, die für einen vorgegebenen Analyten (oder ein Reaktionsprodukt davon) permeabel ist und ein Mittel enthält, das in Gegenwart des Analyten eine Reaktion ergibt, die zu einem radioso metrisch erfaßbaren Produkt führt; eine poröse, Strahlungsblockierende Schicht, die für den Analyten permeabel ist, und zwischen der Reagensschicht und der Strahlungsblockierenden Schicht eine strahlungsdurchlässige, eine Wanderung des erfaßbaren Produkte hemmende Schicht, die für den Analyten permeabel ist. Diese Schicht u verhindert, daß eine nennenswerte Menge des erfaßbaren Produkte, das aus der Reagensschicht herausdiffundieren könnte, in die poröse, Strahlungsblockierende Schicht eintritt, in der es praktisch nicht meßbar wäre. SS Erreicht wird dies dadurch, daß das wandernde, erfaßbare Produkt in der eine Wanderung des erfaßbaren Pro- *;■< dukte hemmenden Schicht, in der es leicht erfaßbar ist, fixiert wird. Ein weiterer Vorteil, der erfindungsgemäß J-; erreicht wird, besteht darin, daß die eine Wanderung des erfaßbaren Produkte hemmende Schicht von der Reagensschicht getrennt ist, so daß sie nicht zu einer Störung der in der Reagensschicht erfolgenden analytischen ,■ Wechselwirkung(en) und Reaktion(en) führt. E;

Gegebenenfalls können die erfindungsgemäßen analytischen Elemente strahlungsdurchlässige Schichtträger aufweisen. Ferner können auch andere Schichten, wie Ausbreitschichten. Aufzeichnungsschichten und Zwi- tschcnschichtcn im Element vorliegen. Ebenso kann die poröse, Strahlungsblockierende Schicht in einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung selbst als Ausbreitschicht funktionieren. :_;,

In den Zeichnungen stellen die Fig. 1 und 2 vergrößerte Querschnittsansichten von bevorzugten Ausfüh- M. rungsformen erfindungsgemäßer analytischer Elemente dar. t;

Die analytischen Elemente sind somit mehrschichtig und weisen drei oder mehr, günstigerweise getrennte ίΐ Schichten, die übereinander angeordnet und miteinander unter Gebrauchsbedingungen in fluidem Kontakt ste- -?l hen, auf. Zu diesen Schichten gehören eine Reagensschicht, eine poröse Strahlungsblockierende Schicht und

eine eine Wanderung des erfaßbaren Produkts hemmende Schicht. Die poröse, strahlungsblockiercndc Schicht kann dabei als Ausbreitschicht dienen. Andererseits kann eine getrennte Ausbreitschicht zusätzlich zur porösen, Strahlungsblockierenden Schicht vorgesehen sein. In anderen !-"allen kann das Hlemenl zusätzlich zu den drei zuvor beschriebenen Schichten einen strahlungsdurchlässigen Schichtträger aufweisen. Im halle anderer Ausführungsf'ormen können zusätzlich strahlungsdurchlässige Schichten, beispielsweise Zwischenschichten auf Aufzeichnungsschichten, vorhanden sein.

Die Schichten sind stets so angeordnet, daß die eine Wanderung des erfaßbaren Produkts hemmende Schicht zwischen der porösen Strahlungsblockierenden Schicht und der Reagensschicht angeordnet ist. Bei denjenigen Ausführungsformen, die eine zusätzliche Schicht mit der Funktion einer Ausbreitschicht enthalten, ist die poröse, strahlungsblockierende Schicht zwischen der Ausbreitschicht und der eine Wanderung des erfaßbaren Produkts hemmenden Schicht angeordnet. Weist das Element einen strahlungsdurchlässigen Schichtträger auf, ist die Reagensschicht zwischen der eine Wanderung des erfaßbaren Produkts hemmenden Schicht und dem strahlungsdurchlässigen Schichtträger angeordnet. Bei den Ausführungsformen, die zusätzliche strahlungsdurchlässige Schichten enthalten, wie beispielsweise Zwischen- oder Aufzeichnungsschichten, sind die zusätzlichen Zwischenschichten oder Aufzeichnungsschichten zwischen der Reagensschicht und dem ggf. vorgesehenen, strahlungsdurchlässigen Schichtträger angeordnet.

Der Aufbau von Reagensschichten, porösen, Strahlungsblockierenden Schichten, Schichtträgern, Zwischenschichten, Aufzeichnungsschichten und bevorzugte Arten von isotrop porösen Ausbreitschichten, die in den Elementen vorliegen können, ist z. B. aus den US-PS 39 92 158 und 40 42 335 bekannt. Aus diesen Patentschriften sind auch Verfahren zur Herstellung dieser Schichten unter Bildung einzelner Mehrschichtelemente, sowie die Verwendung derartiger Elemente für verschiedene quantitative Analysen bekannt.

