DE2240471C3 - Testpapier zum Nachweis von Bilirubin in Körperflüssigkeiten - Google Patents

Description

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ten Schwierigkeiten nicht mehr auf, auch wenn man Zur Herstellung des erfindungsgemäßen Testpapiers

gleichzeitig Aklivatoren zugibt. Man erhalt Test- wird ein saugfilhiger Träger, vorzugsweise Filter-

streifen, die sowohl im Harn als auch im Serum selektiv papier, mit einer Losung getränkt, die 0,01 bis 2,0 g,

reagieren. vorzugsweise 0,05 bis 0,5 g (pro 100 ml), eines Diazo-

EsisUwarausderSchweizerPatentschriftNr.512072 5 niumsalzes gemäß der allgemeinen Formell, sowie

ein Verfahren zur Bestimmung des Bilirubin-Gehaltes 3 bis 20 g, vorzugsweise 5 bis 15 g (pro 100 ml), eines

in Serum mit Hilfe von in I- oder 4- bzw. in 2,4- oder Phosphorsäurediesters gemäß der allgemeinen For-

2,6-StelIung substituierten Diazoniumsalzen bekannt. mel II und 2 bis 30 g einer festen anorganischen oder

Das aus diesen mit Bilirubin entstehende Produkt muß organischen Säure enthält, und anschließend getrock-

jedoch erst in ein alkalisches Milieu überführt werden, >o net. Es ist jedoch auch möglich, die Diazotierung in

bevor es auswertbar ist. Da (für den Fachmann er- der Tränklösung oder auf dem Papier vorzunehmen,

sichtlich) eine Veränderung des pH-Wertes bei einem In diesem Fall geht man von dem betreffenden Amin

Teststreifen, wie er erfindungsgemäß hergestellt werden aus, das in an sich bekannter Weise mit einem Nitrit

soll, unmöglich !si, ist aus dieser Schweizer Patent- umgesetzt wird.

schrift höchstens die L^hre abzuleiten, daß solche Di- 15 Als Lösungsmittel bzw. Lösungsmittelgemische für

azoniumsalze für Teststreifen nicht verwendbar sind. die Imprägnierung kommen alle diejenigen in Frage,

Irn übrigen ist aus dieser Patentschrift eine Überlegen- die nicht mit Diazoniumsalzen reagieren, in denen alle

heit der in 2-und 6-SteIlung substituierten Diazonium- Bestandteile löslich sind und die einen niedrigen

salze gegenüber anders substituu ten Diazoniumsalzen Siedepunkt besitzen, damit die Diazoniumsalze beim

nicht beschrieben, so daß aus dieser Palentschrift auch 20 Trocknen nicht zu hohen Temperaturen ausgesetzt zu

nicht auf die überlegene Wirkung dieser kleinen werden brauchen. Ls hat sich auch bewährt, einzelne

Gruppe von Diazoniumsalzen bei ihrer Verwendung Bestandteile in getrennten Arbeitsgängen zu im-

als Testreagenzien auf Teststreifen geschlossen werden prägnieren. So wird beispielsweise das Gemisch aus

kann. Diazoniumsalz und Metaphosphorsäure aus Wasser

Die Diazoniumsalze der Formel I sind sämtlich be- 25 vorimprägniert und mit Phosphorsäurediphenyiester kannt oder körnen aus bekannten aromatischen Li E°sigester oder Chloroform nachimprägniert.
Aminen durch Diazotierung hergestellt werden. Unter Als saugfähige Träger kommen vor allen Dingen niederen Alkyl- bzw. Alkoxygruppen werden Reste Filterpapiere in Frage, aber auch andere saugfähige mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen verstanden. Die Diazo- Träger wie Glasfaserpapiere, Kunstfasergewebe und niumsalze I werden zweckmäßigerweise als Fluoborate 30 -vliese aus säurefesten Fasern wie Polyester und Polyeingesetzt, deren Stabilität bekannt ist; andere stabile propylen sind geeignet. Der Begriff »Testpapiere soll Salze wie Arylsulfonate, speziell Naphthalin-l,5-disul auch diese Materialien umfassen,
fonate, sind ebenfalls brauchbar. Bevorzugt werden Da die als Aktivatoren verwendbaren bekannten Diazoniumsalze der allgemeinen Formel I, in welcher Phosphorsäurediester der allgemeinen Formel II (vgl. Ri und R₂ ein Halogenatom, insbesondere Chlor-oder 35 Method, d. Org. Chem. Houben — Weyl, Bromatom, und die übrigen Reste ein Wasserstoff- Bd. XI1/2 226 ff.) selbst sauer reagieren, können sie die atom bedeuten. für die Kupplungsreaktion nötige Säure zumindest

