DE2623087C3

DE2623087C3 - Teststreifen zum Nachweis von Bilirubin

Info

Publication number: DE2623087C3
Application number: DE19762623087
Authority: DE
Inventors: Wolfgang Dr. 3050 Wunstorf Hirsch
Original assignee: Behringwerke AG
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany
Priority date: 1976-05-22
Filing date: 1976-05-22
Publication date: 1979-06-21
Also published as: DE2623087A1; DE2623087B2

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Teststreifen zum Nachweis von Bilirubin, bestehend aus einem saugfähigen Träger, der mit einer oder mehreren Diazoniumverbindungen, Puffersubstanzen und gegebenenfalls Zusatzstoffen wie z. B. Stabilisatoren, optischen Aufhellern oder auch Verdickungsmitteln imprägniert ist

Der Nachweis von Bilirubin in Serum bzw. Urin wird seit langer Zeit zur Diagnostik der Leber- und Gallenerkrankungen verwendet In der alten Form des Nachweises hat man die Reaktion der Diazobenzolsulfonsäure mit Bilirubin zu dem farbigen »Azobilirubin« ausgenutzt. In neueren Veröffentlichungen werden als Reagenzien aber auch verschieden substituierte Benzoldiazoniumsalze. z. B. diazotierte 2,4- oder 2,5-Dichloraniline verwendet (DE-PS 21 10 658). die entweder einen höheren molaren Extinktionskoeffizienien oder eine größere Farbstabilität als Diazobenzolsulfonsäure aufweisen.

Als diagnostische Mittel haben Schnelltests eine immer größere Bedeutung in der medizinischen Diagnostik gewonnen. Es ist ein Test beschrieben worden (DE-PS 11 02 444), bei dem eine Tablette, die die für die Reaktion nötigen Reagenzien enthält, auf einer SpezialUnterlage mit der zu untersuchenden Flüssigkeit versetzt wird. Das Vorliegen Von Bilirubin wird dann durch Erscheinen eines bläuen Fleckes oder Ringes angezeigt.

Vor einiger Zeit sind auch Testpapiere beschrieben worden (DE-AS 2007 013. DE-OS 22 40471. DE-OS 23 64 844, DE-OS 22 40 357, DE-OS 24 32 754), die es gestatten, durch Eintauchen des Papiers in die LIntersuchungsflüssigkeit und anschließenden Vergleich des Farbumschlages mit einer Farbskala den Gehalt an Bilirubin in Serum oder Urin qualitativ abzulesen.

Diese Testpapiere stellen gegenüber den Küvettentests bei Serum- und Urinuntersuchungen eine erhebliche Vereinfachung dar, weil häufig die semiquantitativen Angaben, die man mit den Teststreifen erhält, für

ίο eine Diagnose bzw. eine Screening-Untersuchung genügen. Erst mit Hilfe der Teststreifen ist die Untersuchung breiter Bevölkerungsschichten möglich geworden, da die Untersuchungen entweder mit Hilfe nicht ausgebildeter Kräfte oder auch von den Untersuchungspersonen selbst durchgeführt werden können.

Die herkömmlichen Teststreifen besitzen jedoch für eine breite Anwendung entscheidende Nacn.eile. So zeigen mit den bisher bekannten Teststreifen die natürlichen Harninhaltsstoffe Indoxylessigsäure bzw. Indoxylsulfat im Normalbereich und insbesondere im angrenzenden Verdachtsbereich rote bis braunrote Färbungen, die das Vorhandensein von Bilirubin vortäuschen bzw. überdecken körnen. Außerdem bedingt die natürliche Gelbfärbung des Urins eine Herabsetzung der Empfindlichkeit da die mit Bilirubin gebildeten blauen (DE-PS 22 40 471) bis violetten Färbungen hierdurch nach den Gesetzen der Farbenlehre abgeschwächt werden. Die Vorteile der einfachen Handhabung der Teststreifen gegenüber den spezifischen Küvettentests werden somit vermindert wenn nicht gar aufgehoben.

Aufgabe der Erfindung ist daher die Schaffung eines Teststreifens zur Bestimmung von Bilirubin in Urin bzw.

J5 Serum, der weitgehend spezifisch ist, d. h. dessen Anzeige durch die natürlichen Harninhaltsstoffe Indoxylessigsäure bzw. Indoxylsulfat nicht gestört wird.

Es ist bekannt (Biologie der Gallenfarbstoffe, T. K. With. Thieme Verlag 1960, S. 148 f), daß für die schnelle Reaktion von Bilirubin mit Diazoniumverbindungen ein stark saurer pH-Wert von entscheidender Bedeutung ist Demgemäß werden für die bekannten Testpapiere Puffergemische mit einem pH-Wert von 1,2—1,8 verwendet Bei diesen pH-Werten reagieren aber die natürlichen Harninhaltsstoffe Indoxylsulfat und Indoxylessigsäure mit der Diazoniumverbindung zu rot bis rotbraun gefärbten Verbindungen, die zu den erwähnten Störungen des Bilirubin-Nachweises führen.

