CH507518A

CH507518A - Mittel zum qualitativen Nachweis bzw. zur quantitativen Bestimmung von Hydroperoxyden bzw. peroxydatisch wirksamen Substanzen und seine Verwendung

Info

Publication number: CH507518A
Application number: CH1534068A
Authority: CH
Inventors: Nat Rey Hans-Georg Dr Rer; Hans Dr Phil Wielinger; Nat Rieckmann Peter Dr Rer
Original assignee: Boehringer Mannheim Gmbh
Priority date: 1967-10-14
Filing date: 1968-10-14
Publication date: 1971-05-15
Also published as: FR1589037A; NL6814684A; GB1186668A; NL137003C

Description


  
 



  Mittel zum qualitativen Nachweis bzw. zur quantitativen Bestimmung von Hydroperoxyden bzw.



   peroxydatisch wirksamen Substanzen und seine Verwendung    Gegenstand    der   vorliegenden    Erfindung ist ein Mit tel zum qualitativen Nachweis bzw. zur quantitativen    Bestimmung    von a) Hydroperoxyden oder von Substan aen, die unter Freisetzung von Hydroperoxyden reagie ren oder b) Peroxydase oder peroxydatisch wirkenden
Substanzen unter Ausnützung der Farbreaktion, welche a) und b)   gegebenenfalls    unter Einwirkung anderer Sub stanzen zusammen mit einem Chromogen eingehen. Von besonderem   Interesse    ist der Nachweis von Glucose in
Harn, Blut und Serum bei   Diabetes,    sowie der Nach weis peroxydatisch wirkender Substanzen, wie Hämo globin im Harn und Blut und der Naohweis von Hydro peroxiden z.

  B. in der Milchwirtschaft, Kosmetik und    Polymerchemie.   



   Es ist eine Reihe von Verbindungen bekannt, die von Wasserstoffperoxyd mit Peroxydase als Katalysator zu einem Farbstoff oxydiert werden. Die Substanzen, die hierfür verwendet wenden, sind z. B.: Nadi-Reagenzien, p-Phenylendiaminderivate,   Carboazine,      Guajakharz,    Aldazine etc.



   Bevorzugt eingesetzt werden bisher Benzidin,   o-Dia-    nisidin und   o-Toiidin.    Diese Verbindungen sind aber teilweise nicht sehr stabil und können nach den neue   sten    Erkenntnissen gesundheitsschädlich sein, so dass ihre   Handhabung    nicht ungefährlich erscheint.



   Es wurde nun überraschenderweise gefunden, dass die physiologisch unschädlichen Verbindungen der For   melI   
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 worin    Rt    eine niedere Alkylgruppe,
R2 Wasserstoff, eine Sulfogruppe oder eine
Alkalisulfonatgruppe,    R3    Wasserstoff, Chlor oder eine niedere Alkylgruppe,
X ein Schwefelatom, eine Vinylen- oder eine
Iminogruppe, die gegebenenfalls durch niedere
Alkylreste oder Arylreste substituiert ist,
Y ein Stickstoffatom oder eine   Methylidyngruppe,    welche auch zusammen mit R3 einen durch R2 substituierten Benzolring bilden kann, bedeuten,

   absolut beständig sind und sich besonders gut dazu eig    nen,    Wasserstoffperoxyd und andere Hydroperoxyde so wohl im optischen   Tiefst hals    auch mit Hilfe von Reagenz    papieren    und   Reagenzfilmen    zu bestimmen. Es ist zwar bekannt,   dass      sich    einige dieser Substanzen mittels star ker Oxydationsmittel wie   Bleitetraacetat,    Cer-IV-Sulfat und   Kaijumpersulfat    oxydieren lassen und dabei gefärb te   Oxydationsprodukte    liefern; vgl. S. Hünig et al., Lie bigs Ann. Chem. 676, (1964), S.   3265    sowie H. Lang    et    al. Z. analyt. Chem. 201, (1964), S. 321.