Das erfindungsgemäße Testpapier kann zusätzlich teilweise ersetzen. Meist sind jedoch zusätzliche Säure-

auch einen Aktivator enthalten. Hierfür eignen sich zugaben erforderlich. Hierfür kommt eine ganze Reihe

neben anionischen Netzmitteln besonders Phosphor- 40 von festen Säuren in Frage. Bewährt haben sich vor

säurediester der allgemeinen Formel II allem Oxalsäure, Zitronensäure, Kaliumbisulfat und

insbesondere im Hinblick auf die Stabilität des Diazo-

R₅ — O O niumsalzes die käufliche Metaphosphorsäure, die etwa

60% ihres Natriumsalzes enthalten kann.

/P (II) *5 Das erfindungsgemäße Testpapier reagiert mit bili-

_{R o OH} rubinhaltigem Urin nach etwa 5 bis 30 Sekunden mit

K₆ υ Uli _roten J₁J₅ jjj_auen Farbtönen. Mit Normalurinen erhält

man gelbe Reaktionsfarben. Urobilinogen reagiert

in welcher R₅ und R₆ einen gegebenenfalls substi- ohne zu stören mit gelber Farbe, wobei Rottöne nur

tuierten aliphatischen, cycloaliphatischen, araliphati- 50 auftreten, wenn es in ungewöhnlich großen Mengen

sehen oder aromatischen Rest bedeuten. (mehr als etwa 8 bis 10 mg%) im Urin enthalten ist.

Das erfindungsgemäße Bilirubin-Testpapier kann Der Nachweis von Serumbilirubin ist mit dem erfin-

weiterhin Stabilisierungsmittel für Diazoniumsalze dungsgernäßen Testpapier selbstverständlich ebenfalls

enthalten, wie z. B. Natriumfluoborat, Magnesium- möglich.

sulfat, Natriummetaphosphat, Arylsulfonate und an- 55 Die Erfindung soll an Hand der nachstehenden Bet-

dere. spiele näher erläutert werden:

Des weiteren können Netzmittel enthalten sein, um

die Saugfähigkeit des Testpapiers zu verbessern. Es Beispiell
kommen prinzipiell alle Netzmittel in Frage, die in dem

stark sauren Milieu nach dem Eintauchen in die 60 Filterpapier wird mit folgenden Lösungen nachein-

Körperfiüssigkeit noch oberflächenaktiv sind, und ander imprägniert und bei 4O⁰C getrocknet:
zwar kationische (z. B. Laurylpyridiniumchlorid),

nichtionogene (z. B. Polyoxyäthylen-triglycerid) und Lösung I:

von den anionischen besonders die Sulfonate und SuI- 2,6-DichIorbenzoldiazoniumfluo-

fate (z. B. Dodecylbenzolsuifonat). Letztere können 65 borat 0,08 g

zusätzlich aktivierende Eigenschaften besitzen. Metaphosphorsäure 10*0 g

Die Netzmittel werden in Konzentrationen von Zitronensäure 3,0 g

0,1 bis 2%, vorzugsweise 0,2 bis 0,5%, eingesetzt. destilliertes Wasser ad. 100,0 ml

5 6 j

Lösung II: Zitronensäure 10,0 g j

Phosphorsäurediphenylester 5,0 g Natriummetaphosphat 3,0 g ■

Dodecylbenzolsulfonsäure, Na-SaIz 0,4 g Wasser, dest ad, 100,0 ml j

Essigester ad, 100,0 ml , . .„..

5 Dieses Papier wird mit einer 5%igcn Losung von

Beim Eintauchen in bilirubjnhaltjgen Urin erhält Phosphorsäurediphenylester in Essigester nachimpriiman je nach Konzentration nach etwa 10 bis 20 Sekun- gniert, j den rote bis violettrote Färbungen der Testpapiere; Die Eigenschaften dieses Testpapiers, sowie von | die Empfindlichkeitsgrenze liegt bei etwa 0,1 bis Testpapieren mit äquimolaren Mengen von Diax - · 0,3 mg% Bilirubin. Mit Normalurin erhält man gelbe *o niumsalzen der nachfolgenden Tabelle I, entsprechen Färbungen, desgleichen mit Urobilinogen-haltigern im wesentlichen denen von Beispiel 1. Die Reaktions-Urin. Enthält der Urin mehr als etwa 8 bis 10mg%, farben mit Bilirubin sind bei den Halogenalkyl-Verso geht diese Gelbfärbung nach etwa 1 Minute lang- bindungcn mehr blauviolctt; bei den Alkoxy- bzw, sam in eine Rotfärbung über. Nitroverbindungen mehr graublau.

