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Die Erfindung bezieht sich auf ein höchstempfindliches
Verfahren zur Messung von Phenol oder α-Naphtol sowie auf ein
Verfahren zur Messung der Aktivität eines Enzyms durch die
Messung von Phenol oder α-Naphtol.
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Die Messung der Aktivität von alkalischer Phosphase, saurer
Phosphatase, Kallikrein, Antithrombin III und ähnlicher
Enzyme ist bei der klinischen Diagnose verschiedener
Krankheiten sehr wichtig und wurde bereits weitläufig dafür
verwendet.
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Jeder der Messungen wurde durch eine Messung von Phenol oder
α-Naphtol, welche durch Inkontaktbringen des Enzyms mit einem
Substrat einer Phenyl- oder Naphtylradikal enthaltenden
Verbindung freigesetzt werden, ausgeführt. Obwohl verschiedene
Verfahren für die Messung von Phenol und α-Naphtol dargelegt
wurden, sind die typischen im folgenden aufgeführt:
Qualitative Verfahren, die Phenol verwenden:
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Nachweis durch Indophenol-Reaktion (Liebermann'sche
Reaktion); Nachweis mit Millon'scher Reagenz; Nachweis mit 2,6-
Dichlorchinonchlorimid; Nachweis mit 4-Aminoantipyrin;
Nachweis mit Eisen (III)-Chlorid; Nachweis durch
Fluoreszein-Reaktion mit m-Diphenol.
Quantitative Verfahren von Phenol:
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Verfahren, das eine Diazo-Kupplung verwendet; Verfahren, das
2,6-Dibromchinonchlorimid verwendet; Verfahren, das
4-Aminoantipyrin verwendet; Verfahren, das das Folin-Ciocalten'sche
Reagenz verwendet.
Qualitative Verfahren von α-Naphtol:
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Nachweis mit einem Diazoniumsalz von p-Nitroanilin; Nachweis
mit Cerammoniumnitrat.
Quantitative Verfahren von α-Naphtol:
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Verfahren, das 2-Naphthylamin-5,7-Disulfonsäure verwendet;
Verfahren, das 4-Aminoantipyrin verwendet.
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Fast alle diese Verfahren, insbesondere die quantitativen
Verfahren, weisen einen gemeinsamen Nachteil darin auf, daß
die Funktionsvorgänge dahingehend störend sind, daß sie eine
relativ lange Zeitspanne benötigen. Die am verbreitesten
angewandten Verfahren unter diesen sind, hinsichtlich einer
Erleichterung des Betriebes, die qualitativen und quantitativen
Verfahren, die 4-Aminoantipyrin verwenden, die, sofern es das
Phenol betrifft, eine Reaktion zwischen Phenol und
4-Aminoantipyrin unter alkalischer Bedingung und der Anwesenheit von
Kaliumferricyanid zur Bildung eines Antipyrinfarbstoffes mit
gelblich-roter Farbe zum Nachweis von Phenol verwenden, und
das Ergebnis der Messung der Farbtönung der resultierenden
gefärbten Lösung durch Messung des Absorptionsvermögens bei
510 nm zum quantitativen Bestimmen des Phenols verwenden, wie
unten durch die Reaktionsformeln dargestellt.
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Die Verfahren, die 4-Aminoantipyrin verwenden, welche
bevorzugt wurden, weisen ebenso den Nachteil einer geringeren
Empfindlichkeit auf, da der zu bildende Antipyrinfarbstoff einen
niedrigeren molekularen Auslöschungskoeffizienten von 5000
bis 10000 besitzt. Deshalb sollte, wenn die Konzentration von
Phenol oder α-Naphtol in der Probe relativ niedrig ist, der
gebildete Antipyrinfarbstoff mit Chloroform extrahiert und
konzentriert werden, um die Empfindlichkeit zu erhöhen, was
den Betrieb mühsam macht und wofür eine zusätzliche
Zeitspanne nötig ist.
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Als ein konventionelles Verfahren zur Messung der Aktivität
von Enzymen, beispielsweise alkalischer Phosphatase und
saurer Phosphatase, wurde das Kind-King'sche Verfahren
weitläufig angewendet. Laut diesem Verfahren wird das Enzym mit
einem Substrat einer Phenyl- oder Naphthylradikal enthaltenden
Verbindung in Kontakt gebracht, um Phenol oder α-Naphtol von
dem Substrat freizusetzen, das freigesetzte Phenol oder α-
Naphtol reagiert mit 4-Aminoantipyrin in Anwesenheit von
Kaliumferricyanid als einem Oxidationsmittel, um den
Antiyprinfarbstoff mit gelblich-roter Farbe zu bilden, und die
Farbtönung der resultierenden gefärbten Lösung wird zur Bestimmung
der Aktivität des Enzyms vermessen.
