DE69713973T2 - Methode zum Nachweis von Lysozym - Google Patents

Description

Hintergrund der Erfindung
• Die vorliegende Erfindung betrifft den Nachweis von Lysozym in wässrigen Flüssigkeiten, z. B. in Urin, durch Anwendung eines Test-Systems, worin ein Proteinfehler-Indikator und ein Puffer enthalten sind. Die Bestimmung des Vorliegens bzw. Vorhandenseins von Protein in einer Urinprobe ist deshalb wichtig, weil Lysozymurie ein nützlicher Indikator einer Schädigung tubulärer Nierenzellen sowie eine Diagnose-Hilfe bei monozytischer myelomonozytischer Leukämie ist. Ausserdem kann Lysozymurie Pyelonephritis, Homopfropf-Abstoßung oder eine Schwermetall-Vergiftung anzeigen. Somit ist es oft notwendig, Lysozym quantitativ und qualitativ in Urin zu messen.
• Verschiedene Verfahren zur Bestimmung des Vorliegens bzw. Vorhandenseins von Protein in Urin sind bekannt, von denen das einfachste darauf beruht, einen absorbierenden Streifen, der mit einem Proteinfehler-Indikator und einem Puffer imprägniert ist, mit einer kleinen Menge Urin zu benetzen. Proteinfehler-Indikatoren sind pH-Indikatoren, die eine ionisierbare Gruppe enthalten, die in der Gegenwart von Protein verschoben wird, um eine nachweisbare Farbänderung zu ergeben. Dies ist die gleiche Farbänderung, die der Indikator unter dem Einfluss einer pH-Änderung eingehen würde, weshalb es wichtig ist, einen Puffer in das Test-System einzubringen, um dadurch einen pH-Anstieg zu vermeiden, da ein solcher Anstieg eine Farbänderung im Indikator auch in der Abwesenheit von Protein verursachen könnte, was zu einem falschen Positiv-Ergebnis führen würde.
• Protein-Nachweisverfahren auf Basis der Bindung von Proteinfehler- Indikatoren wie von Phenolsulfonphthalein-Farbstoffen stellen relativ nicht-spezifische Maßnahmen einer Proteinbestimmung dar. In der vorliegenden Erfindung werden Alkylsulfonsäuren und/oder deren Salze angewandt, um die Empfindlichkeit von Verfahren auf Basis der Bindung von Proteinfehler- Indikatoren zu erhöhen, so dass sich Lysozym genau nachweisen lässt.
• In US 5,187,104 wird die Verwendung von 5',5"-Dinitro-3',3"-dijod- 3,4,5,6-tetrabromphenolsulfonphthalein (DIDNTB)-Farbstoff in einem Protein- Nachweisverfahren diskutiert, wobei die Verwendung von die Farbe verstärkenden Polymeren in einer Kombination mit den Reagenzien erwähnt ist. Spezifische Polymere, die genannt wurden, sind Polypropylenglycole, Poly(propylenethercarbonat) und Polyvinylether. Auch sind das als KOK 10.002 bezeichnete Polyethercarbonat von Bayer AG, ein Propylenoxid- und Ethylenoxid-Addukt von 1,6-Dimethyl-4-nonylphenol, erhältlich von Bayer AG unter dem Handelsnamen Fenoil D4030, und ein Polyvinylether, erhältlich unter der Bezeichnung Lutanol ISO von BASF, genannt.
• In US 5,124,266 ist die Verwendung eines Teststreifens für Protein in Urin beschrieben, wobei eine saugfähige Trägermatrix, die einen Proteinfehler-Indikator und einen Puffer enthält, mit einer polymerisierten Urethanbasierten Verbindung behandelt wird, um sich der Bildung von Hintergrund- Farbe zu widersetzen, um dadurch die Empfindlichkeit des Teststreifens zu verbessern.
• Die Verwendung von Polyvinylalkohol ist in Zusammenhang mit Protein- Tests auf Basis von Metall-Chelatier-Farbstoffen von Y. Fujiti in Bunseki Kagaku (32) 379-386 (1983) beschrieben worden. Diese Literaturstelle beschreibt Polyvinylalkohol und Polyvinylpyrrolidon als geeignete nicht- ionische oberflächenaktive Mittel zur Unicel-Bildung, irgendeine Erhöhung bei der Spezifität für besondere Proteine ist allerdings nicht angesprochen.
• Mehrere Studien bezüglich der Effekte langkettiger Alkylgruppen auf die Bindung von Proteinfehler-Indikatoren an Proteine sind durchgeführt worden. Die Effekte langkettiger Alkylcarbonsäuren, wie von Palmitinsäure, auf die Bindung von Proteinfehler-Indikatoren sind von Kragh-Hansen et al in Biophysics Acta, (365), 360-371 (1974) beschrieben worden. Bei Palmitat wurde gezeigt, dass es nur mässige Inhibitor-Effekte auf die Bindung von Phenyl-Rot an Albumin ausübt; weitere Proteine wurden nicht untersucht. Auf dieser Grundlage würde man von Alkylgruppen, seien sie langkettige oder sonstige, nicht erwarten, dass sie die Spezifität verändern.