Der hier verwendete Begriff »poröse, strahlungsblockierende Schicht« definiert eine Schicht, die für einen vorgegebenen Analyten (oder ein Reaktionsprodukt davon), der in einer Flüssigkeit gelöst oder dispergiert ist, permeabel ist und die zu einer Reflexion, oder gegebenenfalls Absorption, der Bestimmungsstrahlung fuhrt. Unter der »Bestimmungsstrahlung« ist eine Strahlung gemeint, die in Verbindung mit den Elementen verwendet wird, um die Bestimmung der jeweiligen erfaßbaren Produkte, die in der Reagensschicht gebildet werden, zu erleichtern. Hierzu bedient man sich beispielsweise der Reflexionsphotometrie. Aufgrund der strahlungsblokkierenden Eigenschaften der porösen, Strahlungsblockierenden Schicht können die Strahlungseigenschalten, d. h. die besonderen Emissions-, Transmissions- oder Absorptionseigenschaften eines jeglichen erfaßbaren Produkts, das in diese Schicht hineinwandert, maskiert oder verborgen werden. Daher ist es möglich, daß die zum Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit eines in der Reagensschicht gebildeten erfaßbaren Produkts verwendete Bestimmungstrahlung nicht zu einer genauen Bestimmung des Teils des erfaßbaren Produkts in der Lage ist, das zwar als Reaktion auf einen vorgegebenen Analyten gebildet wurde, jedoch in die poröse, strahlungsblockierende Schicht gewandert ist.

Ebenso wie die poröse, strahlungsblockierende Schicht muß die Ausbreitschicht für einen in einer Flüssigkeit aufgelösten oder dispergieren vorgegebenen Analyten permeabel sein. Wird die den Analyten enthaltende Flüssigkeit mit der äußeren Oberfläche einer Ausbreitschicht in Kontakt gebracht, so verteilt die Ausbreitschicht die Flüssigkeit innerhalb der Ausbreitschicht derart, daß die Konzentration an Analyt auf der Oberfläche der Ausbreitschicht, die an die Reagensschicht des Elements angrenzt, reguliert oder eingestellt wird. Vorzugsweise, jedoch nicht erforderlicherweise, ist die Ausbreitschicht isotrop und leitet eine gleichmäßige Konzentration an Analyt zur Reagensschicht.

Liegt zusätzlich zur porösen, Strahlungsblockierenden Schicht eine getrennte Ausbreitschicht vor, so kann die Ausbreitschicht entweder strahlungsdurchlässig oder strahlungsblockierend sein. Der Begriff »strahlungsdurchlässig« bedeutet, daß die Schicht für Bestimmungstrahlung, die zum Nachweis der Anwesenheit und/oder Konzentration, sowie ggf. der Abwesenheit des von der Reagensschicht gelieferten erfaßbaren Produkts verwendel wird, durchlässig ist. Gegebenenfalls können ein oder mehrere aktive Mittel oder Reagenszusammensetzungen in die Ausbreitschicht oder die getrennte poröse strahlungsblockierende Schicht eingearbeitet werden, um mit dem gewählten Analyten zu reagieren, wodurch ein Analyt-Reaktionsprodukt gebildet wird, das - wie nachstehend beschrieben - in der darunter liegenden Reagensschicht weiter reagieren kann.

Gemäß einer bevorzugten Ausfuhrungsform der vorliegenden Erfindung wirkt die poröse, strahlungsblockie- so rende Schicht selbst als Ausbreitschicht und enthält ein »Blush«-Polymer und ggf. ein fein verteiltes, teilchenförmiges Material, beispielsweise ein Pigment. Schichten dieser Art sind aus den US-PS 39 92 158 und 40 42 335 bekannt. Zu geeigneten »Blush«-Polymeren gehören z. B. Celluloseacetat und Amide. Zu geeigneten teilchenförmigen Materialien gehören z. B. Pigmente, wie Ruß, Titandioxid und Bariumsulfat.