  Da jedoch mit Wasserstoffperoxyd alleine keine Reaktion erfolgt, war es nicht   vonauszusehen,    Idass sich in   Anwesenheit    von Peroxydase oder peroxydatisch wirksamen Substan zen ebenfalls reproduzierbare deutliche Verfärbungen erzielen lassen.



   Das   erfindungsgemässe    Mittel, das a) ein Hydroper oxyd oder eine unter Freisetzung von Hydroperoxyd reagierende Substanz oder b) Peroxydase oder eine pe roxydatisch wirksame Substanz und ein Chromogen ent hält, ist dadurch gekennzeichnet, dass es als Chromo gen mindestens eine Verbindung der Formel I enthält.



   Das erfindungsgemässe Mittel ist vorzugsweise für gekoppelte und   ungekoppelte    Enzymreaktionen geeignet, wie z. B. zur Bestimmung von Glucose, Galactose, Aminosäuren, Harnsäure, Peroxyden, Hämoglobin, Peroxydase oder anderen peroxydatisch   wirksamen    Substanzen sowie Enzymaktivitäten. Die routinemässige Bestimmung von derartigen Substraten ist wegen ihrer ele mentaren Wichtigkeit aus   wider    klinischen Chemie und  aus der Lebensmittelchemie nicht mehr wegzudenken.



  Bei der Bestimmung von Glucose beispielsweise wird diese von Glucoseoxydase zu Gluconsäure oxydiert, wobei der Luftsauerstoff zu Wasserstoffperoxyd reduziert wird. Das Wasserstoffperoxyd oxydiert dann mittels Peroxydase oder einer peroxydatisch wirkenden Substanz das   erfindungsgemäss    als Indikator eingesetzte Chromogen zum entsprechenden - Farbstoff. Weitere Beispiele für derartige analytisch brauchbare Enzymsysteme, die unter Freisetzung von Wasserstoffperoxyd reagieren, sind L-Aminosäureoxydase + L-Aminosäuren, D-Aminosäureoxydase + D-Aminosäuren,   Uricase    + Harnsäure, Xanthinoxydase + Hypoxanthin bzw.

  Xanthin,   Olycinoxydase    + Glycin,   Monoaminooxydasfe    + Monoamin (wie Adrenalin,   Mescalin    etc.), Diaminooxydase + Diamine (wie   Hisbamin),    Luciferase + Luciferin, D-Asparaginsäureoxydase + D-Asparaginsäure, Leber-Aldehydoxydase + Aldehyd, Galactoseoxydase +   galaktose,    Edson's Flavinenzym + Milchsäure.



   Der Nachweis bzw. die quantitative Bestimmung mit   Hilfe    der erfindungsgemässen Mittel   erfolgt    durch Auswertung der bei der Reaktion der Hydroperoxyde mit Peroxydase bzw. peroxydatisch wirksamen Substanzen auftretenden Verfärbungen, die auf den Übergang des Chromogens in den entsprechenden Farbstoff zurückzuführen sind. Die Auswertung erfolgt beispielsweise durch optische Ausmessung im Spektrophotometer oder bei Verwendung von Testpapierstreifen und   Testfilmen    durch Vergleich der Farbstärke mit Blindproben bekannter Zusammensetzung bzw. Farbtafeln.



   Besonders gute Ergebnisse und vor allem besonders gut abgestufte   Farbändlerungen    erhält man überraschen   derveise,    wenn das diagnostische Mittel ausser den Verbindungen der Formel   1    noch ein Reduktionsmittel der Formel
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 enthalt.



   In der Formel II bedeuten: Ar einen Benzol- oder Naphthalinkern, V eine Hydroxyl- oder Aminogruppe, V' Wasserstoff oder eine gegebenenfalls alkylierte oder arylierte Hydroxyl- oder Aminogruppe, W eine   Amino-,    Alkoxy-, Alkyl-, Aryl-, Carboxy oder Sulfogruppe und W' Wasserstoff oder eine Amino-, Alkoxy-, Alkyl-,
Aryl-, Carboxy- oder Sulfogruppe, sowie gegebenenfalls deren Alkalisalze.