• Weitere Studien haben gezeigt, dass langkettige Alkylsulfonsäuren, wie Natriumdodecylsulfat, die Bindung von Proteinfehler-Indikatoren beeinflussen. Arbeiten, die von Macart et al in Clinica Chimica Acta (144), 7-84 (1984) und von Perini et al in Clinica Chimica Acta (143), 321-323 (1984) beschrieben sind, zeigten, dass Natriumdodecylsulfonat die Unterschiede bei der Empfindlichkeit von Coomassie-Brilliant-Blau (CBB) gegenüber verschiedenen Proteinen ausglich und die Spezifität des Tests für Albumin herabsetzte, die Empfindlichkeit für irgendein weiteres Protein aber nicht erhöhte.
Zusammenfassung der Erfindung
• Die vorliegende Erfindung betrifft die halb-quantitative Analyse von Lysozym in einer wässrigen Testprobe, die ausgeführt wird, indem die Flüssigkeit, die unter dem Verdacht steht, Lysozym zu enthalten, mit einem Test-Reagens in Kontakt gebracht wird, das einen Proteinfehler-Indikator- Farbstoff umfasst, der eine nachweisbare Farbänderung eingeht, wenn er mit Protein in einer gepufferten Lösung in Kontakt gebracht wird. Es wird nun ein Verfahren offenbart, wobei man zum Test-Reagens eine Alkylsulfonsäure mit 9 bis 15 Kohlenstoffatomen oder ein Salz der genannten Sulfonsäure gibt, worin die Größe der Alkylgruppe und die Konzentration der Alkylsulfonsäure in der wässrigen Testprobe so beschaffen sind, dass die nachweisbare Farbänderung durch Lysozym in der Testprobe verursacht wird, jedoch eine nachweisbare Farbänderung durch Humanserumalbumin auf oder IgG oder durch weiteres urinäres Protein, welche in der Probe vorliegen bzw. vorhanden sind, nicht verursacht wird.
Beschreibung der Erfindung
• Gemäß der vorliegenden Erfindung ist herausgefunden worden, dass bestimmte Alkylsulfonsäuren und/oder Salze davon die Reaktion eines Proteinfehler-Indikators gegenüber Lysozym erhöhen und die Reaktion gegenüber Humanserumalbumin, IgG und weiteren urinären Proteinen herabsetzen. Da Humanserumalbumin in typischer Weise in Urin (obgleich normalerweise nur in kleinen Mengen) vorhanden ist, ergibt die erfindungsgemäße Verwendung der Alkylsulfonsäuren ein Verfahren zum Nachweis von Lysozym in Anwensenheit weiterer urinärer Proteine. Jene selektiven Inhibitoren, die die Proteinfehler-Indikator-Reaktion gegenüber Humanserumalbumin und/oder IgG zu inhibieren vermögen, wobei sie die Reaktion gegenüber Lysozym erhöhen, sind erwünschte Additive zu einem Reagens zur Bestimmung der Konzentration von Lysozym wegen der sich ergebenden Erhöhung der Spezifität für Lysozym, die solch ein System erbringt. Der Effekt der gemäß der vorliegenden Erfindung verwendeten Materialien ist nicht nur eine Inhibierung; sie erhöhen (aktivieren) auch die Lysozym-Reaktion. Jene Materialien, die in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, sind die geradkettigen oder verzweigten Alkylsulfonsäuren mit 9 bis 15 Kohlenstoffatomen, wobei Kettenlängen von 10 bis 12 Kohlenstoffatomen bevorzugt sind. Ebenfalls geeignet zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind Salze der Alkylsulfonsäuren. Diesbezüglich schließen geeignete Kationen, ohne darauf eingeschränkt zu sein, Natrium, Kalium, Lithium, Magnesium oder Calcium ein.
• Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist auf einen Analyse- Teststreifen zum Nachweis von Lysozym in Urin gerichtet, welcher einen absorbierenden Träger umfasst, der mit einem geeigneten Proteinfehler-Indikator, einem geeigneten Puffer und der Alkylsulfonsäure oder dem -sulfonat imprägniert ist. Geeignete Proteinfehler-Indikatoren schließen Tetrabromphenol-Blau (TBPB), das vorgenannte DIDNTB, Coomassie-Brilliant-Blau, Fast- Grün FCF, Light-Grün SF, Pyrogallol-Rot und Pyrocatechin-Violett ein. Ausserdem können das Merocyanin und die Nitro- oder Nitroso-substituierten polyhalogenierten Phenolsulfonphthaleine, die in US 5,279,790 offenbart sind, verwendet werden.