Die Reagensschichten der Elemente sind strahlungsdurchlässig. Vorzugsweise ist die Reagensschicht für den jeweils zu bestimmenden Analyten gleichmäßig permeabel. In der Reagensschicht ist ein Mittel verteilt, das mit dem Analyten (oder einem Reaktionsprodukt des Analyten) reagieren kann. Als Folge einer derartigen Reaktion wird in der Reagensschicht ein vorbestimmtes, erfaßbares Produkt freigesetzt, vorzugsweise proportional zur Konzentration des Analyten in der analysierten Flüssigkeitsprobe. Der Reaktion kann eine chemische Aktivität, eine katalytische Aktivität, beispielsweise bei der Bildung eines Enzym-Substratkomplexes, sowie eine jegliche andere Form einer chemischen oder physikalischen Wechselwirkungen zugrundeliegen, die in der Reagensschicht ein Produkt freisetzt, bildet oder auf andere Weise ergeben kann, das radiometrisch erfaßbar ist, d. h. durch geeignete Messung mit Hilfe von Licht oder anderer Energie bestimmt werden kann.

Typischerweise handelt es sich bei dem in der Reagensschicht gebildeten oder freigesetzten erfaßbaren Produkt um einen Farbstoff, der durch Fluoreszenzanalyse oder colorimetrische Analyse, vorzugsweise auf colon- metrischem Wege nachweisbar ist.

Gegebenenfalls können in der Reagensschicht zusätzlich geeignete Pufferzusammensetzungen enthalten sein. Die Reagensschichten können auch ein oder mehrere hydrophile Kolloide enthalten, einschließlich natür-

licher Kolloide, wie Gelatine, Agarose und Polysaccharide, und/oder synthetische Harze, wie Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon und Polyacrylamide.

Ein erfindungsgemäßes Element kann z. B. zur Analyse von Glucose in Flüssigkeiten verwendet werden, in welchem Falle das reaktive Mittel in der Reagensschicht vorzugsweise G'.acoseoxidase, Pcroxidase und eine S Indikatorzusammensetzung enthält. Eine brauchbare Indikatorziisammensetzung enthält 4-Aminoantipyrin-Hydrochlorid und 7-Hydroxy-l-naphthol. In Gegenwart von Glucose führt das reaktive Mittel proportional zur Konzentration der Glucose in der analysierten Probe zur Bildung eines Farbstoffs. Diese Konzentration kann dann durch spektrophotometrische Messung der optischen Dichte des gebildeten Farbstofls und Durchführung einer arithmetischen Berechnung ermittelt werden.

ίο Ein anderes erfindungsgemäßes Element kann z. B. zur Analyse von Calcium in Flüssigkeiten verwendet werden. Dieses Element weist eine Reagensschicht auf, welche ein reaktives Mittel enthält, das einen Indikator für Calcium darstellt und in Gegenwart von Calcium ein gefärbtes Produkt bildet. Genannt seien das Chlorphosphonazo-III (d. h. Natrium-S.o-bis^chlor^-phosphonophenylazoM.S-dihydroxy^J-naphthalin-disulfonat) und Arsenazo-III (d. h. l,8-Dihydroxy-naphthalin-3,6-disulfonsäure-2,7-bis-[(azo-2Vr>henylarsonsäure]). Die Verwendung von Arsenazo-III als Calciumkomplexierungsmittel ist aus Anal. Chin.. Acta., Band S3 (1971), Seiten 194 bis 198 bekannt. Andere geeignete Indikatoren für Calcium sind beispielsweise aus »Clinical Chemistry Principles und Technics«, Herausgeber: Henry und Mitarbeiter, 2. Ausgabe, Kapitel 19, Seite 648, Verlag Harper und Row (1974) bekannt. Erfindungsgemäße Elemente sind außer zur Bestimmung von Calcium oder Glucose, ferner zur Analyse vieler anderer Substanzen in Flüssigkeiten geeignet.

Weist ein Element einen strahlungsdurchlässigen Schichtträger auf, der die anderen Schichten trägt, so ist der Schichtträger für Licht in dem zur Bestimmung der Anwesenheit und/oder Abwesenheit erfaßbarer Produkte in der Reagensschicht angewandten Spektralbereich durchlässig. In dem Falle, in dem das erfaßbare Produkt ein Farbstoff ist, ist auch die spektrophotometrische Bestimmung der Farbstoffdichte durch den Schichtträger hindurch möglich, wobei sämtliche Schichten des Elements intakt bleiben. Ein geeigneter Schichtträger kann z. B.

aus Celluloseacetat oder Polyäthylenterephthalat bestehen.

Zu anderen zuvor erwähnten, ggf. zusätzlich vorliegenden Schichten gehören strahlungsdurchlässige Zwischen- und Aufzeichnungsschichten. Falls diese verwendet werden, so finden sie sich zwischen der Reagens schicht und dem ggf. vorgesehenen Schichtträger. Man kann Zwischenschichten auch zwischen anderen Schichten einführen, um die erforderliche Adhäsion und den fluiden Kontakt zwischen derartigen Schichten zu bewir- ken. Derartige ggf. vorgesehene Aufzeichnungs- und Zwischenschichten sind z. B. aus den US-PS 39 92 158 und 40 42 335 bekannt.