   Die Verbindungen der Formel II,   die    als  Modifier  wirken, geben für sich alleine keine oder nur sehr unspezifische Verfärbungen und sind   des'alb    als   Indi-    katoren im allgemeinen nicht geeignet. Zusammen mit den Verbindungen der Formel   1    erhält man aber besonders deutliche und gut abgestufte Farbumschläge.



  Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung enthalten daher eine Kombination der Verbindungen der Formel   1    und II als Indikator.



   Selbstverständlich lässt sich umgekehrt das erfindungsgemässe Mittel auch zur Bestimmung der Chromogene   1    sowie der   Modifier    II mit Hilfe von Hydroperoxyden und einer peroxydatisch wirksamen Substanz benutzen, was bei der Produktionsüberwachung dieser Diagnostica sehr nützlich ist.



   Die   erfindungsgemässen    Mittel sowie ihre Verwendung werden anhand der folgenden Beispiele näher er   ,läutern.   



   Beispiel 1 Reagenzfilm zum Nachweis von Glukose
45 g   Propiofan    (BASF), 35 g einer Lösung von 37 g Algipon in 2 Liter eines 0,5 molaren Phosphat- oder Citratpuffers vom pH 5,7, 1 g Texapon P (Fa. Henkel Düsseldorf), 10 ml Wasser, 0,075 g Peroxydase und 0,15 g Glucoseoxydase werden zu einem homogenen Brei verrührt. Zu dieser Mischung gibt man 6 ml einer   5 /0-igen    wässrigen Lösung von   2,2'-Azino-di-[3-äthylbenzthia-    zolon-sulfonsäure (6)]. Mit den so hergestellten Mischungen, in denen jeweils 0,2-0,3    io    Indikator enthalten sind, werden Folien in einer Schichtdicke von 300   u    beschichtet und getrocknet. Mit wässrigen Lösungen verschiedener   Olukosekonzentrationen    erhält man schwach abgestufte Grünfärbungen.

  Setzt man den obigen Mischungen anstelle der wässrigen Lösungen von 2,2'-Azino-di-[3-äthyl-benzthiazolon-sulfonsäure (6)] 6 ml einer 5    /o-igen    Lösung von p-Amino-salicylsäure zu, so erhält man Teststreifen, die sich beim Benetzen mit wässrigen Glukoselösungen nur schwach gelb verfärben und keinerlei Abstufungen der Verfärbung aufweisen. Verwendet   Iman    jedoch 6 ml einer wässrig-methanolischen Lösung des Gemischs von 5    /0    2,2'-Azino   di-[3-äthyl-benzthiazolon-sulfonsäure    (6)] und 5    /o    p-Aminosalicylsäure, so erhält man Teststreifen, die sich je nach der Glukosekonzentration in Abstufungen von grün nach violett verfärben.



   Beispiel 2 Nachweis von Glukose   in    Blut, Harn oder Serum
In analoger Weise wie im Beispiel 1 beschrieben, werden Reagenzfilme mit folgenden Substanzen   1    hergestellt: A = 2,2'-Azino-di-[3-äthyl-benzthiazolon sulfonsäure(6)] B =   2,2'-Azino-di-[1-äthyl-chinolin-sulfonsäure(6)]    C =   2,2-Azino-di-[1,3-diäthyl-benzimidazolon-    sulfonsäure(6)] D = 1-[3-Methylbenzthiazolon(2)]-2    [1    -äthylpyridon(2)] -azin E =   1-[3 -Äthylbenzthiazolon(2)] -2-[1-phenyl-3-       methyl-4-äthyl-1,2,4-triazolon(5)]-azin    F = 1-[3-Äthylbenzthiazolon(2)]-2  [1-äthylchinolinon(2)]-azin   G    =   1-[3-Methylbenzthiazolon(2)]-2-[1-phenyl-3-       