Aus der US-PS 38 14 586 sind auch bereits Teststreifen zum Nachweis von Bilirubin und Urobilinogen nebeneinander bekannt, in denen Säureverbindungen verwendet werden, die in einer Konzentration von 0.1 N einen pH-Wert von unter 3.0 ergeben. Dadurch wird erreicht, daß die verwendeten Azokomplexe für die praktische Ausführbarkeit des Tests genügende Stabilität und geeignete Extinktionskoeffizienten aufweisen. Jedoch reagieren auch bei den so eingestellten pH-Werten die Azokomplexe noch mit den natürlichen Harninhaltsstoffen, wiez. B. Indoxylsulfat.

Es wurde nun gefunden, daß die Geschwindigkeit der Reaktion von Diazoniumverbindungen mit Indoxylsulfat und Indoxylessigsäure in hohem Maße von pH^Wert abhängig ist So gibt es für viele Diazoniumsalze einen pH'Bereich, bei dem mit Indoxylsulfat bzw. Indoxylessigsäure keine bzw. riuf schwach gelbe Färbungen auftreten, während außerhalb dieses Bereichs rote bis gelbbraune Farbstoffe gebildet werden. Da diese pH-Bereiche zum Teil deutlich höher liegen als die der

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bisher verwendeten Puffergemische, war eine Verschlechterung der Reaktion der Diazoniumverbindungen mit Bilirubin zu erwarten.

Die genannte Aufgabe konnte nun überraschenderweise dadurch gelöst werden, daß bei Tejtstreifen der eingangs definierten Gattung durch Puffersubstanzen ein pH-Wert eingestellt wird, der so weit zum Alkalischen hin liegt, daß die verwendete Diazoniumverbindung praktisch nicht mehr mit den natürlichen Harninhaltsstoffen reagiert, und der noch so weit im Sauren, aber nicht unter pH 3 liegt, daß die verwendete Diazoniumverbindung noch mit Bilirubin reagieren kann. Es wurde gefunden, daß derartige Teststreifen hervorragend zum Nachweis von Bilirubin brauchbar sind.

Trotz der in »Biologie der Gallenfarbstoffe« offenbarten Lehre ist die Reaktionsgeschwindigkeit der Diazoniumverbindungen auch in pH-Gebieten außerhalb pH 1,2—1,8 groß genug, um schnell ansprechende Teststreifen zu ermöglichen. Sie weisen darüber hinaus den Vorteil auf. daß das Absorptionsmaximum des Farbstoffs, der mit Bilirubin gebildet wird, eine hypsochrome Verschiebung (von blau bzw. blauviolett nach rot) erfährt und die Anzeige somit weniger durch die gelbe Eigenfarbe des Urins beeinträchtigt wird.

Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Testpapiere werden die nachfolgend beschriebenen Komponenten in einem Lösungsmittel, beispielsweise Wasser, gelöst und der entsprechende pH-Wert eingestellt Mit dieser Lösung wird ein geeignetes Papier getränkt und anschließend getrocknet Sollte es erforderlich sein, können die einzelnen Bestandteile auch nacheinander auf das Papier aufgebracht werüen.

Als Diazoniumverbindungen für das erfindungsgemäße Testpapier können insbesondere dit Verbindungen I—IV verwendet werden. Jedoch können auch andere Diazoniumverbindungen, die mit Bilirubin eine Reaktion eingehen, eingesetzt werden.

N-,BRt

O (Π)

Cl CI

N₂BF₄

(III)

F₃C

CT₁

Tabelle I

(IV)

Als Puffersubstanz kommen anorganische und/oder

ίο organische feste Säuren wie z. B. Metaphosphorsäure, Zitronensäure und Oxalsäure in Frage, die mit einer Base, z.B. NaOH auf den entsprechenden pH-Wert eingestellt werden. Der pH-Wert der Puffermischung ist für jede Diazoniumverbindung im Sinne der Erfindung zu optimieren. Es ist für den Fachmann jedoch verständlich, daß ein pH-Wert von 5—6 nicht überschritten werden sollte, um noch ausreichend stabile Testpapiere zu erhalten.

Stabilisatoren, wie z.B. Naphthalin-1,5-disulfonsäure oder auch andere aromatische Sulfonsäuren können dem Testpapier ggf. zugesetzt werden.

Netzmittel, wie z. B. Dodecylbenzolsulfonsäure, ergeben ein gleichmäßiger anfärbendes Testpapier und können die Reaktionsgeschwindigkeit beeinflussen.

Gegebenenfalls können auch noch Verdickungsmittel, ζ. B. zur Verbesserung des Ausblutverhaftens,- und optische Aufheller zur An yendung kommen.