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Dieses Verfahren weist die Nachteile auf, auf die bei der
Messung von Phenol hingewiesen wurde. Ferner zeigt dieses
Verfahren einen bemerkenswerten Nachteil darin auf, daß die
Maximalabsorption des Antipyrinfarbstoffs nahe 500 nm liegt,
wie oben genannte, und ebensolche Wellenlänge wird zur
Messung verwendet. Wenn nämlich die Aktivität von Enzymen auf
dem Gebiet der klinischen Untersuchungen vermessen wird, wird
gewöhnlich ein Serum als eine Testprobe gewählt, wobei dies
eine mögliche anomale Probe einer hämolytischen,
milchsaftartigen oder icterischen Probe ist, und im Fall solcher
anomalen Proben wirkt Hämoglobin, Chymus oder Bilirubin als
störendes Material, das Meßfehler verursacht, da die
Maximalabsorption der Materialien mit oder nahe von 500 nm, als
Meßwellenlänge für den Antipyrinfarbstoff, überlappt, wie folgt.
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Hämoglobin: besitzt Doppelmaximalabsorption bei 430 nm und
im Bereich von 530 bis 750 nm,
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Chymus: absorbiert über einen weiten
Wellenlängenbereich und zeigt ein höheres
Absorptionsvermögen, wenn die Meßwellenlänge kürzer wird, und
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Bilirubin: besitzt eine Maximalabsorption bei 465 nm.
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Ein Ziel der Erfindung ist es, ein höchstempfindliches
Verfahren zur Messung von Phenol und α-Naphtol zu schaffen,
welches eine relativ kurze Zeitspanne für die Reaktion dazu
benötigt.
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Ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, ein Verfahren zur
Messung der Aktivität von Enzymen durch die Messung von
Phenol
oder α-Naphtol zu schaffen, welches eine relativ kurze
Zeitspanne benötigt und große Genauigkeit zeigt, selbst wenn
ein anomales Serum als eine Probe, die Enzyme beinhaltet,
verwendet wird, um getestet zu werden.
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Erfindungsgemäß schaffen wir ein Verfahren zur quanitativen
Messung von Phenol oder α-Naphtol, die in einer Probe
enthalten sind, umfassend die Umsetzung des Phenols oder des
αNaphtols mit p-Diethylaminoanilin in Gegenwart eines
chemischen Oxidationsmittels zur Bildung eines Chinonfarbstoffes
und Messung der Farbintensität der resultierenden Lösung, um
die Menge des Phenols oder des α-Naphtols zu bestimmen.
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Als Oxidationsmittel können Kaliumferricyanid, Chloramin T,
Natriummetaperiodat oder ähnliche chemische Oxidationsmittel
verwendet werden.
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Ferner schafft die Erfindung ein Verfahren zur Messung der
Aktivität von Enzymen, die in einer Probe enthalten sind,
enthaltend das In-Kontak-Bringen einer Verbindung, welche ein
Phenyl- oder Naphtylradikal enthält mit dem Enzym in der
Probe, um das Phenol oder α-Naphtol freizusetzen, Umsetzen
des freien Phenols oder α-Naphtols mit p-Diethylaminoanilin
in Gegenwart eines chemischen Oxidationsmittels, um einen
Chinonfarbstoff zu bilden und Messen der Farbintensität der
resultierenden Lösung, um die Enzymaktivität zu bestimmen.
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Beispiele für das Enzym, dessen Aktivität zu messen ist, sind
alkalische Phosphatase, saure Phosphatase, Kallikrein und
Antithrombin III. Als Substrate können konventionelle
Verbindungen, die imstande sind, Phenol oder α-Naphtol
freizusetzen, verwendet werden, beispielsweise Dinatrium und
L-Propyl-L-Phenylalanyl-L-Alginin-1-Naphtylesterdihydrochlorid und
derartige Verbindungen.
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Die folgenden Gleichungen stellen die in den obigen
erfindungsgemäßen Verfahren auftretenden Reaktionen dar, in denen
die folgenden Substanzen verwendet werden.
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Enzyme, deren Aktivität zu messen ist: Alkalische Phosphatase
(ALP)
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Substrat: Phenylphosphat
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Der resultierende Chinonfarbstoff besitzt seine
Maximalabsorption nahe 670 nm, weshalb solch eine große Wellenlänge zur
Messung verwendet werden kann.