Mit bilirubinhaltigem Serum erhält man rotviolette 15

Färbungen mit steigender Intensität, wobei die Emp- Tabelle I
findlichkeitsgrenze bei etwa 0,4 bis 0,6 mg% liegt.

In analoger Weise reagieren Testpapiere, welche 2-Methyl-4,6-dibrombcnzoIdiazoniumiluoborat

2,6-Dibrombenzoldiazoniumfluoborat enthalten. 2-Methyl-4-chlor-6-brornbenzoIdiazoniumfluoborat

Testpapiere analoger Zusammensetzung, die jedoch 30 2-Methyl-4-brom-6-chlorbenzoidiazoniumfluoborat

2,4-DichlorbenzoIdiazoniumfluoborat enthalten (vgl, 4-Methyl-2,6-dibrombenzoldiazoniumfluoborat

deutsche Offenlegungsschrift 2 007 013) reagieren mit 4-Äthyl-2,6-dibrombenzoldiazoniumfluoborat

Bilirubin mit blauer Farbe. Mit urobilinogenhaltigem 4-Methyl-2,6-dijodbenzoldiazoniumfluoborat

Urin weisen diese schon nach wenigen Sekunden eine 2,6-Dimethyl-3-nitrobenzoldiazoniumlluoborat

tiefe violette Färbung auf. 25 2-Äthoxy-4,6-dibrombcnzoldiazonium3uoborat

. .|₀ 4-Methoxy-2,6-dibrombenzoldiazoniumfluoborat

Beispiel 2 2,6-Dimethoxy-3₎5-dibrombenzoldiazoniumfluoborat

Testpapiere, die denen im Beispiel 1 beschriebenen 2,6-Dimethoxy-4-nitrobenzoIdiazoniumfluoborat

analog reagieren, erhält man, wenn man den Phosphor- 2,5-Dimethyl-4,6-dibrombenzoldiazoniumfluoborat

säurediphenylester durch folgende Phosphorsäureester 30

ersetzt: Beispiel 5

Phosphorsäure-di-O'tolyl-ester, ■*.-,. «_nB^ ■ j · τ·· »ι j ?

Phosphorsäure-di-p-tolyi-ester ^{Bei 5 bis 1}J? ^C.^wird,.^eine \⁰^ *^olß^{ender Zusam}:

Phosihorsäure-bis-3,5-xylyl-ester, mensetzung bere.tet die auf Filterpapier impragn.ert

Phosphorsäure-bis-o-chlorphenyl-ester, ³* ™^{d bei 40 C} getrocknet wird:

Phosphorsäure-bis-p-chlorphenyl-ester, 2-Methyl-6-chloranilin 0,14 g

Phosphorsäure-bis-p-nitrophenyl-ester, Natriumnitrit 0,07 g

Phosphorsäure-dicyclohexyl-ester, Metaphosphorsäure 10,0 g

Phosphorsäure-dipentylester. _q Wasser, dest. ad. 100,0 ml

Beispiel 3 Dieses Testpapier wird mit einer 10%igen Lösung

Filterpapier wird mit einer Lösung folgender Zu- Phosphorsäure-diphenylester in Essigester nachimprä-

sammenseizung imprägniert und bei 40⁰C getrocknet: Sⁿⁱ'^{ert und bei 4}O⁰C getrocknet.

η, T^- ti t υ· · α Analoge Testpapiere kann man mit äquimolaren

b?rat ^aZOr<IUm 016 45 Mengen folgender Aniline herstellen:

Metaphosphorsäure 15,0 g 2,6-Dimethyl-3-bromanilin,

Dodecylbenzolsulfonsäure, 2,6-Dimethyl-4-bromanilin,

Natriumsalz 1,0 g 2,6-Dimethoxy-3-bromanilin,

Methanol 20,0 ml 2,6-Dimethoxy-4-chloramIin.

