DE2744046A1 - Schnelldiagnosticum zur bestimmung von harnsaeure in koerperfluessigkeiten - Google Patents
Schnelldiagnosticum zur bestimmung von harnsaeure in koerperfluessigkeitenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Schnelldiagnosticum zur Bestimmung von Harnsäure in Körperflüssigkeiten, vorzugsweise
in Blut und Serum.
Die Bestimmung von Harnsäure in Blut bzw. Serum ist von großer Bedeutung für die Diagnose der Gicht und anderer
Erkrankungen, bei denen der Purinkörper-Stoffwechsel beeinflußt ist. Normalerweise sind im menschlichen Blut
bis zu 7 mg Harnsäure/100 ml enthalten, bei pathologischen Zuständen kann dieser Wert auf das Doppelte bis
Dreifache steigen.
Es sind eine größere Anzahl von quantitativen Naßverfahren bekannt, die im wesentlichen auf zwei Methoden
basieren: a) Reaktionen, in denen Harnsäure als Reduktionsmittel verwendet wird, z.B. Reduktion von Phosphorwolframsäure
und kolorimetrische Auswertung der entstandenen Blaufärbung, und b) enzymatische Bestimmung von
Harnsäure mit Uricase, wobei das gebildete Wasserstoffperoxid in Gegenwart von Peroxidase ein Chromogen zu
einem Farbstoff oxidiert, dessen Farbtiefe ein Maß für die Konzentration der vorhandenen Harnsäure ist. Diese
Verfahren sind jedoch meist relativ aufwendig und außerdem zeitraubend, da vor der Reaktion alle im Serum enthaltenen
Proteine entfernt werden müssen. So benötigt das z.Zt. exakteste Verfahren nach Kageyama (Clin.Chim.
Acta 3J[, 421 (1971)), das auf der enzymatischen Bestimmung
mit Uricase basiert, eine Gesamtanalysenzeit von ca. 75 Minuten.
Es hat daher nicht an Versuchen gefehlt, Schnelldiagnosti· ca für die Bestimmung der Harnsäure zu entwickeln. Mit
Schnelldiagnostica sind hier Vorrichtungen gemeint, die es gestatten, die gewünschten Substanzen schnell und un-
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kompliziert, z.B. durch ungeschultes Personal bestimmen zu lassen. Es sind dies meist saugfähige Träger, die mit
den entsprechenden Reagenzien getränkt sind oder wasserfeste Filme, in die die Reagenzien eingearbeitet sind.
Eintauchen in die oder Betropfen mit der zu untersuchenden Flüssigkeit bewirkt einen Farbwechsel, der z.B. anhand
von Vergleichsfarben ausgewertet werden kann.
So wird im US-Patent No. 3.536.448 ein Schnelldiagnosticum
beschrieben, das aus zwei Papieren besteht, die zusammengeklebt und mit einer Schutzschicht überzogen werden.
Ein Papier enthält dabei Äthylendiamintetraessigsäure, Natriumwolframat und Hydrazinsulfat, das andere Phosphorwolframat.
Dieses Schnelldiagnosticum gestattet jedoch nur einen qualitativen Nachweis von Harnsäure und gibt
keine Aussage über eventuelle pathologische Zustände.
Im Brit. Patent No. 1.282.089 werden Papiere beschrieben, die Eisen-III-salze, Persulfat und 2,4,6-Tris(2-pyridyl)-1,3,5-triazin
oder 2,2 : 6 , 2 -Terpyridyl enthalten. Es wird angenommen, daß die Eisen-(IH)-Salze mit dem
Triazin oder Terpyridyl Komplexe bilden, die dann durch Harnsäure zu Eisen-(II)-Komplexen reduziert werden, wobei
ein Farbwechsel stattfindet, der direkt proportional der Harnsäure-Konzentration ist. Diese Papiere sind jedoch
extrem lichtempfindlich und somit wenig praxisgerecht.
