NL8203221A

NL8203221A - Verbeterde visuele aflezing van kleutesten.

Info

Publication number: NL8203221A
Application number: NL8203221A
Authority: NL
Original assignee: Akzo Nv
Priority date: 1982-08-17
Filing date: 1982-08-17
Publication date: 1984-03-16
Also published as: EP0103915B1; EP0103915A1; DE3374877D1

Description

t 'i OA/8631-128 Douma Akzo N.V., Arnhem

Titel: Verbeterde visuele aflezing van Kleurtesten

De uitvinding betreft een methode voor het visueel detecteren van de intensiteit van de kleur van vloeistof in een serie vaten met verschillende kleurstofconcentraties, en testkits ten gebruike 5 bij deze methode·

Visuele bepaling van de kleurintensiteit van een vloeistof is door zijn eenvoud en snelheid een aantrekkelijke methode voor onder meer concentratie-10 bepaling vah stoffen in een testraedium. Dergelijke visuele bepalingen worden in veel laboratoria routinematig in zeer grote aantallen uitgevoerd.

Een belangrijk probleem hierbij is echter dat afhankelijk van de kleurstof in de oplossing het oog 15 relatief ongevoelig is voor de vaak ook nog vrij geringe kleurintensiteitsverschillen. Daardoor wordt de betrouwbaarheid van zo’n bepaling nadelig beïnvloed.

De werkwijze volgens de uitvinding heeft tot doel dergelijke bepalingsmethoden aanzienlijk betrouw-20 baarder te maken.

De uitvinding wordt gekenmerkt doordat de detectie plaats vindt in aanwezigheid van een of meerdere extra kleurstof(fen), waarbij in de vaten met verschillende concentraties van de eerste kleurstof een verschillende 25 kleur of kleurschakering ontstaat.

De werkwijze volgens de uitvinding is bijzonder geschikt voor visuele detectie na het uitvoeren van een chemische reactie die tot kleuring of kleurs-verandering leidt.

30 8203221 - 2 -

Vergelijking van de resulterende kleur met andere in de serie vaten, waaronder blanco's en standaarden levert een kwalitatieve detectie van de te bepalen stof op, 5 Volgens de uitvinding is het mogelijk de, of (bij aanwezigheid van meerdere) een der, of alle extra kleurstoffen op te nemen in het materiaal waarvan de vaten voor het uitvoeren van de bepaling vervaardigd zijn.

10 Een andere mogelijkheid is een (of meerdere van de) extra kleurstof(fen) aan de vloeistof in de vaten toe te voegen.

Ook kan bij gebruik van meerdere extra kleurstoffen een ervan aan de vloeistof, en een andere aan 15 het materiaal waarvan de vaten voor het uitvoeren van de bepaling zijn vervaardigd, worden toegevoegd.

Een extra kleurstof toegevoegd volgens de uitvinding kan complementair zijn met de andere aanwezige kleurstof(fen), waardoor uitdoving ontstaat, of niet-20 complementair, waardoor bij concentratieverschillen van de eerste kleurstof kleurverschillen optreden.

Een chemische reactie die bij de methode volgens de uitvinding de kleurintensiteit kan veranderen kan bestaan in het toevoegen van een verbinding die 25 reageert met de te bepalen stof, doch kan ook meerdere toevoegingsstappen omvatten, eventuele tussenbewer-kingen zoals verwarmen, afkoelen, kristalliseren en adsorberen, alsmede het toevoegen van reactie-componenten welke later weer verwijderd worden. Met 30 voordeel kan de werkwijze volgens de uitvinding toegepast worden op immunochemische bepalingen waarbij een kleurreactie optreedt, zoals bij gebruik van kleurstof- of metaalsolen, maar in het bijzonder die waarbij de detectie plaatsvindt door het meten van enzym-35 activiteit met behulp van een substraat bij de omzetting waarvan een kleuring ontstaat of verandert.

8203221 - 3 -

Voor het routinematig uitvoeren van immuno-chemische bepalingen wordt veelal gebruik gemaakt van kant en klare sets die reagentia, reactievaten en hulpstoffen bevatten: zogenaamde testkits. Voor 5 de toepassing van de methode volgens de uitvinding kunnen speciale testkits gebruikt worden.

Deze testkits bevatten naast de gebruikelijke componenten voor de immunochemische bepaling bijvoorbeeld een serie gekleurde vaten, of een los 10 · toegevoegde kleurstof met een kleur verschillend van die van de vloeistof die ontstaat als resultaat van de betreffende immunochemische bepaling.

