<B>Mittel zum qualitativen Nachweis bzw. zur quantitativen Bestimmung von</B> Hydroperoxyden bzw. peroxydatisch wirksamen Substanzen und seine <B>Verwendung</B> Gegenstand des Hauptpatentes Nr. 507 518 ist ein Mit tel zum Nachweis bzw. zur quantitativen Bestimmung von a) Hydroperoxyden oder von Substanzen, die unter Frei setzung von Hydroperoxyden reagieren oder b) Peroxy dase oder anderen peroxydatisch wirksamen Substanzen unter Ausnützung der Farbreaktion, welche a) und b) ge gebenenfalls unter Einwirkung anderer Substanzen zu sammen mit einem Chromogen eingehen.
Als Chromo- gene kommen im Hauptpatent die physiologisch unschäd lichen Verbindungen der Formel I zur Anwendung
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in der R, eine niedere Alkylgruppe, R2 Wasserstoff, eine Sulfogruppe oder eine Alkalisulfo- natgruppe, R3 Wasserstoff, Chlor oder eine niedere Alkylgruppe, X ein Schwefelatom, eine Vinylen- oder eine Imino- gruppe, die gegebenenfalls durch einen niederen Alkylrest oder Arylrest substituiert ist, Y ein Stickstoffatom oder eine Methylidyngruppe, wel che auch zusammen mit R3 einen durch R2 substituierten Benzolring bilden kann, bedeuten.
In Ausgestaltung der dem Hauptpatent zugrundelie genden Erfindung wurde nun gefunden, dass auch jene Verbindungen der Formel 1, in denen X zusätzlich ein Sauerstoffatom oder ein mit zwei niederen Alkylgruppen substituiertes Kohlenstoffatom bedeutet, hervorragende Eigenschaften als Chromogene besitzen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Mittel zum Nachweis bzw. zur quantitativen Bestimmung von a) Hydroperoxyden oder von Substanzen, die unter Freisetzung von Hydroperoxyden reagieren, oder von b) Peroxydase oder peroxydatisch wirksamen Substanzen unter Ausnützung der Farbreaktion, welche a) und b) ge gebenenfalls unter Einwirkung anderer Substanzen zu sammen mit einem Chromogen eingehen, wobei das Mit tel a) oder b) und ein Chromogen enthält, dadurch ge kennzeichnet, dass es als Chromogen mindestens eine Verbindung der Formel I'
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in welcher R1 eine niedere Alkylgruppe, R2 Wasserstoff, eine Sulfogruppe oder eine Alkalisulfo- natgruppe, R3 Wasserstoff,
Halogen oder eine niedere Alkyl gruppe, Y ein Stickstoffatom oder eine Methylidyngruppe, wel che auch zusammen mit R3 einen durch R2 substituierten Benzolring bilden kann, einer der Reste X' ein Schwefelatom, eine Vinylengruppe, eine gegebenenfalls durch Niederalkyl oder Aryl substitu ierte Iminogruppe, ein Sauerstoffatom oder ein mit zwei niederen Alkylgruppen substituiertes Kohlenstoffatom be deutet, während der andere Rest X' ein Sauerstoffatom oder ein mit zwei niederen Alkylgruppen substituiertes Kohlenstoffatom darstellt, enthält.
Weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwen dung des Mittels zum Nachweis von peroxydatisch wirk samen Substanzen.
Die Bestimmung von Hydroperoxyden mit dem erfin- dungsgemässen Mittel ist vorzugsweise für gekoppelte und ungekoppelte Enzymreaktionen geeignet, wie z B. zur Bestimmung von Glucose, Galaktose, Aminosäuren, Harn säure. Peroxyden, Hämoglobin, Peroxydase oder anderen peroxydatisch wirksamen Substanzen sowie Enzymaktivi täten. Die routinemässige Bestimmung von derartigen Substraten ist wegen ihrer elementaren Wichtigkeit aus der klinischen Chemie und aus der Lebensmittel-Chemie nicht mehr wegzudenken. Bei der Bestimmung von Glu cose beispielsweise wird diese von Glucoseoxydase zu Gluconsäure oxydiert, wobei der Luftsauerstoff zu Was serstoffperoxyd reduziert wird.