   methyl-4-äthyl-1,2,4-triazolon(5)]-azin    H =   1 -[1 -Äthylchinolinon(2)]-2-[ 1-äthylpyridon(2)]-    azin   J    = 1-[3-Äthylbenzthiazolon(2)]-2    [1-äthylpyridon(2)j-azin    K =   1 -[3 -Methylbenzthiazolon(2)] -2-       [1-äthylchinolinon(2)J-azin    L =   1-[3-Methylbenzthiazolon(2)]-2-[1-äthyl-6-       chlorpyridon(2)]-azin    M =   1-[1-Athylchinolinon(2)]-2-[1-äthyl-6-       chlorpyridon(2)] -azin    N = 2,2'-Azino-di-(3-äthylbenzthiazolon) wobei diese mit einer Reihe von Substanzen II kombiniert werden. Die Farbumschläge mit glucosehaltigen Lösungen (z. B. 

  Blut, Harn oder Serum) werden nach kurzer Zeit abgelesen und sind in der nachfolgenden Tabelle   1    zusammengestellt:  
Tabelle I Indikator I Indikator- Modifier II Modifier- gelöst in Farbreaktion je
Konzentration Konzentration nach Glucosekon    Olo       /o    zentration    A 0,2 - - grün (abgestuft)   
A 0,15   o-Aminophenol-p    sulfonsäure 0,2 Wasser gelb-grün
A 0,2 (1-Aminonaphthol-8)- gelbgrün
2,4-disulfonsäure 0,2 Wasser graurosa
A 0,3   (7-Aminonaphthol-1)-   
3,6-dinatriumsulfonat 0,05 Wasser rosa-grün
A 0,3 Naphthylamin(1)- n sulfonsäure(6) 0,05 50 Natronlauge   rosa-grün   
A 0,3 Naphthylamin(1)- Dimethyl sulfonsäure(8) 0,1 formamid rosa-grün
A 0,3 p-Amino-salicylsäure 0,1 Methanol grün-violett
A 0,3 o-Aminophenol 0,01 Methanol 

   gelb-grün
A 0,3 m-Aminophenol 0,007 Wasser rot-braunrot
A 0,3 p-Phenetidin 0,05 Methanol violett-grün
A 0,15 2-Hydroxy4-amino
4'-methoxy-diphenyl amin 0,15 n/50 Natron- grün-grau lauge
A 0,3   a-Naphtholsulfon-    säure(2) 0,1 Wasser rotviolett dunkelrot violett
B 0,01 - - - violett (abgestuft)
B 0,01 o-Aminophenol p-sulfonsäure 0,1 Wasser gelb-braun-violett
B 0,01 (1-Aminonaphthol-8)- grauviolett
2,4-disulfonsäure 0,1 Wasser blau
B 0,01 Naphthylamin(1)-   NaOH    sulfonsäure(6) 0,1    grauviolett   
C 0,1 p-Aminosalicylsäure 0,1 Methanol blau-rot
D 0,3   -    -   -    grün-dunkel grün
D 0,3 p-Aminosalicylsäure 0,3 Methanol grauviolett violett
E 0,3 - -   -    rosa
E 0,3 p-Aminosalicylsäure 0,25 Methanol rosa-rotviolett
F 0,3 - -   -    

   fliederfarben
F 0,3 p-Aminosalicylsäure 0,3 Methanol rosa-rotviolett
G 0,2 -   -      -    blau
G 0,2 p-Aminosalicylsäure 0,2 Methanol blauviolett
H 0,3 - -   -    fliederfarben
H 0,3 p-Aminosalicylsäure 0,2 Methanol   hell-dunkel-    violett
I 0,2 - - - blass-rosa
I 0,2 p-Aminosalicylsäure 0,3 Methanol rosa-dunkel rosa
K 0,3 -   -      -    grau-grün
K 0,3 p-Aminosalicylsäure 0,2 Methanol rotbraun    L 0,1 - - gelbgrün-grün   
L 0,1 p-Aminosalicylsäure 0,1 Methanal gelbgrün
M 0,1   -    - - braun
M 0,1 p-Aminosalicylsäure 0,1 Methanol braun
N 0,2 - - - grün
N 0,2 p-Aminosalicylsäure 0,2 Methanol   graugrün-    violett  (Die angegebenen Prozentzahlen beziehen sich auf die Gesamtmischung;

   die Verbindungen I; A-C werden in Wasser und D-N in Methanol gelöst).  