Afhankelijk van het type immunochemische bepaling worden als genoemde gebruikelijke componenten 15 bijvoorbeeld gemerkte immunocomponent, een eventueel aan een drager gebonden immunocomponent, wasvloeistof eh/of buffer in een testkit opgenomen.

Een testkit voor enzymiramuno-assay volgens de uitvinding bevat tenminste een enzym-gekoppelde 20 immunocomponent, een substraat voor het gekoppelde enzym en een chromogeen, alsmede een serie gekleurde vaten of een los bijgevoegde kleurstof met een kleur verschillend van die van de vloeistof die ontstaat als resultaat van de betreffende immunochemische 25 bepaling.

De uitvinding wordt aan de hand van de volgende voorbeelden toegelicht.

8203221 C' - - 4 -

Voorbeeld 1

De enzymactiviteit van mierikswortel peroxidase bevattende monsters wordt bepaald door incubatie van deze monsters in buffer (0,01 mol natrium acetaat/1; 5 op pH 6,0 ingesteld met vast citroenzuur) waaraan substraat (HgOjf 20 mmol/1) en chromogeen (3,3’, 5,5'-tetraraethylbenzidine, "TMB"; 0,4 mmol/1) zijn toegevoegd. Na incubatie (1 uur kamertemperatuur) wordt de reactie gestopt door toevoeging van zwavelzuur 10 ' (2 mol/1)·

Aanwezige enzymactiviteit resulteert uiteindelijk in een gele kleur (absorptie maximum: 450 nm), waarbij activiteitsverschillen tussen monsters tot uiting komen als kleurintensiteitsverschillen. Het onderscheid 15 tussen deze bij een aflezing m.b.v. het oog wordt verduidelijkt door intensiteitsverschil om te zetten in een kleursverandering. Dit wordt gedaan door aan de zwavelzuuroplossing (zie boven) de blauwe kleurstof Toluidine Blauw 0 toe te voegen; concen-20 tratie overeenkomend met A^g™ « 1,860).

De reeks "lage tot hoge intensiteit geel” (of: licht-tot donkergeel) verandert dan in een reeks variërend van blauw via blauwgroen/groengeel naar geel.

25 enzymactiviteit zonder Toluidine Blauw met Toluidine Blauw - kleurloos/lichtgeel blauw + ... +++ lichtgeel/donkergeel blauwgroen/groengeel ++++ donkergeel geel 8203221 i> - 5 -

Voorbeeld 2

Als Voorbeeld 1; de reactie wordt nu echter niet gestopt met zwavelzuur. Aanwezige enzymactiviteit resulteert nu in een blauwe kleur (absorptie maximum: 5 655 nm)j activiteitsverschillen tussen monsters komen tot uiting als verschillende intensiteiten blauw.

De verschillen worden weer duidelijker afleesbaar door intensiteitsverschil om te zetten in een kleurs- verandering, en wel door toevoeging van een oplossing

R

10' van de gele kleurstof Priraazin Geel GRL, BASF in gedestilleerd waterj concentratie overeenkomend met aJiI® » 1,820).

activiteit zon<^er PrimazinR Geel met PrimazinR Geel ^ - kleurloos/lichtblauw geel + .... +++ licht-/donkerblauw geelgroen/blauwgroen ++++ donkerblauw blauw 20 Voorbeeld 3

Als Voorbeeld 2; in plaats van TMB wordt nu echter N,N-dimethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride als chromogeen gebruikt. Aanwezige enzymactiviteit resulteert nu in een rode kleur (absorptiemaximum: 25 520 nm). De omzetting van een kleursintensiteits- verschil in een kleursverandering wordt bereikt door toevoeging van een oplossing van de blauwe kleurstof Toluidine Blauw 0 in gedestilleerd water (zie Voorbeeld 1).

activiteit zonc*er Toluidine Blauw met Toluidine Blauw - kleurloos/lichtrood blauw + .... +++ licht-/donkerrood rood-violet-paars ++++ donkerrood rood 8203221 - 6 -

Voorbeeld 4

Als Voorbeeld 1; aan de zwavelzuuroplossing worden nu echter een blauwe en een rode kleurstof toegevoegd Toluidine Blauw 0, concentratie overeen-5 komend met * 1,860; LevafixR Briljant Rood E-4BA (Bayer AG), concentratie overeenkomend met A510in * Be kleurstof concentraties zijn zo gekozen dat voor de negatieve monsters de achter-grondkleur (lichtgeel) door subtractieve menging 10 ' met de twee andere primaire kleuren blauw en rood "uitgedoofd" wordt tot blauwgrijs/grijs. De positieve monsters zijn groengeel/geel.

