DE1255353B

DE1255353B - Verfahren zur Herstellung eines Diagnostiziermittels zur Bestimmung von Eiweiss in biologischen Fluessigkeiten

Info

Publication number: DE1255353B
Application number: DEB79314A
Authority: DE
Inventors: Dr Rer Nat Hans-Georg Rey; Dr Rer Nat Peter Rieckmann
Original assignee: C F Bochringer & Soehne G M B
Current assignee: C F Bochringer & Soehne G M B
Priority date: 1964-11-13
Filing date: 1964-11-13
Publication date: 1967-11-30
Also published as: FI41878C; DE1255353C2; SE319027B; LU49806A1; GB1050880A; US3418079A; AT257053B; NL6514693A; BE672294A; FI41878B; DK113325B; FR1454187A; CH469266A

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND Int Cl.:

GOln

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

DeutscheKI.: 421-3/54

Nummer:
Aktenzeichen:
Anmeldetag:
Auslegetag:

1 255 353
B79314IXb/421
13. November 1964
30. November 1967

Der qualitative und quantitative Nachweis von Eiweiß in biologischen Flüssigkeiten, z. B. im Urin, hat eine große diagnostische Bedeutung, insbesondere bei Nierenerkrankungen, aber auch bei Kreislaufschwäche, Arteriosklerose, Hypertonie, Diabetes. Es ist eine Reihe von Methoden zum Nachweis von Eiweiß bekanntgeworden, z. B. die Sulfosalicylsäureprobe, Essigsäure-Kochprobe, Salpetersäure-Ringprobe, Pikrinsäureprobe; alle diese Methoden beruhen auf Fällungsreaktionen und sind ohne Laboratoriumsgeräte nicht durchführbar. Für schnelldiagnostische Zwecke kommen diese Reaktionen daher nicht in Betracht; hierfür benötigt man eine einfache Farbreaktion, welche auch durch ungeschultes Personal routinemäßig durchgeführt werden kann, z.B. mit Hilfe von Testpapieren.

Eine für den Eiweißnachweis geeignete Farb- _ reaktion wurde erstmals von F e i g 1 et al. (Mikrochim. Acta, 2, 1937, S. 107) beschrieben. Diese Reaktion nutzt den bei verschiedenen Indikatoren bekannten »Protein-Fehler« aus:

Wird der pH-Wert des Reagenzes unterhalb des Indikatorumschlagbereiches gehalten, so tritt bei Zugabe von Eiweißlösung eine Farbänderung ein, die vom pH-Wert unabhängig ist und durch den Eiweißgehalt bedingt wird; die Farbintensität der entstehenden Farbe ist abhängig von der Konzentration des Eiweiß in der zu prüfenden Lösung. Feigl arbeitete diesen Eiweißnachweis als Tüpfelreaktion aus, wobei er als Reagenzien das Kaliumsalz des Tetrabromphenolphthaleinäthylesters und Essigsäure verwendete. Zur Herstellung von Eiweißtestpapieren auf Basis der Feigl-Reaktion muß natürlich die Essigsäure durch eine nichtflüchtige Säure ersetzt werden; nach den Verfahren der britischen Patentschriften 814 223, 826 066 und 840 362 verwendet man hierfür zweckmäßig eine saure PufTersubstanz, wie z. B. Citratpuffer, sowie gewünschtenfalls oberflächenaktive Mittel. Die auf diese Weise erhaltenen Eiweißteststreifen befriedigen jedoch nicht völlig, da die Farbkontraste von negativer und positiver Eiweißprobe in Konzentrationsbereichen unterhalb von 0,1% Eiweiß sehr wenig differieren; der positive Test fällt mehr oder weniger stark gelbgrün aus, der negative Test ist grüngelb und ist dunkler gefärbt als der trockene Teststreifen. Auch läßt die Empfindlichkeit dieser Testpapiere einiges zu wünschen übrig (Nachweisgrenze etwa 0,03 bis 0,01% Eiweiß). Es ist für den Mediziner aber erforderlich, Eiweiß im Harn in derselben Verdünnung nachweisen zu können, wie es mit der Essigsäure-Kochprobe möglich ist; demnach müssen noch 0,005% Eiweiß Verfahren zur Herstellung

eines Diagnostiziermittels zur Bestimmung

von Eiweiß in biologischen Flüssigkeiten

Anmelder:

C F. Boehringer & Soehne G. m. b. H.,
Mannheim-Waldhof, Sandhofer Str. 112-132

Als Erfinder benannt:
Dr. rer. nat. Hans-Georg Rey,
Dr. rer. nat. Peter Rieckmann,
Mannheim-Waldhof

im Harn einwandfrei diagnostiziert werden können.