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Deshalb können, selbst wenn ein anomales Serum als Probe
verwendet wird, die durch Hämoglobin und Bilirubin verursachten
Störungen infolge der Unterschiede der Maximalabsorption
vermieden werden und die durch Chymus verursachte Störung kann
ebenso auf ein niedriges Niveau gehemmt werden. Ferner
besitzt der Chinonfarbstoff einen molekularen
Auslöschungskoeffizienten von ungefähr 20000, welcher ungefähr 2 bis 4-mal
größer ist als der des Antipyrinfarbstoffs (ungefähr 5000 bis
10000), gemessen mit dem konventionellen Kind-King'schen
Verfahren, so daß das erfindungsgemäße Verfahren eine sehr hohe
Empfindlichkeit zeigt und jede der Enzym- und
Oxidationsreaktionen ist in ungefähr 5 Minuten abgeschlossen, was ungefähr
Drittel der Zeit ist, die bei dem konventionellen Kind-
King'schen Verfahren benötigt wird.
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Die Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die Testbeispiele
und Meßbeispiele erklärt, die sich auf die Zeichnungen
beziehen können, in denen
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Fig. 1 ein Diagramm ist, das den Zusammenhang zwischen dem
Absorptionsvermögen und der Meßwellenlänge einer
Probelösung, die einen Chinonfarbstoff beinhaltet, und
einer Kontrollösung zeigt;
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Fig. 2 eine Calibrierungskurve ist, die verwendet werden
kann, wenn Phenol erfindungsgemäß zu vermessen ist;
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Fig. 3 ein Graph ist, der den Effekt von Hämoglobin, das zu
einem normalen Serum gegeben wird, auf die Messung
der Aktivität alkalischer Phosphatase zeigt;
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Fig. 4 ein Graph ähnlich Fig. 3 ist, jedoch zum Testen des
Effektes von Bilirubin;
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Fig. 5 ein Graph ähnlich Fig. 3 ist, jedoch zum Testen des
Effektes von Chymus;
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Fig. 6 ein Graph ähnlich Fig. 3 ist, jedoch zum Testen des
Effektes von Ascorbinsäure; und
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Fig. 7 ein Graph ist, der die Korrelation zwischen dem
erfindungsgemäßen Verfahren und dem konventionellen
Kind-King'schen Verfahren zeigt.
Testbeispiel 1
a) Testprobe:
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Ein blaugefärbte wäßrige Lösung, die einen Chinonfarbstoff
enthält, der durch Reaktion von Phenol mit
p-Diethylaminoanilin als Diaminverbindung in Gegenwart von Kaliumferricynad
als Oxydationsmittel hergestellt wurde.
b) Kontrollprobe:
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Eine wäßrige Lösung, die die Diaminverbindung und das
Oxidationsmittel wie in der genannten Testprobe enthält,
allerdings kein Phenol enthält.
c) Messung des Absorptionsvermögens und des molekularen
Auslöschungskoeffizienten:
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Das Absorptionsvermögen jeder der Test- und Kontrollproben
wurde bei verschiedenen Wellenlängen vermessen, um die in
Fig. 1 gezeigten Ergebnisse zu erhalten. Anhand der Figuren
ist es offensichtlich, daß eine Maximalabsorption des
Chinonfarbstoffes in der Testprobe nahe 670 nm liegt. Weiterhin
zeigt der Chinonfarbstoff einen molekularen
Auslöschungskoeffizienten von ungefähr 20000, dessen Wert das Zwei- bis
Vierfache des mit dem konventionellen Kind-King'schen Verfahren
gemessenen Antipyrinfarbstoffs ist. Dies zeigt, daß das
erfindungsgemäße Verfahren eine Empfindlichkeit besitzt, die
der des Kind-King'schen Verfahrens überlegen ist.
Beispiel 1 (Messung von Phenol)
[I] Reagenzien
1) Carbonatpuffer:
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Eine wäßrige Lösung, hergestellt durch Vermischen von
50 mmol/l Natriumcarbonatlösung mit 50 mmol/l
Natriumhydrogencarbonatlösung und Einstellung des pH der Mischung auf
10,0.
2) Kaliumferricyanid:
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Eine wäßrige Lösung von 30 mmol/l Kaliumferricyanidlösung.
3) p-Diethylaminoanilin:
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Eine wäßrige Lösung, hergestellt durch Zugabe von
p-Diethylaminoanilindihydrochlorid zu 0,1 N Hydrochlorsäurelösung, so
daß die Konzentration an p-Diethylaminoanilin 15 mmol/l
betrug.