   Beispiel 3 Nachweis von Blut im Harn
Ein Filterpapier (2316 der Firma Schleicher  & Schüll) wird mit einem 0,1 molaren Phosphatpuffer vom pH 7,0 in dem   1 o/o    Texapon P (Fa. Henkel, Düsseldorf) gelöst ist, imprägniert und getrocknet. Danach wird das imprägnierte Papier mit einer wässrigen Lösung des Indikatorgemisches (0,03   O/o      2,2'-Azino-di-[1-äthylchino    linsulfonsäure (6)] und   0,1  /o    o-Aminophenol-p-sulfonsäure) nochmals imprägniert und getrocknet. Bringt man auf ein so hergestelltes Papier einen Tropfen eines bluthaltigen Urins und einen Tropfen   30/obiges    Wasserstoffperoxyd, so färbt sich das Testpapier noch bei einer Verdünnung von 1:50 000 rotviolett.

  Nimmt   man    statt o-Aminophenol-p-sulfonsäure,   1-Amino-8-naphthol-2,4-    disulfonsäure, so färbt sich das Papier noch bei einer Verdünnung von 1: 50 000 blauviolett.



   Beispiel 4 Nachweis von   Hydrnpernxyden    in Flüssigkeiten
Ein Filterpapier (2316 der Firma   Schleicher     & BR< Schüll) wird mit 50 ml eines 0,1 molaren Phosphatpuffers vom pH 6,0, in dem 25 mg Peroxydase und 0,25 ml Texapon P (Fa. Henkel, Düsseldorf) gelöst sind,   ijmpräg-    niert und getrocknet. Danach wird das Papier mit einer Lösung von 0,01 g   2,2'-Azino-di-[1-äthylchinolinsul-    fonsäure (6)] und 0,1 g o-Aminophenol-p-sulfonsäure in 100 ml Wasser imprägniert und getrocknet. Bringt man auf ein so hergestelltes Testpapier einen Tropfen einer wässrigen Hydroperoxydlösung, so zeigt das Papier noch bei einer Konzentration von 0,2   y/ml    eine rotviolette Färbung.



   Beispiel 5 Nachweis von Glucose in Flüssigkeiten
Jeweils 0,01 ml von   Glucoselösungen    mit Konzentrationen von 0-300   mg0/    werden zu 2 ml einer wässrig-methanolischen 0,00125 molaren Indikatorlösung von äquimolaren Mengen   2,2'-Azino-di-[3 -äthylb enz-      thi azolonsulfonsäure    (6)] und p-Aminosalicylsäure pipettiert. Hierzu gibt man 2 ml einer Lösung von 10 mg Peroxydase und 20 mg Glucoseoxydase in 100 ml eines 0,5 molaren Phosphatpuffers vom pH 5,7, schüttelt um, misst bei einer Wellenlänge von 490 nm und berechnet mit Hilfe einer Eichkurve die entsprechenden   Glucose-    werte.



   Verwendet man als Indikatorgemisch   2,2'-Azinowdi-    [1-äthylchinolinsulfonsäure (6)] und   m-Aminophenol,    so liegt das Absorptionsmaximum bei 510 nm.



   Beispiel 6
Ein gemäss Beispiel 1 hergestellter Reagenzfilm der   0,02 0/0      2,2'-Azino-di-[l-äthylchinolinsulfonsäure    (6)] und   0,3 0/0      2,2-Azinodi-[3-äthylbenzthiazolon-sulfon-    säure (6)] als   Indikatorgemisch    enthält, verfärbt sich mit steigender Glucosekonzentration von violett nach grün; dieser Farbumschlag lässt sich gut beobachten, da das menschliche Auge auf   Änderungen    in diesem Farbbereich empfindlich reagiert.