Das Wasserstoffperoxyd oxydiert dann mittels Peroxydase oder einer peroxyda- tisch wirkenden Substanz den erfindungsgemäss verwen deten Indikator zum entsprechenden Farbstoff.
Die Auswertung erfolgt beispielsweise durch optische Ausmessung im Spektralphotometer oder bei Verwen dung von Testpapierstreifen bzw. Testfilmen durch Ver gleich der Farbstärke mit Blindproben bekannter Zusam mensetzung bzw. Farbtafeln. Besonders vorteilhafte und gut abgestufte Farbänderungen erhält man überraschen derweise, wenn man die Substanzen I' zusätzlich mit Re duktionsmitteln der Formel II
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in welcher Ar einen Benzol- oder Naphthalinkern, V eine Hydroxyl- oder Aminogruppe, V' Wasserstoff oder eine gegebenenfalls alkylierte oder arylierte Hydroxyl- oder Aminogruppe, W eine Amino-, Alkoxy-, Alkyl-, Aryl-, Carboxy- oder Sulfogruppe und W' Wasserstoff oder eine Amino-, Alkoxy-, Alkyl-, Aryl-, Carboxy- oder Sulfogruppe, oder mit deren Alkalisalzen versetzt.
Diese Substanzen, die als Modifier wirken, geben für sich alleine keine oder nur sehr unspezifische Verfärbun gen und sind deshalb als Indikatoren im allgemeinen nicht geeignet. Zusammen mit den Substanzen der Formel I' er hält man aber besonders deutliche und gut abgestufte Farbumschläge. Bevorzugte Ausführungsformen der vor liegenden Erfindung enthalten daher eine Kombination der Substanzen 1' und II als Indikator.
Selbstverständlich lässt sich umgekehrt das erfindungs- gemässe Mittel auch zur Bestimmung der Chromogene I' sowie der Modifier 1I mit Hilfe von Hydroperoxyden und einer peroxydatisch wirksamen Substanz benutzen, was beider Produktionsüberwachung dieser Diagnostika sehr nützlich ist.
Die Herstellung von Verbindungen I' kann in an sich bekannter Weise durch Umsetzung von 2-Halogen- oder Mercapto-Quartärsalzen mit einem entsprechenden N-alky- lierten Hydrazonsalz unter Zugabe eines Amins, vorzugs weise von Triäthylamin in einem polaren Lösungsmittel (z. B. Methanol) bei einer Temperatur von 15 bis 100 C erfolgen. Die Reaktion ist je nach Reaktivität der einzel nen Komponenten innerhalb von 10 Minuten bis 2 Stun den beendet (S. Hünig et a1., Liebigs Ann. Chem. 676, S. 32-65, 1964).
Die Darstellung der als Ausgangsprodukte verwende ten Hydrazone sowie der N-quaternisierten Salze kann analog den von S. Hünig (Ann. Chem. 609, S. 160-180 119571) und H. Balli (Liebigs Ann. Chem. 647, S. 1-8 t19611) angegebenen Vorschriften erfolgen. Die Verbindungen I' können erfindungsgemäss sowohl für den optischen Test in der Küvette als auch auf Reagenzpapieren und in Rea genzfolien allein oder zusammen mit den Modifiern der Formel 11 eingesetzt werden.
Das erfindungsgemässe Mittel sowie ihre Verwendung werden anhand der folgenden Beispiele näher erläutert: BEISPIEL 1 Reagenzfilm zum Nchweis von Glucose 45 g Propiofan (BASF), 35 g einer Lösung von 37 g Al- gipon in 2 Liter eines 0,5 molaren Phosphat- oder Citratpuf fers vom pH 5,7, 1 g Texapon P (Fa. Henkel Düsseldorf), 10 ml Wasser, 0,075 g Peroxidase und 0,15 g Glucoseoxi dase werden zu einem homogenen Brei verrührt.