• Der absorbierende Träger des Teststreifens ist vorzugsweise Filterpapier. Weitere Materialien, die sich als absorbierender Träger eignen, schließen Filz, poröse Keramikstreifen und Vlies- oder mattierte Glasfasern wie die in US 3,846,247 beschriebenen ein. Ebenfalls geeignet sind Holz-, Tuch-, Schwammmaterialien und tonartige Substanzen wie die in US 3,552,928 beschriebenen. Alternativ dazu, kann der absorbierende Träger aus einem nicht-porösen Material, wie einem Polymerfilm oder Glas hergestellt sein.
• Zur Herstellung des Streifens wird der absorbierende Träger mit einer Lösung des Proteinfehler-Indikators, Puffers und des selektiven Inhibitors imprägniert. Diese Imprägnierung wird normalerweise durch ein Verfahren in zwei Tauchvorgängen durchgeführt, wobei der erste Tauchvorgang Wasser oder eine Mischung aus Wasser/polarem organischen Lösungsmittel umfasst, worin ein Puffer gelöst ist. Nach Trocknung wird der Streifen in eine zweite Lösung aus einem organischen Lösungsmittel getaucht, worin der Proteinfehler- Indikator, der in typischer Weise in einer Konzentration von 0,2 bis 5,0 mM vorhanden ist, und der Sulfonsäure- oder Sulfonat-Inhibitor gelöst sind.
• Nach Tauchen und Trocknen sind die Streifen gebrauchsfertig, wobei sie normalerweise in eine Urinprobe getaucht und die Reaktion abgelesen werden, die aus der Farbänderung im Indikator resultiert, wobei die Ablesung entweder händisch oder in einem Reflexionsspektrometer zur besseren Quantifizierung erfolgt.
• Der pH-Wert, bei dem der Assay durchgeführt wird, hängt vom besonderen Proteinfehler-Indikator-Farbstoff ab, der in der Reagens-Formulierung verwendet ist. Die Puffer, die am meisten kompatibel mit einem besonderen Farbstoff sind, sind bekannt oder können durch Routine-Versuche unmittelbar und ohne Weiteres ermittelt werden.
• Das Verfahren zur Durchführung der vorliegenden Erfindung wird nun noch weiter durch die vorliegenden Beispiele erläutert. Diese Beispiele und die darin enthaltenen Daten belegen die Erwünschtheit der oben beschriebenen Verwendung der Alkylsulfonsäuren oder -sulfonate, die Empfindlichkeit des Farbstoffbindungsverfahrens für Lysozym zu erhöhen, um dadurch den Wert urinärer Lysozym-Bestimmungen zu verstärken.
• Durch die vorliegende Erfindung wird ein Verfahren zur Bestimmung von Lysozym ohne eine durch weitere urinäre Proteine verursachte Interferenz bzw. Störung angegeben und zur Verfügung gestellt.
Beispiel I
• Das DIDNTB-Protein-Reagens wurde aus zwei Sättigungen von Ahlstrom 204-Filterpapier hergestellt. Die erste Sättigung erfolgte mit einem wässrigen Ethanol-Mix, enthaltend Weinsäure als Puffer und Methyl-Rot als Hintergrund-Farbstoff. Der pH-Wert des Mix wurde mit Natriumhydroxid und/oder Salzsäure auf 2,1 eingestellt. Die zweite Sättigung erfolgte mit einem Toluol/THF-Mix, enthaltend den Protein-Indikator-Farbstoff DIDNTB und Lutanol M40 [Poly(vinylether)] als Verstärker-Polymer. Funktion, Konzentration und zulässige Bereiche eines jeden Bestandteils sind in Tabelle 1 angegeben. Die Alkylsulfonsäure und -sulfonate können entweder zum wässrigen oder organischen Lösungsmittel-Mix in Abhängigkeit von den jeweiligen Löslichkeiten zugegeben werden. Tabelle 1 DIDNTB-Protein-Reagenszusammensetzung
• DIDNTB = 5',5"-Dinitro-3',3"-dijod-3,4,5,6- tetrabromphenolsulfonphthalein
• Am niedrigeren Ende des Konzentrationsbereichs wäre von den meisten Alkylsulfonsäuren/sulfonaten zu erwarten, dass sie wasserlöslich sind. Bei höheren Konzentationen sind im Fall komplexererer Alkylgruppen organische Lösungsmittel bevorzugt. Die Mix-Lösungen wurden angewandt, um das Filterpapier zu sättigen, das 7 min lang nach jeder Sättigung getocknet wurde. Die entstandenen Trocken-Reagenzien wurden zu Reagens-Streifen verarbeitet, die an einem CLINITEK-200+ -Gerät getestet wurden, nachdem sie in Urin getaucht worden waren, welcher entweder 0 oder 30 mg/dL Humarnserumalbumin (HSA) oder eine 80 mg/dL Mischung aus weiteren urinären Proteinen wie Tamm Horstall, α-1-Mikroglobulin, Glycoprotein, Tanserrin oder α-1-Glycoprotein sowie 300 mg/dL jeweils Lysozym und IgG enthielt.