[II] Betriebsvorgang
(1) Meßvorgänge:
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a) 40 ul jeder der Probelösungen (T), eine reine Reagenz als
Kontrolle und eine Standardphenollösung (St) wurden
entnommen.
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b) Zu jeder der obigen entnommenen Lösungen wurden 2,0 ml
Carbonatpuffer, 0,2 ml Kaliumferricyanidlösung und 0,2 ml
einer p-Diethylaminoanilinlösung zugegeben und vermischt, und
jeder der erhaltenen Mischungen wurde dann für 5 Minuten
stehengelassen.
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c) Das Absorptionsvermögen der gemischten, die Probe
enthaltenden Lösung und der gemischten, die Standardphenollösung
enthaltenden Lösung wurden bei 670 nm vermessen
(Absorptionsvermögenswerte von Et und Es), wobei selbige mit dem
Absorptionsvermögen der reinen Reagenz zur Kontrolle verglichen
wurden.
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(2) Quantitative Berechnung:
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Eine Konzentration (C) von Phenol in der Probelösung kann
gemäß der folgenden Gleichung berechnet werden.
C = (Et/Es)·(Konzentration der Standardphenollösung)
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Das Volumenverhältnis zwischen der Probelösung und den
Reagenzien kann, abhängig vom Zweck der Messung, modifiziert
werden, beispielsweise bei einer Reinheitsmessung für
Rohmaterialien von Drogen, wie z. B. Propanolhydrochlorid oder
einer Messung von Phenol in einer Abfallösung einer Fabrik,
wobei die Konzentration der letztendlich reagierenden Lösung
in Betracht zu ziehen ist.
Testbeispiel 2 (Kalibrierungskurve für Phenol)
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Der Zusammenhang zwischen der Menge von Phenol und dem
Absorptionsvermögen der Lösung wurde an verschiedenen
Standardphenollösungen, die Phenol in verschiedenen Mengen, die
von 0 bis 30 ug reichen, beinhalten, durch Reaktion von
Phenol mit Reagenzien ähnlich den in Beispiel 1 beschriebenen
bestimmt, um die in Fig. 2 gezeigten Resultate zu erhalten.
Beide besitzen einen linearen Zusammenhang, was bedeutet, daß
der Graph aus Fig. 2 als Calibrierungskurve verwendet werden
kann.
Beispiel 2 (Messung der Aktivität an alkalischer Phosphatase)
[I] Reagenzien
1) Erstes Reagenz:
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Zu 100 ml von 50 mmol/l Carbonatpuffer (pH 10,0), der 0,1%
Polyoxyethylenoctylphenylether beinhaltet, wurden 380 mg
Dinatriumphenylphosphat, 100 mg Kaliumferricyanid und 100 mg
Magnesiumchlorid (Hexahydrat) zugegeben und gelöst, um dieses
Reagenz herzustellen. Dieses Reagenz kann wirkungsvoll über
einen Monat verwendet werden, wenn es in einem Kühlschrank
gelagert wird.
2) Zweites Reagenz:
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Dieses Reagenz wurde durch Zugabe und Lösen von 36 mg
p-Diethylaminoanilindihydrochlorid in 1 ml 1N-Hydrochlorsäure
und Zugabe von raffiniertem Wasser, um eine gesamte Menge von
20 ml zu ergeben, hergestellt.
[II] Meßverfahren
1) Meßvorgänge:
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a) 2,0 ml der ersten Reagenz wurden in jedes Teströhrchen
gegeben und auf 37ºC erwärmt.
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b) 40 l jedes der Probeseren (T), raffiniertes Wasser als
Kontrolle und ein Standardserum (St) wurde entnommen und zu
jedem der genannten Teströhrchen zugegeben und auf 37ºC für 5
Minuten erwärmt, um eine Reaktion zu verursachen.
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c) Beide der reagierten Lösungen wurden einer Messung des
Absorptionsvermögens bei 660 nm unterzogen, wobei selbige mit
dem raffinierten Wasser als einer Kontrolle verglichen
wurden, um die Absorptionsvermögenswerte Eo(T) und EO(St) zu
erhalten.
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d) Sofort nachdem die Absorptionsvermögensmessung
durchgeführt wurde, wurden 0,4 ml der zweiten Reagenz zu den
reagierten Lösungen gegeben, darin vermischt und für 5 Minuten
stehengelassen, um die Reaktion zu verursachen.