Zu die ser Mischung gibt man 6 ml einer maximal 5 %igen met- hanolischen Lösung eines der nachstehend aufgeführten Indikatoren, sowie gewünschtenfalls einen der Modifier der Formel II, welcher in den nachfolgend angeführten Lösungsmitteln gelöst und zu der Indikatormischung gege ben wird. Mit den so hergestellten Mischungen, in denen bis zu 0,3 % Indikator enthalten sind, werden Folien in einer Schichtdicke von 300 p, beschichtet und getrocknet.
Auf einen derart hergestellten Teststreifen bringt man einen Tropfen glucosehaltigen Blutes, lässt diesen einige Zeit einwirken und erhält nach dem Abwischen des Trop- fens die in der Tabelle I angegebenen Farbreaktionen, welche je nach Glucose-Konzentrationen mehr oder weni ger stark abgestuft sind.
Indikatoren der Formel I': A 2,2'-Azino-di-[3-äthylbenzoxazolon(2)] B 1-[3-Äthylbenzoxazolon(2)]-2-[1-äthylpyridon(2)]-azin C 1[3-Äthylbenzoxazolon(2)]-2-[3-äthylbenzthiazolon(2)]-azin D 1-[3-Äthylbenzoxazolon(2)]-2-[1-äthylchinolinon(2)-azin E 1-[l-Äthyl-3,3-dimethyl-indolinon(2)]-2-[3-äthylbenzthiazolon- . (2)]-azin
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Tabelle <SEP> I
<tb> Indi- <SEP> Modifiersubstanzen <SEP> Modifier- <SEP> gelöst <SEP> Farb kator <SEP> II <SEP> Konzentra- <SEP> in <SEP> reaktionen
<tb> I' <SEP> tion <SEP> <B>%</B>
<tb> A <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> flieder farben
<tb> A <SEP> (1-Amino-naphthol-8)-2,4 disulfonsäure <SEP> 0,2 <SEP> Wasser <SEP> grün
<tb> A <SEP> Naphthylamin(1)-sulfonsäure(6) <SEP> 0,
05 <SEP> _nNaOH <SEP> rosa
<tb> 50
<tb> A <SEP> p-Aminosalicyl-säure <SEP> 0,1 <SEP> Methanol <SEP> orange
<tb> A <SEP> m-Aminophenol <SEP> 0,007 <SEP> Wasser <SEP> orange
<tb> B <SEP> o-Aminophenol-p-sulfonsäure <SEP> 0,2 <SEP> Wasser <SEP> blau
<tb> B <SEP> (1-Amino-naphthol-8)-2,4 disulfonsäure <SEP> 0,2 <SEP> Wasser <SEP> grün
<tb> B <SEP> p-Aminosalicylsäure <SEP> 0,1 <SEP> Methanol <SEP> rosa
<tb> B <SEP> m-Aminophenol <SEP> 0,007 <SEP> Wasser <SEP> rosa
<tb> B <SEP> p-Phenetidin <SEP> 0,05 <SEP> Methanol <SEP> rotbraun
<tb> C <SEP> Naphthylamin(1)-sulfonsäure(6) <SEP> 0,05 <SEP> _nNaOH <SEP> fleisch 50 <SEP> farben
<tb> C <SEP> Napthylamin(1)-sulfonsäure(8) <SEP> 0,1 <SEP> Dimethyl- <SEP> rosa formamid <SEP> violett
<tb> C <SEP> p-Amino-salicylsäure <SEP> 0,1 <SEP> Methanol <SEP> orange
<tb> D <SEP> o-Aminophenol-p-sulfonsäure <SEP> 0,
2 <SEP> Wasser <SEP> violett
<tb> D <SEP> (1-Amino-naphthol-8)-2,4 disulfonsäure <SEP> 0,2 <SEP> Wasser <SEP> grün
<tb> D <SEP> p-Aminosalicylsäure <SEP> 0,1 <SEP> Methanol <SEP> rosa
<tb> E <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> rot
<tb> E <SEP> p-Aminosalicylsäure <SEP> 0,1 <SEP> Methanol <SEP> flieder farben
<tb> E <SEP> m-Aminophenol <SEP> 0,007 <SEP> Wasser <SEP> violett
<tb> E <SEP> (1-Aminoaphthol-8)-2,4- <SEP> hellgrün disulfonsäure <SEP> 0,2 <SEP> Wasser <SEP> graugrün BEISPIEL 2 Hochempfindlicher Nachweis von Wasserstoffperoxid in Flüssigkeiten.