Die eine Wanderung des erfaßbaren Produkts hemmende Schicht ist strahlungsdurchlässig. Sie ist ferner für den Analyten permeabel, so daß Analyt aus der porösen, Strahlungsblockierenden Schicht durch sie hindurch in die Reagensschicht diffundieren kann. Die eine Wanderung des erfaßbaren Produkts hemmende Schicht funk tioniert so, daß ein wesentlicher Teil eines jeglichen erfaßbaren Produkts, beispielsweise eines Farbstoffs, der aus der Reagensschicht in sie hineinwandert, ortsfixiert wird oder auf andere Weise daran gehindert wird, weiter in die poröse, strahlungsblockierende Schicht (und, falls vorhanden, weiter in die getrennte Ausbreitschicht) zu wandern, da das Produkt dort nicht ohne weiteres gemessen werden kann. Eine Wanderung des erfaßbaren Produkts hemmende Schichten gemäß einer bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung enthalten ein hydrophi- les Kolloid und eine Beize für das jeweilige in der Reagensschicht gebildete erfaßbare Produkt. Zu geeigneten hydrophilen Kolloiden gehören die zuvor als brauchbar in den Reagensschichten der beschriebenen Elemente erwähnten hydrophilen Kolloiden. Brauchbare Beizen werden je nach dem besonderen in der Reagensschicht gebildeten erfaßbaren Produkt gewählt. In dem obigen Beispiel für ein Element zur Analyse von Glucose in Flüssigkeiten ist eine unter anderem bevorzugte Beize ein Copolymeres mit wiederkehrenden Einheiten von Styrol, N-Vinylbenzyl-N.N-dimethylbenzylammoniumchlorid und Divinylbenzol. Es wurde festgestellt, daß in dem Fall, in dem man die Beize direkt in die Reagensschicht einbringt, diese häufig zu Störungen der in Anwesenheit des Analyts eingeleiteten Reaktionen führt und die Bildung oder Freisetzung des erfaßbaren Produkts verhindert oder wesentlich hemmt. Zu anderen brauchbaren Beizen gehören Verbindungen der allgemeinen Formel I:

R⁴

I*

R^!—Z—R³ X^s (I)

_R2

U le Ie

—Z— für —N— oder —P— steht;

I I I

die Reste R¹, R² und R³, die gleich oder verschieden sein können, jeweils für Alkyl, Alkenyl, Aralkyl oder Aryl mit jeweils weniger als 8 Kohlenstoffatomen, einschließlich Cycloalkylresten, wie Cyclohexyl, Alkcnylresten, wie Allyl, Aralkylrcslen, wie Benzyl und Arylresten, wie Phenyl und substituiertem Phenyl, stehen, wobei der Alkylrcst vorzugsweise 1 bis b KohlcnstolTatonic enthält; besonders bevorzugt sind der Methyl- und Alkylrest; R⁴ eine Ballastgruppc mit mehr als 8 Kohlenstoffatomen darstellt, beispielsweise Alkyl, einschließlich substi-

tuiertes Alkyl und Alkyl mit Heteroatomen oder Gruppen in der Alkylkettc oder damn gebunden, Aralkyl, und Aryl wie zuvor definiert; und

X* ein Säureanion. wie ein Halogenidion, z. B. Chlorid oder Bromiil. Nilrat, MiMhosullal. p-loluolsullimal, und dergleichen, bedeutet.
Ein Beispiel Tür eine brauchbare Beize der obige Formel I ist eine Verbindung der Formel II: s

C10H21

I.

H₁₃C₆-N-C₆H₁₃ Χ^θ (U)

I

C₆H _u

Zu anderen brauchbaren Beizen gehören polymere Beizen, einschließlich Copolymere, beispielsweise Terpoiymere. Eine teilweise Auflistung repräsentativer brauchbarer polymerer Beizen umfaßt Polymere wiederkehrenden Einheiten, die von 70 bis ungefähr 98 Gew.-% eines hydrophoben Monomeren oder einer Mischung von hydrophoben Monomeren, beispielsweise Styrol, abgeleitet sind, sowie wiederkehrenden Einheiten, die von ungefähr 2 bis 30 Gew.-%, vorzugsweise ungefähr 5 bis 20 Gew.-%, mindestens eines kationischen Monomeren abgeleitet sind, wobei derartige Einheiten typischerweise, jedoch nicht notwendigerweise der allgemeinen Formel III entsprechen:

R⁷ R«
— CH- C— (Μ)

(L)„

Q Χ^θ
worin

L eine verbindende Gruppe zwischen Q^ffl und den Atomen in der Kette des polymeren Rückgrats darstellt; /7 für 0 oder 1 steht;

Χ^θ ein wie zuvor definiertes Säureanion bedeutet; und

Q* eine lineare oder heterocyclische Ammonium-, Phosphonium- oder Schwefel-enthaitende Gruppe der allgemeinen Formeln:

R¹

55 ⁶⁰

die Reste R¹, R² und R³, die gleich oder verschieden sein können, die vorstehenden Definitionen besitzen;

''? die Reste R⁵, R⁶, R⁷ und R⁸, die gleich oder verschieden sein können, für H oder den wie zuvor definierten Rest R¹

ja. stehen; und

< D die zur Vervollständigung eines heterocyclischen Rings erforderlichen Atome bedeutet.

I	-R³	Γ)	d""\ ι »
j -ζ—		Z*== CH ι	Z^=CH
R²		1₁
(IVa)	(iVb)	(IVc)

R¹ L ο &	U 11-	fur	C / \ XI XT !"Ί 1"Ί — R⁵ R⁶	TJ — ii
(IVd)		(IVe)
dargestellt, worin
I« —ζ— I	le le —N— oder —P— steht; I I

Außer dem Styrol gehören zu anderen als wiederkehrende Einheiten brauchbare hydrophobes Monomeren in diesen polymeren Beizen substituierte Styrole, Alkylacrylate und -methacrylate, düunktionelle Monomere, wie Divinylbenzol und Äthylendimethacrylat, Acrylamide, Methacrylamide, und dergleichen.

Eine teilweise Aufstellung repräsentativer kationischer Monomerer, die zur Herstellung dieser polymeren s Beizen brauchbar sind, umfaßt die folgenden Verbindungen:

N-Vinylbenzyl-N^i.N-trimethylammunium-chlorid, N-Benzyl-N^i-dimethyl-N-vinylbenzylammonium-chlorid,

Ν^ί,Ν-Trihexyl-N-vinylbenzylanimonium-chlorid, ίο N-iS-MaleimidopropyiyN.N.N-trimethylammonium-chlorid,

N-Benzyl-N^-maleimidopropylVN^-dimethylammonium-chlorid, N-Vinyloxycarbonylmethyl-N.NjN-trimethylammonium-chlorid, N-iS-Acrylamido-S^-dimethylpropyl^N.N.N-trimethylammonium-methosuUat,

l^-Dimethyl-5-vinylpyridinium-methosulfat, N^-Hydroxy-S-methacryloyloxypropyl^N.NjN-trimethylammonium-chlorid,

N-Ö-Hydroxy-S-methacryloyloxypropyl^NjN^-trimethylammonium-sulfat, N-{2-Methacryloyloxyäthyl)-N,N^-trimethylammonium-jodid, N-Q-Methacryloyloxyäthyl^N^.N-trimethylammonium-p-tolüol-sulfonat,

N-il-Methacryloyloxyäthy^N^.N-trimethylamxnonium-methosutfat, 3-Methyl-l-vinylimidazolium-methosulfat,

N-(2-Methacryioyloxyäthyl)-N,N₁N-trimethylammonium-acetat, N-(2-Methacryloyloxyäthyl)-N,N^<}-trimethylammonium-bromid, N-^-MethacryloyloxyäthylVN.NjN-trimethylammonium-chlorid,

N-{2-Methacryloyloxyäthyl)-N,N,N-trimethylammonium-fiuorid, N-(2-Methacryloyloxyäthyl)-N,N,N-trimethylammonium-nitrat und

N-(2-Methacryloyloxyäthyl)-N,N,N-trimethylammonium-phosphai

Ein Beispiel für eine geeignete polymere Beize des beschriebenen Typs ist das zuvor in Verbindung mit einem Element zur Analyse von Glucose in Flüssigkeiten näher bezeichnete Copolymere.

ίο Zusätzlich zur Verwendung von Beizen zur Formulierung der vorgeschlagenen, eine Wanderung des erfaßbaren Produkts hemmenden Schicht kann man als ein wanderungshemmendes Material auch einen Antikörper für das in der Reagensschicht gebildete erfaßbare Produkt einsetzen. Derartige Antikörper können nach gebrauch I ichen immunologischen Arbeitsweisen hergestellt werden. Selbstverständlich können sie, abhängig vom jeweiligen als erfaßbares Produkt in einem gegebenen erfindungsgemäßen Element einzusetzenden besonderen Mate- rial, in starken Umfang variieren. Typischerweise werden derartige Antikörper in der eine Wanderung des erfaßbaren Produkts hemmenden Schicht immobilisiert.