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e) Beide der resultierenden Lösungen wurden einer Messung des
Absorptionsvermögens bei 660 nm unterzogen, wobei selbige mit
raffiniertem Wasser als Kontrolle verglichen wurden, um die
Absorptionsvermögenswerte Ef (T) und Ef (St) zu erhalten.
2) Quantitative Berechnung
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Die Aktivität (C) der alkalischen Phosphatase in dem
Probeserum wird gemäß der folgenden Gleichung berechnet:
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C = Ef(T) - [Eo(T) · (2.04/2.44)]/Ef(St) - [Eo(St) · (2.04/2.44)] (Aktivität des Standardserums)
Beispiel 3 (Messung der Aktivität an Harnkallikrein)
[I] Reagenzien
1) Testproben:
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Ein Reagenz wurde durch Lösen von 10 mg
p-Diethylaminoanilindihydrochlorid und 6 mg Pro-Phe-Arg-ONap·2HCl
(L-Propyl-LPhenylalanyl-L-Alginin-l-Naphtylesterdihydrochlorid) in 10 ml
eines 0,2 M Phosphatpuffers (pH 6,5) hergestellt. Ein
Filterpapier wird in die Reagenzlösung getaucht, dort
herausgenommen und unter Vakuum gefriergetrocknet.
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Das behandelte Testpapier wurde in Teile einer Größe von
5·5 mmol/l zerschnitten und jedes Teil wurde an ein Ende
eines Polyvinylchloridfilmstreifens mit Hilfe eines anderen
Teiles, das eine Klebeschicht auf beiden Seiten besitzt,
angebracht, um eine gewünschte Testprobe herzustellen.
2) Farbentwicklungslösung:
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6 mmol/l Chloramin T Lösung.
[II] Meßverfahren
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a) Das Testpapierteil der Testprobe wurde in eine Harnprobe
getaucht oder ein Tropfen der Harnprobe wurde auf das
Testpapierteil getropft, um eine Absorption dorthinein zu bewirken,
und dann sanft auf der oberen Oberfläche der Testprobe
verwischt.
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b) Die resultierende Testprobe wurde auf einer Platte
angeordnet und bei 37ºC gehalten und so wie sie war für 5 Minuten
belassen.
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c) Ein Tropfen der Farbentwicklungslösung wurde auf das
Testpapierteil auf der Testprobe getropft und für 2 Minuten
stehengelassen.
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d) Eine blaue Farbe wurde auf dem Testpapierteil entwickelt
und dessen Farbtönung wurde mit einem vorher hergestellten
standardkolorimetrischen Diagramm [das beispielsweise die
Farbtönungen zeigt, die einer Harnkallikreinkonzentration von
0, 20, 40 und 80 NU/l (NU : Naphtyleinheit) entspricht]
verglichen, um die Aktivität des Kallikrein in der Harnprobe
zu bestimmen.
Testbeispiel 3 (Einfluß der störenden Substanzen)
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Tests wurden in Verbindung mit Messungen der Aktivität an
alkalischen Phosphatasen durchgeführt, um zu bestimmen, ob oder
ob nicht Hämoglobin, Bilirubin, Chymus und Ascorbinsäure
einen schlechten Einfluß auf das erfindungsgemäße Verfahren,
das durch die Messung des Chinonfarbstoffs durchgeführt wird,
ausüben, da die Substanzen als Ursachen für einen Meßfehler
bei dem konventionellen Kind-King'schen Verfahren betrachtet
werden. Die Ergebnisse sind in den Fig. 3 bis 6 gezeigt.
Wie anhand der Figuren offensichtlich ist, üben diese
Substanzen nahezu keinen Einfluß auf die Messung aus.
Testbeispiel 4 (Reproduzierbarkeit)
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Die Reproduzierbarkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens wurde
überprüft, um die in der folgenden Tabelle enthaltenen
Ergebnisse zu erhalten. Wie anhand der Tabelle zu entnehmen ist,
besitzt das erfindungsgemäße Verfahren eine sehr große
Reproduzierbarkeit.
Serum 1 (K-A Einheit) Mittelwert prozentuale quadratische Steuung (%)
Testbeispiel 5 (Korrelation mit dem Kind-King'schen Verfahren)
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Die Aktivität einer alkalischen Phosphatase in verschiedenen
Proben wurde gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren und dem
konventionellen Kind-King'schen Verfahren vermessen, um die
Korrelation zwischen diesen zu überprüfen. Wie anhand der in
Fig. 7 gezeigten Ergebnisse zu entnehmen ist, weisen beide
Verfahren eine gute Korrelation auf, was die Verläßlichkeit
des erfindungsgemäßen Verfahrens zeigt.