1 ml einer 0,2%igen methanolischen Lösung von 1-[1-Äthyl-3,3-dimethylindolinon-(2)]-2-[3-äthylbenzthiazo- lon(2)-1-azon, 1 ml einer 0,1%igen methanolischen Lö sung von p-Aminosalicylsäure, 0,05 ml einer 1%igen Lö- sung von Peroxidase in einem 0,1 molaren Phosphatpuffer vom pH 5,7 und 0,05 ml einer Lösung von Wasserstoffper oxid werden zusammen pipettiert, umgerührt und bei einer Wellenlänge von 530 nm gemessen. Die Wasser stoffperoxid-Konzentration wird mit Hilfe einer vorher aufgestellten Eichkurve bestimmt. BEISPIEL 3 Nachweis von Glucose im Harn Ein Filterpapier (2316 der Fa.
Schleicher & Schüll) wird mit einer Lösung von 75 mg Peroxidase, 143 mg Glu coseoxidase und 0,25 ml Texapon P (Fa. Henkel, Düssel dorf) in 100 ml eines 0,1 molaren Phosphatpuffers vom pH 5,6 imprägniert und getrocknet. Das in dieser Weise im prägnierte Papier wird anschliessend in eine Lösung von 0,2 g 1-[3-Äthylbenzoxazolon(2)]-2-[1-äthylchinolinon(2)]- azin und 0,1 g p-Aminosalicylsäure in 100 ml Methanol ge taucht und getrocknet. Beim Benetzen eines Streifens des so hergestellten Reagenzpapieres mit Harn, welcher pa thologische Glucosemengen enthält, verfärbt sich dieser je nach Glucosekonzentration verschieden stark rotviolett. BEISPIEL 4 Nachweis von Blut in Körperflüssigkeiten Ein Filterpapier (23 S der Fa.
Schleicher & Schüll) wird mit einer Lösung von 0,25 ml Texapon P (Fa. Hen kel, Düsseldorf) und 100 mg Natriumalginat in 100 ml eines 0,1 molaren Phosphatpuffers vom pH 5,6 impräg niert und getrocknet. Das so hergestellte Papier wird mit einer Lösung von 0,2 g 1-[3-Äthylbenzoxazolon(2)]-2-[1-ät- hylchinolinon(2)]-azin und 0,1 g p-Aminosalicylsäure in 100 ml Methanol imprägniert und getrocknet. Bringt man auf ein so hergestelltes Reagenzpapier einen Tropfen einer Körperflüssigkeit, welche Blut enthält, und tropft an- schliessend 3 %iges Wasserstoffperoxid auf das Papier, so färbt es sich noch bei einer Blutkonzentration von 1:50 000 rotviolett.
BEISPIEL 5 Nachweis von Hydroperoxiden in Flüssigkeiten Ein Filterpapier (2316 der Fa. Schleicher & Schüll) wird mit einer Lösung von 40 mg Peroxidase und 0,25 ml Texap n P (Fa. Henkel, Düsseldorf) in 100 ml eines 0,1. mo laren Phosphatpuffers vom pH 5,6 imprägniert und ge trocknet. Anschliessend wird das so vorbereitete Papier mit einer kalt gesättigten methanolischen Lösung von 1-[3-Äthylbenzoxazolon(2)]-2-[3-äthylbenzthiazolon(2)]-azin imprägniert und getrocknet. Bringt man auf ein so herge stelltes Reagenzpapier Lösungen von Wasserstoffperoxid in verschiedener Konzentration, so färben sich die Pa piere je nach Wasserstoffperoxid-Konzentration verschie den stark grünblau. Die untere Nachweisgrenze liegt bei 0,01y Wasserstoffperoxid/ml.