In den folgenden Beispielen soll die Erfindung erläutert werden.

Beispiel 1

Es wird eine Lösung aus

10 g meta-Phosphorsäure
3 g Zitronensäure
7 g Naphthalin- 1,5-disulfonsäure-

Dinatriumsalz

0,5 g Dodecylbenzolsulfonsäure
0,1 g optischer Aufheller
0,4 g 2-TrifluormethyIdiazoniumtetra-

fluoroborat (I)

in 90 ml Wasser hergestellt.

Der pH-Wert der Grundlösung beträgt 1,3. Durch Versetzen mit 3% wäßriger Natronlauge werden aus dieser Grundlösung Lösungen mit folgenden pH-Werten hergestellt:

1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3.5; 4.0; 4,5; 5,0; 5,5.

Papier 2316 der Fa. Schleicher und Schüll wird in diesen Lösungen getränkt und anschließend getrocknet Die Reagenzpapiere zeigen mit einer 1 mg Bilirubin/

100 ml enthaltenden Lösung, einer 2 mg Indoxylessigsäure/lOOml enthaltenden Lösung und einer 4 mg Indoxylsulfat/lOOml enthaltenden Lösung die in der Tabelle 1 gegebenen Farbwerte. Diese Konzentrationen an Indoxylsulfat und Indoxylessigsäure sind im Urin im Verdachtsbereich enthalten.

Reaktionsfarbe mit Bilirubin blaurot blaurot blaurot bis rot rot rot

ReaktiorisFarbe mit Indoxylessigsäure rot rot rot rot bis gelb gelb

Reaktionsfarbe mit Indoxylsulfat rot rot rot rot rot bis eclb

pH-Wert des Reagenzpapiers

I,^ ¹J '"	5 Tabelle 1 (i'ortset/unp)	26 23 087	6	5,5 1
1 4		pH-Wert des Reagenzpapiers 3,5 4,0 4,5	5.U	rot I rot j gelb j i
ι	Reaklionsfarbe mit Bilinibin ReaktionsfHrbe mit Indoxylessigsäure Reaktionsfarbe mit Indoxylsulfat	rot rot rot gelb rotgelb rot gelb gelb gelb	rot rot gelb

Der optimale pH-Wert Hegt nach Tabelle 1 bei pH Tabelle 2
3,5, da mit beiden Störsubslanzen nur schwachgelbe

Färbungen erhalten werden, die die rote Reaktionsfarbe 15 Verbindung Optimaler

mit Bilirubin nicht beeinträchtigen. pH-Wert

Beispiel 2 3,5-Dichlorbenzoldiazoniumtetra- 3,0

Ähnlich störungsfreie und empfindliche Reagenzpa- 20 _ _

piere erhält man, wenn man anstelle der Diazoniumver- 3,5-Bis-tritIuormethyibenzoldiazonii_,Ti- 3,0

bindung I in der Grundlösung aus Beispiel 1 gleiche tetrafluoroborat (III)

Mengen folgender Diazoniumverbindungen einsetzt S^-Bis-trifluormethyM-chlorbenzol- 4,0

und den pH-Wert folgendermaßen einstellt: diazoniumtetrafluoroborat (IV)

Claims

Patentansprüche:

1. Teststreifen zum Nachweis von Bilirubin bestehend aus einem saugfähigen Träger, der mit einer oder mehreren Diazoniumverbindungen, Puffersubstanzen und gegebenenfalls Zusatzstoffen wie z. B. Stabilisatoren, optischen Aufhellern oder auch Verdickungsmitteln imprägniert ist, dadurch gekennzeichnet, daß durch die Puffersubstanzen ein pH-Wert eingestellt wird, der so weit zum Alkalischen hin liegt, daß die verwendete Diazoniumverbindung praktisch nicht mehr mit den natürlichen Harninhaltsstoffen reagiert, und der noch so weit im Sauren, aber nicht unter pH 3 liegt, daß die verwendete Diazoniumverbindung noch mit Bilirubin reagieren kann.

Z Teststreifen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß bei Verwendung der Diazoniumverbindung 2-Trifluormethyl-diazoniumtetrafluoroborat (I) der pH-Wert des Puffers 3,5 beträgt

3. Teststreifen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß bei Verwendung der Diazoniumverbindung 3,5-DichIorbenzoldiazoniumtetrafluoroborat (II) der pH-Wert des Puffers 3,0 beträgt

4. Teststreifen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß bei Verwendung der Diazoniumverbindung 3,5-Bis-trifluormethylbenzoldiazoniumtetrafluoroborat (III) der pH-Wert des Puffers 3,0 beträgt

5. Teststreifen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß bei Verwendung der Diazoniumverbindung S^-Bis-trifluoromethyl-'l-chlorbenzoyiazoniumtetrafluoroborat (IV) der pH-Wert des Puffers 4,0 beträgt