   Beispiel 7 Nachweis von Glucose im Blut
0,1 ml Blut werden mit 1 ml 0,3 molarer Perchlorsäure enteiweisst. Von dem Überstand werden 0,2   mi    in 5 ml einer Lösung folgender Zusammensetzung einpipettiert:
0,1 molarer Phosphatpuffer vom pH 7,0, welcher pro ml 40   zug    Peroxydase, 250   itg      Olucoseoxydase    und 500   ,ug    des Diammoniumsalzes der   2,2'-Azinodi-[3-    äthyl-benzthiazolon-sulfonsäure (6)] enthält. Man misst die Extinktion bei einer Wellenlänge von A= 420   nIn    und entnimmt die Glucosewerte einer Eichkurve.



   Beispiel 8   Blutglucose-Teststreifen   
45 g einer wässrigen Dispersion von Polyvinylpropionat (Propiofan, BASF), 35 g einer Lösung von 37 g Natriumalginat (Algipon) in 2 Liter eines 0,5 molaren Phosphat- oder Citratpuffers von pH 5,7, 1 g Texapon P (Fa. Henkel, Düsseldorf), 5 ml Wasser, 0,07 g Peroxydase, 0,16 g   Glueoseoxydase    werden zu einem homogenen Brei verrührt. Dazu kommen 0,3 g Ammoniumsalz der   2,2'-Azinodi-[3      -äthylbenzth,iazolon-sulfonsäure-    (6)] und 0,04 g des Ammoniumsalzes der o-Aminophenol-p-sulfonsäure in 7 ml Wasser gelöst, sowie 0,3 g N,   N,N,N'Tetramethyl-4,4'-diamino-diphenyl-methan    in 4 ml Aceton gelöst. Die so hergestellte Mischung wird in einer Schichtdicke von 300   u    auf eine Folie aufgetragen und getrocknet.

  Bringt man auf einen so hergestellten   Reagenzfilm    Blut mit verschiedenen Glucosekonzentrationen, lässt ca. 1 Minute einwirken und   wisoht    wieder ab, so findet man im physiologischen Bereich Abstufungen von gelb über grün nach blau. (Abstufungen: bei 60   mg0/o    gelb, 120   mgo/o    grün, 180   mg0lo    blaugrün, 240 mg0/o   blau,    300   mg0/o    blauviolett).



    Texapon P  ist ein waschaktives Produkt der Dehydag, Düsseldorf, dessen Zusammensetzung geheim gehalten   wird.. Man    kann stattdessen   auch    Natriumlau   rylsulfat    benutzen.



   PATENTANSPRUCH I
Mittel zum qualitativen Nachweis bzw. zur quantitativen   Bestimmung    von a) Hydroperoxyden oder von Substanzen, die unter Freisetzung von Hydroperoxyden reagieren, oder von b) Peroxydase oder peroxydatisch wirksamen Substanzen unter Ausnützung der Farbreaktion, welche a) und b) gegebenenfalls unter Einwirkung anderer Substanzen zusammen mit einem Chromogen eingehen, wobei das Mittel a) oder b) und ein Chromogen enthält,   dadurch    gekennzeichnet, dass es als Chromogen mindestens eine Verbindung der Formel I
EMI4.1     
 worin R, eine niedere Alkylgruppe,   R2    Wasserstoff, eine Sulfogruppe oder eine
Alkalisulfonatgruppe,   R3    Wasserstoff, Chlor oder eine niedere Alkylgruppe, X ein Schwefelatom, eine Vinylen- oder eine
Iminogruppe, 

   die gegebenenfalls durch niedere
Alkylreste oder Arylreste substituiert ist, 

**WARNUNG** Ende DESC Feld konnte Anfang CLMS uberlappen**.

Claims

**WARNUNG** Anfang CLMS Feld konnte Ende DESC uberlappen **.

Beispiel 3 Nachweis von Blut im Harn Ein Filterpapier (2316 der Firma Schleicher & Schüll) wird mit einem 0,1 molaren Phosphatpuffer vom pH 7,0 in dem 1 o/o Texapon P (Fa. Henkel, Düsseldorf) gelöst ist, imprägniert und getrocknet. Danach wird das imprägnierte Papier mit einer wässrigen Lösung des Indikatorgemisches (0,03 O/o 2,2'-Azino-di-[1-äthylchino linsulfonsäure (6)] und 0,1 /o o-Aminophenol-p-sulfonsäure) nochmals imprägniert und getrocknet. Bringt man auf ein so hergestelltes Papier einen Tropfen eines bluthaltigen Urins und einen Tropfen 30/obiges Wasserstoffperoxyd, so färbt sich das Testpapier noch bei einer Verdünnung von 1:50 000 rotviolett.