Wasser, dest ad. 100,0 ml ' _{Die Ligenschaü}^_{n der} Testpapiere entsprechen In

Dieses Testpapier reagiert nach 20 bis 30 Sekunden etwa denen der Beispiele 1 und 4.

mit violetter Farbe mit bilirubinhaltigem Urin (Emp- . _ . , ,

findlichk-it etwa 0,7 bis 0,9 mg%). Mit stark urobili- rf c 1 s ρ 1 e 1 ö

genhaltifecm Urin (etwa 8 bis 12 mg) tritt nach etwa 55 Filterpapier wird mit einer Lösung folgender Zu-

1 bis 2 Minuten eine schwache Rotfärbung auf. sammensetzung imprägniert und bei 40⁰C getrocknet;

Ein Testpapier gleicher Zusammensetzung, welches „ . , _ . ,, , ,,.

2,4-Dichlorbenzüldiazoniumfluoborat enthält, reagiert 2,4,6-Tnchlorbenzoldiazonium-

mit Bilirubin mit blauvioietter Farbe, mit urobilmogen- toiuolsultonat u,j g

haltigem Urin tritt bereits nach kurzer Zeit eine stö- 60 Metaphosphorsäure 10,0 g

rende Violettfärbung ein. ^Wasser' ^{dest ad}· ^1OÖ'° ^ml

. , Dieses Papier wird mit einer 10%igen Lösung von

Beispiel 4 handelsüblicher i-Octylphosphorsäure in Methylen-

Ρ'ίΗεφ3ρίεΓ wird mit einer Lösung folgender Zu- chlorid nachimprägniert. Diese Säure ist ein Gemisch

sammensetzung imprägniert und bei 4O⁰C getrocknet: 65 aus etwa 55% Diester und 45% Monoester der Phosphorsäure mit isomeren Cg-Alkoholen.

2-Mclhoxy-4,6-dibrombenzoi- Die Ligenschaften dieses Testpapiers entsprechen

dia7oniumfluoborat 0,12 g denen von Beispiel 1.

Praktisch die gleichen Eigenschaften besitzen Test- 2,4,6-Tribrom-3-methylbenzo.Idiazonium-

papiere. die äquimolare Mengen der folgenden Diazo- fluoborat,

niuBisalze eathalten: 2-Methyl-4,6-dibrpm-5-chlörbenzoldiazonium-

fluoborat,

2,4,6-Tr:brombenzoldiazonium-naphthalin- 5 2,4,6-Tribrom-3-methoxybenzoldiazonium-

disulfonat, fluoborat,

2,4,6-Tribrom-3-methylbenzoldiazoniumfluoborat 2,3,6-Trihrom-benzoldiazoniurnf!ucborai.

Claims (5)

1 2 mehr und mehr sogenannte Schnellteste eingeführt. Patentansprüche: Dies sind einfache Vorrichtungen, meist Testpapierc, die die Durchführung des Nachweises oder der halb·

1. Testpapier zum Nachweis von Bilirubin in quantitativen Bestimmung von pathologischen Kör-Körperflüssigkeiten, enthaltend ein Diazoniumsalz 5 perinhaltsstoffen schnell und sicher auch durch ungemil einen? stabilisierenden Anion und eine für die schulte Kräfte, wie medizinisches Hilfspersonal ge-Kupplungsreäkiion ausreichende Menge einer statten.

Säure, dadurch gekennzeichnet, daß So ist beispielsweise in der deutschen Auslegeschrift

als Diazoniumsalz eine Verbindung der allgemeinen 1102 444 eine ein Diazoniumsalz und eine starke Formel I »° Säure enthaltende Reagenzlablette beschrieben, die auf

ein mit der Körperflüssigkeit befeuchtetes TcR'plätt-

Ri chen gelegt wird und nach dem Befeuchten mit Wasser

R_s / das Bilirubin als violetten Ring auf der Unterlage

X \ jvj β N^eX^e (J) sichtbar macht.

X ~ 15 Es ist ersichtlich, daß ein solches diagnostisches

^R< ^χ Mittel relativ umständlich zu handhaben ist. Für die

R₂ breite Anwendung in der ärztlichen Praxis und am

Krankenbett ist e& aber wünschenswert, daß Schnellin welcher X^c ein stabilisierendes Anion und R₁ teste so beschaffen sind, daß sie nach einfachem Ein- und R₂ ein Halogenatom, eine niedere Alkyl- oder »° tauchen in die zu untersuchende Körperflüssigkeit ohne Alkoxygruppe und R₃ und Pc₄ Wasserstoff, ein weiteres ablesbar sind. Diesen Zweck erfüllen am Halogenatom, eine Nitro-, eine niedere Alkyl-oder besten sogenannte Testpapiere; das sind saugfähige Alkoxygruppe bedeuten, wobei der aromatische Träger, die mit allen für die Nachweisreaktion not-Ring entweder 1 bis 3 Halogenatome oder eine wendigen Reagenzien imprägniert sind.
Nitrogruppe, aber nicht beide gemeinsam, enthält, *5 Aus der deutschen Offenlegungsschrift 2 007 013 verwendet v/ird. sind derartige Testpapierc, welche gewisse 2,4- und