• Die HSA-haltige Urinprobe wurde zuerst durch eine Ultrafiltrationsmembran unter Abschneiden eines 10 kDa Molekulargewichts filtriert, um natürlich vorkommendes HSA vor der Zugabe der 30 mg/dL HSA zu entfernen.
• Die gesamte Protein-haltige Urinprobe wurde unter Anwendung eines immunologischen HSA-Assay und des Coomassie-Briliant-Blau (CBB)-Verfahrens gesammelt, um 175 klinische Proben zu rastern, die ein zusammengefasstes ALBUSTIX -Ergebnis liefern. Vier Specimen aus den 175 wurden dahingehend identifiziert, dass sie weniger als 1,2 mg/dL Albumin, IgG und Lysozym gemäß immunobiologischen Assayverfahren aufwiesen. Die Urine wurden zusammengfasst und auf 40 oder 80 mg/dL Protein verdünnt. Die Reagens-Reaktion wurde an einem CLINITEK-200+ als Ergebnis der 1000 · Reflexion bei 610 nm/%-Reflexion bei 690 nm gemessen. Die Differenz zwischen negativen und Protein-haltigen Urinen wurde als die Protein-Reaktion herangezogen. Die Reaktion einer Vergleichsformel, worin Alkansulfonat fehlte, wurde mit der Zusammensetzung verglichen, die Alkansulfonat enthielt, um die Prozent- Änderung bei der Reaktion zu bestimmen und zu ermitteln. Die Daten aus diesem Versuch sind aus Tabelle 2 angegeben: Tabelle 2 Vergleich von Carbon- und Sulfonsäuren
• Aus Tabelle 1 ist ermittelbar, dass Sulfonsäuren mit einer Alkylgruppe aus Decan oder Dodecan wirkungsvoll sind, die Lysozym-Reaktion zu verstärken, wobei zugleich die Reaktion von HSA und der weiteren urinären Proteinen inhibiert wird. Aus diesen Daten kann man gut extrapolieren, dass geradkettige oder verzweigte Alkylsulfonsäuren, worin die Alkylgruppe C&sub9; bis C&sub1;&sub5; ist, wirkungsvoll sein würden, die Lysozym-Reaktion zu verstärken, wogegen diejenige von HSA und der weiteren Proteine inhibiert wird. Sulfonsäure oder ein Sulfoant mit einer C&sub1;&sub2;-Alkylgruppe wären bevorzugt. Die Reaktion des Reagens auf 15 mg/dL betrug 532 Decodes. Im Fall von IgG wurde eine verringerte Reaktion bei 300 mg/dL beobachtet. Keine nachweisbare Reaktion wurde bei 50 mg/dL IgG oder 40 mg/dL urinärem Protein beobachtet. Außer Alkansulfonsäure eignen sich C&sub9;-C&sub1;&sub5;-Alkansulfonat-Salze, in denen das Kation z. B. Na, K, Li, Mg oder Ca ist, zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung. Im Gegensatz dazu, inhibierten Alkylcarbonsäuren wie Hexadecan- und Decancarbonsäure das Lysozym, inhibierten aber nicht die Reaktion von HSA oder der weiteren urinären Proteine. Beim polymeren Additiv Poly(vinylsulfonsäure) wurde herausgefunden, dass es Lysozym nicht beeinflusst, wogegen es die HSA-Reaktion inhibiert.
Beispiel II
• Die Konzentration von Natriumdodecansulfonat, die benötigt wird, um wirkungsvoll zu sein, wurde wie oben beschrieben getestet, wobei die Ergebnisse in Tabelle 3 angegeben sind. Der Effekt wurde bei Konzentrationen von mehr als 0,8 mM oder 25% der Konzentration des DIDNTB-Indikators festgestellt. Der Effekt wurde durch überschüssiges Natriumdodecansulfonat nicht herabgesetzt, das den größten Vorteil bei 200% der Konzentration des DIDNTB-Indikators aufwies. Tabelle 3 Effekt der Konzentration von Natriumdodecansulfonat
Beispiel III
• Der Effekt von Natriumdodecansulfonat wurde mit dem weiteren oberflächenaktiven Mittel Surfonyl®-Polyethylenoxid von Air Products Corporation verglichen. Wie aus den in Tabelle 4 angegebenen Daten ermittelbar, konnte Surfonyl® zum Reagens-System als typisches oberflächenaktives Mittel gegeben werden, es wurde aber keine Verbesserung beim Nachweis von Lysozym festgestellt. Tabelle 4 Effekt der Konzentration von Natriumdodecansulfonat
• Die Oberflächenspannung von Lösungen, enthaltend Natriumdodecansulfonat oder Surfonyl®, wurde verglichen, wobei der Vergleich zeigte, dass, obwohl die Oberflächenspannung einer 0,5%-igen Surfonyl®-Lösung identisch mit der der 2,0 mM Dodecansulfonat enthaltenden Lösung war, es keine Inhibierung der Albumin-Reaktion gab, wodurch belegt wurde, dass der durch Natri umdodecylsulfonat erbrachte Effekt auf die Lysozym-Bestimmung nicht alleiniglich wegen seiner oberflächenaktiven Natur ausgeübt wird.