Nimmt man statt o-Aminophenol-p-sulfonsäure, 1-Amino-8-naphthol-2,4- disulfonsäure, so färbt sich das Papier noch bei einer Verdünnung von 1: 50 000 blauviolett.

Beispiel 4 Nachweis von Hydrnpernxyden in Flüssigkeiten Ein Filterpapier (2316 der Firma Schleicher & BR< Schüll) wird mit 50 ml eines 0,1 molaren Phosphatpuffers vom pH 6,0, in dem 25 mg Peroxydase und 0,25 ml Texapon P (Fa. Henkel, Düsseldorf) gelöst sind, ijmpräg- niert und getrocknet. Danach wird das Papier mit einer Lösung von 0,01 g 2,2'-Azino-di-[1-äthylchinolinsul- fonsäure (6)] und 0,1 g o-Aminophenol-p-sulfonsäure in 100 ml Wasser imprägniert und getrocknet. Bringt man auf ein so hergestelltes Testpapier einen Tropfen einer wässrigen Hydroperoxydlösung, so zeigt das Papier noch bei einer Konzentration von 0,2 y/ml eine rotviolette Färbung.

Beispiel 5 Nachweis von Glucose in Flüssigkeiten Jeweils 0,01 ml von Glucoselösungen mit Konzentrationen von 0-300 mg0/ werden zu 2 ml einer wässrig-methanolischen 0,00125 molaren Indikatorlösung von äquimolaren Mengen 2,2'-Azino-di-[3 -äthylb enz- thi azolonsulfonsäure (6)] und p-Aminosalicylsäure pipettiert. Hierzu gibt man 2 ml einer Lösung von 10 mg Peroxydase und 20 mg Glucoseoxydase in 100 ml eines 0,5 molaren Phosphatpuffers vom pH 5,7, schüttelt um, misst bei einer Wellenlänge von 490 nm und berechnet mit Hilfe einer Eichkurve die entsprechenden Glucose- werte.

Verwendet man als Indikatorgemisch 2,2'-Azinowdi- [1-äthylchinolinsulfonsäure (6)] und m-Aminophenol, so liegt das Absorptionsmaximum bei 510 nm.

Beispiel 6 Ein gemäss Beispiel 1 hergestellter Reagenzfilm der 0,02 0/0 2,2'-Azino-di-[l-äthylchinolinsulfonsäure (6)] und 0,3 0/0 2,2-Azinodi-[3-äthylbenzthiazolon-sulfon- säure (6)] als Indikatorgemisch enthält, verfärbt sich mit steigender Glucosekonzentration von violett nach grün; dieser Farbumschlag lässt sich gut beobachten, da das menschliche Auge auf Änderungen in diesem Farbbereich empfindlich reagiert.

Beispiel 7 Nachweis von Glucose im Blut 0,1 ml Blut werden mit 1 ml 0,3 molarer Perchlorsäure enteiweisst. Von dem Überstand werden 0,2 mi in 5 ml einer Lösung folgender Zusammensetzung einpipettiert: 0,1 molarer Phosphatpuffer vom pH 7,0, welcher pro ml 40 zug Peroxydase, 250 itg Olucoseoxydase und 500 ,ug des Diammoniumsalzes der 2,2'-Azinodi-[3- äthyl-benzthiazolon-sulfonsäure (6)] enthält. Man misst die Extinktion bei einer Wellenlänge von A= 420 nIn und entnimmt die Glucosewerte einer Eichkurve.