Bei dem Verfahren der obengenannten britischen Patentschriften wird der saugfähige Träger mit einer Lösung imprägniert, welche die Puffersubstanz zusammen mit dem Farbstoffindikator enthält. Aus der belgischen Patentschrift 642 648 ist bekannt, daß man wesentlich empfindlichere Eiweißtestpapiere erhält, wenn man die Puffersubstanz und den Farbstoffindikator getrennt, d. h. nacheinander auf den Träger aufbringt. Die hierbei erhaltenen Testpapiere sind schwach gelb gefärbt und geben mit eiweißhaltigem Urin kräftige Blaufärbungen, die entsprechend der Eiweißkonzentration abgestuft sind und sich deutlich von der gelben Färbung des negativen Testes abheben. Es können bis 0,005% Eiweiß einwandfrei nachgewiesen werden. Bei längerer Lagerung jedoch werden diese Eiweißteststreifen allmählich graustichig und verlieren dadurch an Empfindlichkeit. Außerdem beobachtet man an den bekannten Eiweißtestpapieren auch bei eiweißfreiem Harn gelegentlich schwach positive Reaktionen, was auf unbekannte Harnbestandteile zurückzuführen ist; zuweilen wird diese Fehlanzeige durch überhöhte Mengen von Kreatinin im Harn hervorgerufen.

Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß man sehr empfindliche und stabil gelbgefärbte Eiweißtestpapiere herstellen kann, die auch nicht zu Fehlanzeigen bei Anwesenheit unbekannter Harnbestandteile neigen, wenn die Testpapiere zusätzlich mit Lösungen anorganischer Sulfate imprägniert werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung eines Diagnostiziermittels zur Bestimmung von Eiweißin biologischen Flüssigkeiten, bestehend aus einem

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Farbstoffindikator, welcher den sogenannten »Protein- nol oder Äthanol als organischem Lösungsmittel

Fehler« aufweist, einer sauren Puffersubstanz und für den Indikatorfarbstoff gleichmäßig kräftig gelb-

gewünschtenfalls einem oberflächenaktiven Mittel gefärbte Papiere herstellen.

sowie einem saugfähigen Träger ist demgemäß Die erfindungsgemäß hergestellten, sehr empfinddadurch gekennzeichnet, daß man den saugfähigen 5 liehen und stabil kräftig gelbgefärbten Eiweißtest-Träger zusätzlich mit einer 1- bis 10%igen Lösung papiere, die auch nicht zu gelegentlicher positiver eines anorganischen Sulfates bzw. Gemischen der- Reaktion bei eiweißfreiem Harn neigen, gewähren selben in einem organischen Lösungsmittel imprägniert. eine erhöhte Sicherheit bei der Benutzung als diagno-Bevorzugte anorganische Sulfate sind Magnesium- stisches Mittel und vereinfachen durch den deutlicheren und/oder Zinksulfat. Bevorzugte Lösungsmitel sind- io Farbumschlag von Gelb nach Blau die praktische stark polare, leichtflüchtige Lösungsmittel, wie Meth- Anwendung dieses Diagnosticums,
anol oder Äthanol. In den nachstehenden Beispielen ist das erfindungs-