Gemäß der Jap. OS 9096-789 wird ein Papier, das Uricase und Hilfsstoffe enthält, in Harnsäure-haltiges Serum getaucht.
Nachdem die Uricase die Harnsäure zu Wasserstoffperoxid und Allantoin oxidiert hat, wird dieses Papier
auf ein anderes Papier gedrückt, welches Peroxidase und o-Tolidin enthält. Dabei reagiert das Wasserstoffperoxid
mit dem o-Tolidin zu einem Farbstoff. Es liegt auf der
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Hand, daß dieses Verfahren umständlich ist und wegen der nötigen Diffusionsvorgänge von einem auf das andere
Papier nicht sehr genau sein kann.
Während die oben gesthilderten Schnelldiagnostica von dem Prinzip der direkten kolorimetrischen Bestimmung Gebrauch
machen, bei dem die erzeugte Färbung proportional zur Konzentration der zu messenden Harnsäure ist, wird in
der DT-OS 2.550.634 das Testprinzip der "inversen Kolorimetrie" beschrieben. Hierzu wird eine vorausbestimmte Menge
eines gefärbten Indikators auf einen festen, inerten Träger gebracht. Der nachzuweisende Stoff entfärbt den Indikator,
so daß die Entfärbung proportional zur Menge des zu bestimmenden Stoffes ist. Die Überschreitung der kritischen
Grenzkonzentration des zu bestimmenden Stoffes kann durch die totale Entfärbung einer entsprechenden Indikatormenge
nach dieser Methode sehr genau bestimmt werden.
In der DT-OS 2.550.634 wird u.a. auch ein Schnelldiagnosticum
für Harnsäure in Blut beschrieben. Hierzu wird Glasfaserpapier mit Jod, Kaliumiodid und Stärke imprägniert,
und durch Nachimprägnieren mit einer Membran aus Kollodium und einer zweiten Membran aus Kollodium und festen Natriumcarbonat
überzogen. Harnsäurehaltiges Blut entfärbt den Jod-Stärke-Komplex, nach dem Abwaschen des Blutes kann der
Grad der Entfärbung beurteilt werden. Die Konzentration des Jod-Stärke-Komplexes kann so eingestellt werden, daß
sie gerade der eben pathologischen Harnsäuremenge entspricht und somit eine Ja-Nein-Entscheidung gestattet.
Durch weitere Testbezirke mit anderen Jodkonzentrationen
können abgestufte Entscheidungen herbeigeführt werden. Dieses an sich brauchbare Schnelldiagnosticum hat jedoch
wesentliche Nachteile: Die dreifache Imprägnierung ist sehr aufwendig. Wird die zweite Membran weggelassen, so
muß die zu untersuchende Flüssigkeit vorher alkalisch ge-
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27AA046
macht werden, was für den Benutzer umständlich ist. Desweiteren ist der Teststreifen nicht haltbar, weil Jod
bei Berührung mit Alkalispuren disproportioniert.
Es bestand also das Bedürfnis nach einem einfach herzustellenden und anzuwendenden stabilen Schnelldiagnosticum
zur Bestimmung von Harnsäure im Serum und insbesondere im Blut.
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß man ein solches Schnelldiagnosticum erhält, wenn man von dem Prinzip
der "inversen Kolorimetrie" Gebrauch macht und dabei als Indikatoren die Radikale heterocyclischer Azine der
allgemeinen Formel I
in der
R eine niedere Alkylgruppe und Me ein Alkalimetallatom oder die Ammonium-Gruppe
bedeutet,
verwendet.
verwendet.
Unter einer niederen Alkylgruppe sind Alkylgruppen mit
1-6, vorzugsweise 1-4 Kohlenstoffatomen zu verstehen, insbesondere jedoch die Methyl- und Äthylgruppe.
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Als Salze kommen insbesondere die Ammonium·; Lithium-
und Natrium-Salze infrage.