Voorbeeld 5 15 Als Voorbeeld 2; na afloop van de reactie wordt weer subtractieve kleurmenging toegepast als in Voorbeeld 4, maar nu met de twee primaire kleuren geel (Primazin Geel GRL, BASF, concentratie overeenkomend met A^g® » 1,820) en rood (LevafixR Briljant 20 Rood E-4BA (Bayer AG), concentratie overeenkomend met Agi^® ® 0,720). De achtergrondkleur van de negatieve monsters (lichtblauw) wordt nu "uitgedoofd" tot geelgrijs/grijs. De positieve monsters zijn blauw/blauwgroen.

25

Voorbeeld 6

Bij een Sandwich enzym-immunoassay voor Hepatitis p B surface antigeen (Hepanostika HBsAg; Organon Teknika) wordt gebruik gemaakt van een met mierikswortel 30 peroxidase gemerkt antilichaam. Aanwezigheid van het antigeen in het te onderzoeken bloedmonster resulteert in de binding van een hoeveelheid enzym aan de wand van een putje van een polystyreen microtitratieplaat; de enzymactiviteit wordt zichtbaar gemaakt door 35 incubatie met buffer/substraat(Η2θ£)/chromogeen (TMB), 8203221 ... '·» ·* - 7 - gevolgd door toevoegen van zwavelzuur. De uitslag "positief/negatief,r wordt nu bepaald door visuele vergelijking van de kleur van de putjes met monster met die van de putjes met positieve en negatieve 5 controle. De aflezing wordt sterk vereenvoudigd door te werk te gaan zoals beschreven in Voorbeeld 1.

De positieve monsters "springen eruit" als groengeel/ geel temidden van blauwgekleurde negatieve monsters.

* 8203221

Claims

1. Methode voor het visueel detecteren van de intensiteit van de kleur van vloeistof in een serie vaten met verschillende kleurstofconcentraties, met het kenmerk, dat de detectie plaatsvindt in aanwezigheid van een of meerdere extra kleurstof(fen), waarbij in de vaten met verschillende concentraties van de eerste kleurstof een verschillende kleur of kleurschakering ontstaat.

2. Methode volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de visuele detectie wordt toegepast na het uitvoeren van een chemische reactie in de serie vaten, welke reactie aanleiding geeft tot een kleuring of kleursverandering van het reactiemedium.

3. Methode volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat vaten vervaardigd van materiaal waarin tenminste een kleurstof is opgenomen worden toegepast.

4. Methode volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat een of meerdere extra kleurstof (fen), aan de vloeistof in de vaten is(zijn) toegevoegd.

5. Methode volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat tenminste twee extra kleurstoffen worden toegepast, waarbij tenminste een kleurstof is opgenomen in het materiaal waarvan de vaten zijn vervaardigd, en tenminste een andere extra kleurstof aan de vloeistof in de vaten is toegevoegd.

6. Methode volgens een der voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat een extra kleurstof met een kleur niet-complementair aan die van de eerste kleurstof wordt toegepast.

7. Methode volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat als niet-complementaire kleuren geel en cyaan toegepast worden. i 8203221 :*V . * -11Γ - 9 -

8. Methode volgens conclusie 2, roet het kenmerk, dat de chemische reactie een iramunochemische bepaling is.

9. Methode volgens conclusie 8, met het kenmerk, dat de bepaling een enzymiramunochemische bepaling is.

10. Testkit ten gebruike bij de methode volgens de conclusies 3 of 5 en 8 of 9 voor het visueel detecteren van de intensiteit van de kleur van een vloeistof 'in een serie vaten met verschillende kleurstof-concentraties, met het kenmerk, dat de testkit naast de voor iramunochemische bepalingen gebruikelijke componenten een serie gekleurde vaten met een kleur verschillend van die van de vloeistof, die ontstaat als resultaat van de betreffende immuno-cheraische bepaling, bevat.

111 Testkit ten gebruike bij de methode volgens de conclusies 4 of 5 of 8 of 9 voor het visueel detecteren van de intensiteit van de kleur van een vloeistof in een serie vaten met verschillende kleurstof-concentraties, met het kenmerk, dat de testkit naast de voor iramunochemische bepalingen gebruikelijke componenten een kleurstof bevat met een kleur verschillend van die van de vloeistof die ontstaat als resultaat van de betreffende imraunochemische bepaling. 8203221