Als Farbstoffindikatoren kommen solche in Betracht, gemäße Verfahren näher erläutert,
die einen großen Eiweißfehler bei einem Indikatorumschlag in sauren pH-Bereich haben, insbesondere 15 Beispiell
Tetrabromphenolphthaleinäthylester und -butylester Filterpapier (Schleicher & Schüll Nr. 2316) wird sowie Tetrabrombenzaurin. Als Puffer ist grundsätz- zunächst mit einer Imprägnierlösung folgender Zu-Iich jedes Puffersystem einsatzfähig, das auf einen sammensetzung imprägniert und an der Luft getrocknet: pH-Wert unterhalb 7,0 eingestellt werden kann; <i _m/o„,„ _t-_N,r 11 1
vorzugsweise wird Citratpuffer, d.h. eine wäßrige *> J^es^ ^at nu mcitrat Um

vSder ^{Citronensäure und tert}-^Nat~^trat- T ^romUJZZ J₁S_g

Um die Saugfähigkeit der Testpapiere und damit Äthanol 50,0 ml

deren Reaktionsgeschwindigkeit und Empfindlichkeit Anschließend wird das Papier mit einer 5%igen

zu erhöhen, setzt man den Imprägnierlösungen 25 methanolischen Magnesiumsulfatlösung getränkt und

zweckmäßig eines der üblichen oberflächenaktiven erneut getrocknet.

Mittel zu. Brauchbare oberflächenaktive Mittel sind Das getrocknete Papier ist gelblich gefärbt und

z. B. Fettalkoholsulfonate, Alkylsulfonate, Poly- zeigt Eiweiß im Harn bis zu einer Konzentration von

carbonsäureestersulfonate. Besonders bewährt haben 0,01 % einwandfrei an. Das Papier ändert seine Farbe

sich bei den neuen Testpapieren stickstoffhaltige 30 aber nicht, wenn es mit eiweißfreiem normalem Urin,

anionenaktive Netzmittel, wie Fettsäuretauride, Fett- besonders auch mit stark kreatininhaltigem Urin,

säureglycide, Polycarbonsäure-alkylamidsulfonsäuren, befeuchtet wird. Die nicht mit Magnesiumsulfat

Alkylsulfonglycide und N-substituierte Fettamid- behandelten Papiere zeigen dagegen bei normalem,

sulfonate. eiweißfreiem Urin je nach Art des Urins gelegentlich

Die Herstellung der erfindungsgemäßen Diagno- 35 schwache Reaktionsfärbungen, ebenfalls bei kreatinin-

stiziermittel erfolgt in an sich üblicher Weise: Der haltigem Urin, was einen geringen Eiweißgehalt im

saugfähige Träger, z. B. Filterpapier, wird entweder Urin vortäuschen kann,

nach den Vorschriften der obengenannten britischen _ . . . .

Patentschriften mit einer Lösung imprägniert, welche Beispiel 2

die Puffersubstanz zusammen mit dem Farbstoff- 40 Filterpapier (Schleicher & Schüll Nr. 2316) wird

indikator enthält; nach der Trocknung wird das zunächst mit einer Pufferlösung folgender Zusammen-

Eiweißtestpapier üblicher Zusammensetzung mit einer setzung getränkt und dann an der Luft getrocknet:

1 bis 10%igen Sulfatlösung imprägniert und erneut _TprT N_{atrilimritrat} q _8ft »

getrocknet. Vorzugsweise wird jedoch nach der ritmnenSiiire ISOe

Vorschrift der belgischen Patentschrift 642 648 ver- 45 _Nat" rnlalirvknifatOOSff

fahren, d. h., man trägt zuerst die Puffersubstanz auf a™« Hamate pH inn η Jfl

und imprägniert dann erst mit der Indikatorfarbstoff- ^{q aBsaustd dQ iW}'^{u mi}

lösung, welche zusätzlich das Sulfat enthält. Die auf Anschließend wird das Papier mit einer Indikator-

diese Weise erhaltenen Eiweißteststreifen können lösung folgender Zusammensetzung getränkt und

als solche verwendet oder aber nach dem Verfahren 50 erneut getrocknet:

der belgischen Patentschrift 629 300 mit Kunststoff- TetrabromnhenolDhthaleinäthvlester 40 ms

folien eingesiegelt werden. Im letzteren Fall hat es S«hZ«Sf _aV S T

sich als zweckmäßig erwiesen, wenn man das Test- ^f_{hanol (oder} ^anolj_ad 100 ml

papier mit einem zweiten, nicht imprägnierten Papier- ^ c «uum )

streifen zusammen einsiegelt; hierdurch wird eine 55 An Stelle der magnesiumsulfathaltigen Lösung kann gleichmäßigere Färbung des Teststreifens bei Durch- auch eine zinksulfathaltige folgender Zusammenführung der Nachweisreaktion gewährleistet. setzung verwendet werden:

Bei dem Verfahren der belgischen Patentschrift Tetrabromphenolphthaleinäthylester 40 mg

642 648 ist die Auswahl eines geeigneten Lösungsmittels 1 OTdOTompnraoipnuwKanduiyiesier hu mg

für den Indikator von großer Bedeutung: wird hierfür 60 Methanol " ad 100 ml

Methanol oder Aceton verwendet, so erhält man ein ivieinano

Testpapier, das bei einer grünen Grundfarbe mit Das getrocknete Papier wird aufgerollt, und die

mehreren blauen Flecken durchsetzt ist; gleichmäßig Rollen werden quer auf die gewünschte Breite von

gelbgefärbte Eiweißtestpapiere erhält man nur bei 5 mm geschnitten. Die auf diese Weise erhaltenen

Anwendung von Halogenkohlenwasserstoffen als Lö- 65 Teststreifen sind gelblich gefärbt und ändern ihre Farbe

sungsmittel. Überraschenderweise lassen sich nun nach nicht, wenn sie mit eiweißfreiem Urin befeuchtet

dem Verfahren der vorliegenden Erfindung durch den werden. Eiweiß im Harn zeigt sich durch Blaufär-

Zusatz von Sulfaten auch bei Benutzung von Metha- bungen, die je nach Eiweißgehalt abgestuft sind.

Claims

So kann Eiweiß im Harn bei einer Konzentration von 0,005 °/o noch nachgewiesen werden. Beispiel 3 Filterpapier (Schleicher & Schüll Nr. 2316) wird zunächst mit einer Pufferlösung folgender Zusammensetzung getränkt und dann an der Luft getrocknet: Tert.Natriumcitrat 9,80 g Citronensäure 3,50 g Natriumsalz eines Fettsäuremethyl- glycids (»Medialan KA, konz.«) 0,05 g Destilliertes Wasser ad 100,0 ml Anschließend wird das Papier mit einer Indikatorlösung folgender Zusammensetzung getränkt und erneut getrocknet: Tetrabromphenolphthaleinäthylester 40 mg Magnesiumsulfat 5 g Methanol ad 100 ml 20 Man erhält so ein gelbgefärbtes Testpapier, das seine Farbe bei eiweißfreiem Urin nicht ändert und bei Eiweiß im Harn je nach Eiweißgehalt abgestufte Blaufärbungen anzeigt. Es läßt sich bis zu einem Gehalt von 0,001% Eiweiß im Harn noch eine a5 Farbreaktion einwandfrei beobachten. Die Stabilitätsprüfung der nach den Beispielen 1, 2 und 3 hergestellten Eiweißtestpapiere wurde durchgeführt, indem man die Testpapiere 12 Wochen bei 40° C lagerte. Sie zeigten gegenüber Mustern, die bei Raumtemperatur gelagert wurden, keine Unterschiede im Aussehen und in der Reaktionsempfindlichkeit; die gelbe Farbe blieb unverändert. Demgegenüber verfärbten sich Eiweißtestpapiere, die ohne die Verwendung von Sulfaten hergestellt wurden, schon nach kurzer derartiger Lagerung von Gelb nach Grau. Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung eines Diagnostiziermittels zur Bestimmung von Eiweiß in biologischen Flüssigkeiten, bestehend aus einem Farbstoffindikator, welcher den sogenannten »Protein-Fehler« aufweist, einer sauren Puffersubstanz und gewünschtenfalls einem oberflächenaktiven Mittel sowie einem saugfähigen Träger, dadurch gekennzeichnet, daß man den saugfähigen Träger zusätzlich mit einer 1- bis 10°/₀igen Lösung eines anorganischen Sulfats bzw. Gemischen derselben in einem organischen Lösungsmittel imprägniert.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als anorganisches Sulfat Magnesium- und/oder Zinksulfat verwendet.

3. Verfahren gemäß Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als organisches Lösungsmittel Methanol oder Äthanol verwendet.

4. Verfahren gemäß Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als oberflächenaktive Mittel stickstoffhaltige, anionenaktive Netzmittel verwendet.