Zu Beispielen für erfindungsgemäße Elemente gehören die in den Zeichnungen erläuterten Ausführungsformen. In F i g. 1 ist ein analytisches Element dargestellt, das aus einer Reagensschicht 12, einer eine Wanderung des erfaßbaren Produkts hemmenden Schicht 14, einer porösen, Strahlungsblockierenden Schicht 16 und, gewünschtenfalls, einer Ausbreitschicht 18, besteht. Alle diese Schichten befinden sich in einem im wesentlichen kontinuierlichen, innigen Kontakt mit den jeweils angrenzenden Schichten. Bei einer alternativen Ausfuhrungsform der Erfindung, die in Fig. 2 dargestellt ist, besteht das analytische Element aus einem Schichtträger 20, ααϊ dem eine Reagensschicht 24, eine die Wanderung des erfaßbaren Produkts hemmende Schicht 26 und eine poröse, Strahlungsblockierende Schicht 28, die in diesem Falle auch als Ausbreitschicht dient, als Überzüge aufgebracht sind. Gewünschtenfalls können entweder eine Zwischenschicht 22 oder eine Aufzeichnungsschicht 22 oder beide Schichten gemeinsam im analytischen Element zusätzlich enthalten sein. Alle diese Schichten befinden sich in einem im wesentlichen kontinuierlichen, innigen Kontakt mit den angrenzenden Schichten.

Die Anwendung der erfindungsgemäßen Elemente erfolgt so, daß man eine Probe einer zu analysierenden Flüssigkeit auf die ganz außen liegende Oberfläphenschicht des Elements, bei der es sich im Faile des in Fi g. 2

erläuterten Elements um die poröse, Strahlungsblockierende Ausbreitschicht 28 handelt, aufbringt. Jeglicher in dieser Flüssigkeit enthaltene, vorbestimmte Analyt diffundiert durch die poröse, Strahlungsblockierende Schicht 28 und die eine Wanderung des erfaßbaren Produkts hemmende Schicht 26 und tritt in die Reagensschicht 24 ein. Dort bewirkt eine Reaktion mit den Testreagentien die Freisetzung oder Bildung des erfaßbaren Produkts, beispielsweise eines Farbstoffs. Dieser Farbstoff bleibt entweder an diesem Ort oder wandert teilweise aus der Reagensschicht 24 in die eine Wanderung des erfaßbaren Produkts hemmende Schicht 26, sowie in irgendwelche poröse, strahlungsdurchlässige Schichten, die unter der Reagensschicht liegen. Die ganze Menge oder Hauptmenge des in die eine Wanderung des erfaßbaren Produkts hemmende Schicht 26 eintretende Farbstoffwird ortsfixiert und an einer weiteren Wanderung in die darüber liegende(n) poröse(n) strahlungsblockierende(n) Schicht oder Schichten 28 gehindert. Dann bestimmt man die Reflexionsdichte des gesamten Farb- Stoffs in der eine Wanderung des erfaßbaren Produkts hemmenden Schicht 26, der Reagensschicht und anderen, darunter befindlichen strahlungsdurchlässigen Schichten, während das Element intakt bleibt. Dies erfolgt durch spcktropholometrische Dichtemessung gleichzeitig durch sämtliche strahlungsdurchlässige Schichten.

Die nachfolgenden Beispiele dienen zur weiteren Erläuterung bestimmter Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung.

Beispiel 1 Element zur Analyse von Glucose

Auf die folgende Weise wurden zwei Elemente zur Analyse von Glucose in Lipidcn hergestellt: s