Claims (10)

1. Verfahren zur halb-quantitativen Analyse einer wässrigen Testprobe für Lysozym, wobei die Testprobe unter dem Verdacht steht, Lysozym sowie Humanserumalbumin und weitere Proteine zu enthalten, und wobei die Analyse durchgeführt wird, indem man die wässrige Testprobe, bei der der Verdacht besteht, dass sie die Proteine enthält, mit einem Test-Reagens in Kontakt bringt, das einen Proteinfehler-Indikator-Farbstoff und einen Puffer umfasst, wobei der Farbstoff eine nachweisbare Farbänderung eingeht, wenn er mit den Proteinen in Kontakt gebracht wird, wobei im Test-Reagens eine geradkettige oder verzweigte Alkylsulfonsäure, worin die Alkylgruppe 9 bis 15 Kohlenstoffatome enthält, oder ein Salz der genannten Sulfonsäure enthalten sind, wobei die Alkylsulfonsäure oder das -sulfonat die nachweisbare Farbänderung verstärken, die durch in der Testprobe vorhandenes Lysozym verursacht wird, um dadurch die Empfindlichkeit der Analyse zu erhöhen.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die wässrige Testprobe Urin ist.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die Alkylgruppe der n-Dodecyl-Rest ist.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin das Salz der Alkylsulfonsäure das Natrium-, Kalium-, Lithium-, Magnesium- oder Calciumsalz ist.

5. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin der Proteinfehler-Indikator- Farbstoff ein Merocyanin oder ein Nitro-/Nitroso-substituiertes polyhalogeniertes Phenolsulfonphthalein ist.

6. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin der Proteinfehler-Indikator- Farbstoff Tetrabromphenol-Blau, DIDNTB, Coomassie-Brilliant-Blau, Fast Grün FCF, Light Grün SF, Pyrogallol-Rot oder Pyrocatechin-Violett ist.

7. Analyse-Teststreifen zum Nachweis von Lysozym in einer wässrigen Testprobe, welcher einen absorbierenden Träger umfasst, der mit einem Proteinfehler-Indikator, einem Puffer und einer geradkettigen oder verzweigten Alkylsulfonsäure mit 9 bis 15 Kohlenstoffatomen oder mit einem Salz davon imprägniert ist.

8. Teststreifen gemäß Anspruch 7, worin die Alkylgruppe der Alkansulfonsäure oder des -sulfonats der n-Dodecyl-Rest ist.

9. Teststreifen gemäß Anspruch 7, worin das absorbierende Material Filterpapier ist.

10. Teststreifen gemäß Anspruch 7, worin der Proteinfehler- Indikator-Farbstoff Tetrabromphenol-Blau, DIDNTB, Coomassie-Brilliant-Blau, Fast-Grün FCF, Light-Grün SF, Pyrogallol-Rot oder Pyrocatechin-Violett ist.