Beispiel 8 Blutglucose-Teststreifen 45 g einer wässrigen Dispersion von Polyvinylpropionat (Propiofan, BASF), 35 g einer Lösung von 37 g Natriumalginat (Algipon) in 2 Liter eines 0,5 molaren Phosphat- oder Citratpuffers von pH 5,7, 1 g Texapon P (Fa. Henkel, Düsseldorf), 5 ml Wasser, 0,07 g Peroxydase, 0,16 g Glueoseoxydase werden zu einem homogenen Brei verrührt. Dazu kommen 0,3 g Ammoniumsalz der 2,2'-Azinodi-[3 -äthylbenzth,iazolon-sulfonsäure- (6)] und 0,04 g des Ammoniumsalzes der o-Aminophenol-p-sulfonsäure in 7 ml Wasser gelöst, sowie 0,3 g N, N,N,N'Tetramethyl-4,4'-diamino-diphenyl-methan in 4 ml Aceton gelöst. Die so hergestellte Mischung wird in einer Schichtdicke von 300 u auf eine Folie aufgetragen und getrocknet.

Bringt man auf einen so hergestellten Reagenzfilm Blut mit verschiedenen Glucosekonzentrationen, lässt ca. 1 Minute einwirken und wisoht wieder ab, so findet man im physiologischen Bereich Abstufungen von gelb über grün nach blau. (Abstufungen: bei 60 mg0/o gelb, 120 mgo/o grün, 180 mg0lo blaugrün, 240 mg0/o blau, 300 mg0/o blauviolett).

Texapon P ist ein waschaktives Produkt der Dehydag, Düsseldorf, dessen Zusammensetzung geheim gehalten wird.. Man kann stattdessen auch Natriumlau rylsulfat benutzen.

PATENTANSPRUCH I Mittel zum qualitativen Nachweis bzw. zur quantitativen Bestimmung von a) Hydroperoxyden oder von Substanzen, die unter Freisetzung von Hydroperoxyden reagieren, oder von b) Peroxydase oder peroxydatisch wirksamen Substanzen unter Ausnützung der Farbreaktion, welche a) und b) gegebenenfalls unter Einwirkung anderer Substanzen zusammen mit einem Chromogen eingehen, wobei das Mittel a) oder b) und ein Chromogen enthält, dadurch gekennzeichnet, dass es als Chromogen mindestens eine Verbindung der Formel I EMI4.1 worin R, eine niedere Alkylgruppe, R2 Wasserstoff, eine Sulfogruppe oder eine Alkalisulfonatgruppe, R3 Wasserstoff, Chlor oder eine niedere Alkylgruppe, X ein Schwefelatom, eine Vinylen- oder eine Iminogruppe,

die gegebenenfalls durch niedere Alkylreste oder Arylreste substituiert ist,

Y ein Stickstoffatom oder eine Methylidyngruppe, welche auch zusammen mit R5 einen durch R2 substituierten Benzolring bilden kann, bedeuten, enthält.

UNTERANSPRUCH 1. Mittel nach Patentanspruch I, dadurch Sgekenn- zeichnet, dass es zusätzlich mindestens eine Verbindung Ider Formel II EMI5.1 worin Ar einen Benzol- oder Naphthalinkern, V eine Hydroxyl- oder Aminogruppe, V' Wasserstoff oder eine gegebenenfalls alkylierte oder arylierte Hydroxyl- oder Aminogruppe, W eine Amino-, Alkoxy-, Alkyl-, Aryl-, Carboxy oder Sulfogruppe und W1 Wasserstoff oder eine Amino-, Alkoxy-, Alkyl-, Aryl-, Carboxy- oder Sulfogruppe bedeuten, sowie gegebenenfalls deren Alkalisalze, enthält.

PATENTANSPRUCH II Verwendung eines Mittels nach Patentanspruch I zum Nachweis von peroxydatisch wirksamen Substan- zen.

UNTERANSPRUCH 2. Verwendung nach Patentanspruch II zum Nach weis von Hämoglobin.