Man beschichtet Polyäthylenterephthalat-Filmträger mit Reagensschichten, enthaltend 10 200 U/m² Peroxidase (das Symbol U steht für internationale Einheiten, die bekannt sind und allgemein anerkannte Einheiten zur Messung von Enzymaktivität darstellen), Glucoseoxidasc zu 24 400 U/m²,7-Hydroxy-l-naphthol zu 0,66 g/m² und 4-Aminoantipyrin-Hydrochlorid zu 0,86 g/m². Die Reagensschicht der Kontrollprobe 1 enthält ferner entionisierte Gelatine zu 214 g/m². Die Reagensschicht von Probe 2 enthält ebenfalls entionisierte Gelatine, jedoch zu 19,4 g/m². Die zweite Probe wird dann mit einer die Wanderung des erfaßbaren Produkts hemmenden Schicht überzogen, in diesem Falle mit einer Farbstoffwanderungs-hemmenden Schicht, die entionisierte Gelatine zu 2,1 g/m² und als Beize Polyistyrol-co-N-vinylbenzyl-N^i-dimethylbenzylammonium-chlorid-co-divinylbenzol) (Gewichtsverhältnis 49,5 :494 :1,0) zu 1,08 g/m² enthält. Sämtliche Gelatine-enthaltenden Schichten werden mit einem Dinatriumphosphat-Kaliumphosphatpuffer auf pH 6,0 gepuffert Dann werden beide Pro- ben mit einer Zwischenschicht aus n-Isopropylacrylamid zu 0,32 g/m² und einer Strahlungsblockierenden »Blushw-Polymer-Ausbreitschicht aus Celluloseacetat zu 9,4 g/m² und Titandioxid zu 64,5 g/m² überzogen. Die beiden erhaltenen Elemente werden dann an der äußersten Oberfläche ihrer Ausbreitschichten mit 10μ1-Proben von Glucosestandardlösungen mit verschiedenen Konzentrationen an Glucose in Berührung gebracht Nach 7minütiger Kontaktzeit bei 37°C werden die Reflexionsdichten des gebildeten Farbstoffs spektrophotometrisch unter Verwendung einer Photomultiplier-Einheit und eines Wratten 65-Filters gemessen. Die nachfolgende Tabelle 1 erläutert die Ergebnisse. Die Kontroliprobe ist repräsentativ für Elemente des Standes der Technik.

Tabelle I

Einfluß der eine Wanderung des Farbstoffs hemmenden Schicht auf die Messung der Dichte des im Element beim Glucosetest gebildeten Farbstoffs

Tatsächliche Glucose-Konzenlration Gemessene Farbstoffdichte Gemessene Farbstoffdichte in der

in der Kontrollprobe Probe, welche die Farbstoffwanderungs-

hemmende Schicht enthält

(mg/dl) (Du)

100 0,44 0,60

200 0,80 ;,00

400 1,23 1,65

800 1,84 2,03

Beispiel 2 Element zur Analyse auf Calcium

Es wurden zwei Elemente, eine mit und eine ohne eine Wanderung des erfaßbaren Produkts hemmende Schicht mit einer Beize nach der folgenden Arbeitsweise hergestellt:

Man überzieht einen Terephthalat-Filmträger mit einer Reagensschicht aus Gelatine (4,3 g/m²), Triton X-100 (0,17 g/m²), Chlorphosphonazo-III (0,21 g/m²), bis-(Vinylsulfonylmethyl)-äther (0,04 g/m²) und 0,1 M so 3,3-Dimethylglutarsäure. Der pH beträgt 5,4. Dann folgt die eine Wanderung des erfaßbaren Produkts (Farbstoff) hemmende Schicht, bestehend -uis Gelatine (4,3 g/m²) und Poly(styrol-on-N-vinylbenzyl-N,N-dimethylbenzylammonium-chlorid-co-divinylbenzol) (2,15 g/m²), eine Zwischenschicht, bestehend aus Poly-N-isopropylacrylamid (0,32 g/m²) und eine Strahlungsblockierende »Blushw-Polymer-Ausbreitschicht, bestehend aus TiO₂ (50,4 g/m², Celluloseacetat (7,0 g/m²) und Triton X-405 (1,4 g/m²). Triton X-100 und Triton X-405 sind Alkylphenoxypolyäthoxyäthanole.

Man stellt ein zweites herkömmliches Kontrollelement auf dieselbe Weise her mit der Ausnahme, daß zwischen der Ausbreitschicht und der Reagensschicht keine eine Wanderung des erfaßbaren Produkts hemmende Schicht angeordnet ist.

Die Elemente werden wie in Beispiel 1 bewertet, wobei man Calciumstandardlösungen mit 1 bis 5 mM CaI-cium verwendet und die Reflektionsdichten bei 670 nm abliest. Tabelle II zeigt die besseren Ergebnisse, die man mit dem Element erhält, welches das eine Wanderung des erfaßbaren Produkts hemmende Schicht, in diesem Falle eine FarbstofTwanderungs-hemmende Schicht, enthält.

Die Ert bnisse der obigen Beispiele 1 und 2 zeigen, daß man mit dem Element, das eine Wanderung des erfaßbaren Produkts hemmende Schicht enthält, stets wesentlich höhere Farbstoffdichten meßbar erfassen kann. Beim Kontrollelement hingegen, das keine derartige Schicht aufweist, können beträchtliche Menge des Farbstoffs in die Strahlungsblockierende »Blushw-Polymer-Ausbreitschicht wandern, wo sie einer Bestimmung entzogen sind.