BEISPIEL 6 Nachweis von Glucose in Lösung 1 ml einer methanolischen Lösung, welche eine der nachstehend aufgeführten Indikatorverbindungen I' je nach Löslichkeit bis zu einer Konzentration von 1 % ent hält, wird mit 1 ml einer Lösung von 150 mg Glucoseoxi dase und 75 mg Peroxidase in 100 ml eines 0,1 molaren Phosphatpuffers von pH 5,6 und 1 ml einer Glucoselösung vereinigt. Man erhält die in der Tabelle II angegebenen Farbreaktionen. Als Modifier wird jeweils 0,1 ml einer '1 %igen methanolischen Lösung von p-Aminosalicylsäure zugegeben.
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Tabelle <SEP> 11
<tb> Indikator <SEP> l' <SEP> Fp. <SEP> C <SEP> Reaktionsfarbe
<tb> ' <SEP> ohne <SEP> mit <SEP> Modifier
<tb> 2,2'-Azino-di-[3-äthylbenz oxazolon(2)] <SEP> 216-217 <SEP> blau <SEP> rotbraun
<tb> 1-[3-Äthylbenzoxazolon(2)] 2-[1-äthylpyridon(2)]-azin <SEP> 145-146 <SEP> violett <SEP> rot
<tb> 1-13-Äthylbenzoxazolon(2)1 2-[1-äthylchinolinön(2)1-azin <SEP> 199 <SEP> violett <SEP> rot
<tb> 1-[3-Äthylbenzoxazolon(2)] 2-[3-äthylbenzthiazolon(2)1-azin <SEP> 193-194 <SEP> blau <SEP> rot
<tb> 1-[3-Äthylbenzoxazolon(2)] 2-[1,3-diäthylbenzimidazolon(2)]-azin <SEP> 215-216 <SEP> violett <SEP> braunorange
<tb> 1-[3-Äthylbenzoxazolon(2)]-2-11 äthyl-6-chlor-pyridon(2)]-azin <SEP> 145 <SEP> violett <SEP> rot
<tb> 1-[1-Äthyl-3,3-dimethylindolinon(2)] 2-[3-äthylbenz-thiazolon(2)
]-azin <SEP> 208-209 <SEP> rotbraun <SEP> rotviolett
<tb> 1-[1-Äthyl-3,3-dimethylindolinon(2)] 2-[3-methylbenzthiazolon(2)]-azin <SEP> - <SEP> rotbraun <SEP> rotviolett
<tb> 1-[1-Äthyl-3,3-dimethylindolinon(2)] 2-[-äthylchinolinon(2)]-azin <SEP> 199 <SEP> rotorange <SEP> braunorange
<tb> 2,2'-Azino-di[3-äthylbenzoxazolon 2-sulfonsäure-6] <SEP> 258-260 <SEP> blau <SEP> rotbraun
<tb> 2,2'-Azino-di[3-äthylbenzoxazolon- <SEP> [Zers.]
<tb> 2-ammoniumsulfonat-6] <SEP> 300 <SEP> [Zers.] <SEP> blau <SEP> rotbraun
<tb> 1-[1-Äthyl-3,3-dimethylindolinon(2)]- <SEP> 165 <SEP> rot- <SEP> hell 2-[1-äthylpyridon(2)]-azin <SEP> violett <SEP> braun
<tb> 1-[1-Äthyl-3,3-dimethylindolinon(2)]- <SEP> 146 <SEP> blau- <SEP> hell 241-äthyl6-chlorpyridon(2)1-azin <SEP> violett <SEP> braun
<tb> 1-[1-Äthyl-3,3-dimethylindolinon(2)]- <SEP> 177 <SEP> braun- <SEP> braun 241,
3-diäthylbenzimidazolon(2)1-azin <SEP> orange <SEP> orange
<tb> 1-[1,3,3-Trimethylindolinon(2)] 2-[1-phenyl-3-methyl-4-äthyl-1,2,4 triazolon(5)1-azin <SEP> 244 <SEP> grün <SEP> braun
<tb> 1-[1,3,3-Trimethylindolinon(2)]-2 [3-äthylbenzoxazolon(2)]-azin <SEP> 225 <SEP> grün <SEP> blaugrau
<tb> 143-Äthylbenzoxazolon(2)1-2-11-phenyl- <SEP> 3-methyl-4-äthyl-1,2;4-triazolon(5)1-azin <SEP> 227 <SEP> blau. <SEP> - <SEP> rot