2. Testpapier gemäß Anspruch 1, dadurch ge- 2,5-disubstituierte Diazoniumsalze zum Nachweis von kennzeichnet, daß es zusätzlich einen Aktivator Bilirubin in Serum und Harn enthalten, bereits beenthäll. kannt. Jedoch weisen diese Testpapiere nach eigenen

3. Testpapier gemäß Anspruch 1 und 2., dadurch 3« Untersuchungen noch keine ausreichende Reaktionsgekennzeichnet, daß es als Diazoniumsalz ein geschwindigkeit und Empfindlichkeit auf, so daß ihre 2,6-Dichlorbenzoldiazoniumsalz enthält. Verwendbarkeit in der Praxis in Frage gestellt ist.

4. Testpapier gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, Es besteht nun die Möglichkeit, die Empfindlichkeit dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich Stabili- der Nachweisreaktion durch Aktivatore« zu erhöhen; sier- und/oder Netzmittel enthält. 35 hierbei tritt jedoch eine neue Schwierigkeit auf. Das im

5. Verwendung von Diazoniumsalzen der im Harn ebenfalls vorkommende Urobilinogen reagiert Anspruch 1 angegebenen allgemeinen Formel I zur nämlich in Anwesenheit dieser Aktivatoren ebenfalls Herstellung von Testpapieren zum Nachweis von und täuscht einen erhöhten Bilirubingehalt vor. Außer-Bilirubin in Körperflüssigkeiten. dem werden hierdurch die normalen Störreaktionen

40 mit Harninhaltssioffen ebenfalls aktiviert, was sich in Fehlfärbungen oder sogar falsch positiven Anzeigen

äußern kann.

Es stellte sich somit die Aufgabe, die bekannten Testpapiere zum Nachweis von Bilirubin in Körperflüisig-

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Testpapier 45 keiten derart zu verbessern, daß der Nachweis auch in zum Nachweis von Bilirubin in Körperflüssigkeiten, Gegenwart von Urobilinogen mit oder ohne Zusatz enthaltend ein Diazoniumsalz mit einem stabilisieren- eines Aktivators mit ausreichender Empfindlichkeit den Anion und eine für die Kupplungsreaktion aus- möglich wird,
reichende Menge einer Säure. Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch ge-

Der Nachweis von Bilirubin in Körperflüssigkeiten, so löst, daß als Diazoniumsalz in einem Testpapier der insbesondere in Urin ist von großer Bedeutung bei der eingangs genannten Art eine Verbindung der allge-Diagnose von Leber- und Gallenerkrankungen. So tritt meinen Formel ί
bei Leberschädigungen und GaIiengangsverschlüssen

schon frühzeitig Bilirubin im Urin auf, noch bevor der ^i

Biürubin-Gehalt im Serum steigt und klinische An- 55 R₃ .. . '

zeichen einer Gelbsucht vorliegen. Andererseits kann X "\ N = N®X^fo (I)

man diese Art von Gelbsucht vom sogenannten hämo- X

lytischen Icterus unterscheiden, bei welchem nur im * ^N

Serum, nicht aber im Urin ein erhöhter Bilirubin- R₂

spiegel festgestellt werden kann. 60

Nachweismethoden von Bilirubin in Urin sind seit in weld er Χ^Θ ein stabilisierendes Anion und R₁ und R₂ langem bekannt. Von Bedeutung sind hierbei die ein Halogenatom, eine niedere Alkyl- oder Alkoxy-Methoden, die auf der Auswertung der bei der Kupp- gruppe und R₃ und R₄ Wasserstoff, ein Halogenatom, lung von Diazoniumsalzen mit Bilirubin gebildeten eine Nitro-, eine niedere Alkyl- oder Alkoxygmppe farbigen Verbindungen beruhen. Hierfür wurde bisher 65 bedeuten, wobei der aromatische Ring entweder 1 bis meist die uiazosuifaniisäure verwendet. 3 Haicgenatcnic oder eine Nitrogruppe, aber nicht

In der letzten Zeit haben sich in der ärztlichen Praxis beide gemeinsam, enthält, verwendet wird. Bei dem und im klinischen Labor als diagnostische Hilfsmittel erfindungsgemäßen Testpapier treten die obengenann-