Tabelle Π

Einfluß der FarbstoSwanderungs-hemmenden Schicht auf die Messung des im Element zur Bestimmung von Calcium gebildeten Farbstoffs

⁵ Tatsächliche Calcium-Konzentration Gemessene Fwbstoffdichte Gemessene FarbstofTdichte in der

in der Kontrollprobe Probe, welche die FarbstofTwanderungs-

hemmende Schicht enthält

(mM) (Dg) (DjJ

₁₀ . — —

0 0,246 0,28

1 0,267 0,75

2 0,269 0,8G 15 3 0,279 0,82

4 0,269 0,84

5 0,262 0,84

20 Man wiederholt Beispiel 2 mit der Ausnahme, daß die Reagensschicht als Calciumindikator 0,48 g/m² Arscnazo-IH anstelle von Chlorphosphonazo-III enthält Die Reagensschicht ist auf einen pH von 5,6 gepuffert. Das erhaltene Element zeigt eine Farbstoflmtensität, die mit der des Testelements von Beispiel 2 vergleichbar ist.

²⁵ Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

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Claims

Patentansprüche:

1. Element zur Analyse von Flüssigkeiten, mit einer strahlungsdurchlässigen Reagensschicht, die für einen vorgegebenen Analyten penneabel ist und ein Mittel enthält, das in Gegenwart des Analyten eine Rsaktion

ergibt, die zu einem radiometrisch eriaBbaren Produkt führt, sowie einer porösen, Strahlungsblockierenden Schicht, die für den Analyten ebenfalls penneabel ist, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen der Reagensschicht (12,24) und der porösen Strahlungsblockierenden Schicht (16,28) eine strahlungsdurchlässige, eine Wanderung des eriaBbaren Produkts hemmende Schicht (14,26) angeordnet ist, die für den Analyten penneabel ist, jedoch die Wanderung des eriaBbaren Produkts zur porösen, Strahlungsblockierenden ίο Schicht hemmt

2. Element nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die eine Wanderung des erfaßbaren Produkte hemmende Schicht (14,26) einen immobilisierenden Antikörper für das radiometrisch erfaßbare Produkt enthält

3. Element nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem erfaßbaren

Ils Produkt um einen Farbstoff handelt 4. Element nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich eine Ausbreitschicht (18) aufweist, die für den Apalyten penneabel ist, wobei die für den Analyten permeable, poröse, strahluiigsblockierende Schicht (16) zwischen der Reagensschicht (12) und der Ausbreitschicht angeordnet ist I

S. Element nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagensschicht (24) auf ■

einen strahlungsdurchlässigen Schichtträger (20) aufgebracht ist.

6. Element nach Anspruch S, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich zwischen der Reagensschicht (24) und dem Schichtträger (20) mindestens eine strahlungsdurchlässige Zwischen- oder Aufzeichnungsschicht (22) angeordnet ist

7. Element nach einem der Ansprüche 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die eine Wanderung des Farbstoffs hemmende Schicht (14, 26) eine Beize für den Farbstoff enthält.

8. Element nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Beize der allgemeinen Formel I:

R⁴ R¹—Z—R³ X^e (I)

R²

entspricht, worin

U le U

—Z— für —N— oder —P— steht;

I I I

die Reste R¹, R² und R³, die gleich oder verschieden sein können, für Alkyl, Alkenyl, Aralkyl oder Aryl mit jeweils weniger als 8 Kohlenstoffatomen stehen;
R⁴ für eine Ballastgruppe mit mehr als 8 Kohlenstoffatomen steht und
X® für ein Säureanion steht.

9. Element nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Beize um ein Copolymer handelt, das aus wiederkehrenden Einheiten, die von ungefähr 70 bis ungefähr 98 Gew.-% eines hydrophoben Monomeren oder einer Mischung von hydrophoben Monomeren abgeleitet sind und aus wiederkehrenden Einheiten, die von ungefähr 2 bis 30 Gew.-% mindestens eines kationischen Monomeren der allgemeinen Formel II abgeleitet sind:

R⁷ R^g

I I

_CH —C— (D)

I.
Q Χ^θ

worin

I. für eine verbindende Gruppe zwischen Q* und den Atomen in der Kette des Polymerrückgrats steht; ίο η für 0 oder 1 steht;

X¹' ein Säureanion bedeutet und

Q^ffl eine lineare oder heterocyclische Ammonium, Phosphonium oder Schwefel enthaltende Gruppe einer der nachfolgenden Formel darstellt:

R'—Z*—R' Z*=CH Z*= CH

Il

R¹ C

S— H-N N-H

LII

R² R⁵ R⁶