Die Radikale der Formel I sind tieffarbige Verbindungen, die durch Harnsäure zu den farblosen Azinen
reduziert werden. Bei vorgegebener Radikalmenge ist der Grad der Entfärbung ein Maß für die Harnsäurekonzentration.
Daß die erfindungsgemäßen Radikale die Bestimmung von Harnsäure mit Schnelldiagnostica gestatten, war nicht
vorauszusehen. Es war nur bekannt, daß Harnsäure irgendwie mit dem Radikal der Formel I reagiert, weil Harnsäure
die Oxidation der entsprechenden Azine zum Radikal,z.B.
bei der Bestimmung von Glucose gemäß DBP 1.648.840 und DBP 2.042.828, stört; jedoch war auch bekannt, daß diese
Störung nicht stöchiometrisch ist (D. EBERHARDT et. al. Z.klin.Chem.u.klin.Biochem. £, 362-363 (1971)). Es mußte
deshalb angenommen werden, daß die Azine und Radikale der Formel I für eine quantitative Bestimmung der Harnsäure
nicht geeignet sind.
Die erfindungsgemäßen Schnelldiagnostica können wie folgt hergestellt werden:
Für einen Schnelltest für Harnsäure im Serum kann Papier oder Vlies als saugfähiger Träger verwendet werden. Filterpapier
wirdalso imprägniert mit einem Radikal der Formel I, ferner einem Puffer sowie üblichen Hilfsstoffen,
wie Netzmitteln, Verdickern usw.
Für einen Schnelltest für Harnsäure im Vollblut kann man die o.,g. Papiere anschließend mit Celluloseäthern bzw.
-estern etwa gemäß DBP 1.272.019 oder mit Wachsen gemäß DBP 1.598.048 in organischen Lösungsmitteln nachimprägnieren.
Die sich bildende Membran bzw. die Hydrophobierung des Testpapieres gestattet dann das Abwaschen des Blutes.
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Günstiger ist es jedoch, die Radikale der allgemeinen Formel I in wasserfeste Filme gemäß DBP 1.598.153 einzuarbeiten,
von denen das Blut lediglich abgewischt zu werden braucht.
Die Radikale der Formel I können in Substanz hergestellt werden und zwar durch Oxidation der entsprechenden Azine
mit Jod, Bleitraacetat, Bleidioxid oder anderen geeigneten Oxidationsmitteln (vgl. z.B. Hünig, Liebigs Ann.
Chem. 6_7_6_, 36-51 (1964)). Sie können aber auch durch diese
Oxidationsmittel oder durch Wasserstoffperoxid und Peroxidase in der Imprägnierlösung direkt erzeugt werden. Die
Menge der Radikale, die in den Rezepturen eingesetzt werden, richtet sich nach der Menge an Harnsäure, die man
zu bestimmen wünscht, sie kann empirisch leicht ermittelt werden.
Es ist zweckmäßig, den Rezepturen auch noch die entsprechenden Azine zuzusetzen, damit eine etwaige Disproportionierung
der Radikale sicher verhindert werden kann.
Als Puffer kommen die für Schnellteste üblichen Systeme, wie z.B. Citrat, Phthalat u.a. infrage. Da es unter Umständen
beim Einsatz größerer Mengen Radikal (für höhere Harnsäurekonzentrationen) zu Aussalzerscheinungen kommen
kann, ist es mitunter zweckmäßig, als Kation für die obigen Puffer Lithium einzusetzen.
Der pH-Wert der Puffer soll zwischen 3 und 7, vorzugsweise 4 und 6 liegen. Höhere pH-Werte sind unzweckmäßig,
da sie einen Zerfall der Radikale bewirken.
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Als Netzmittel kommen übliche nichtionogene, anionische
und kationische infrage, wie z.B. Laurylsulfat, Dioctylsulfosuccinat,
Laurylpolyglykoläther, Laurylpyridiniumchlorid und andere mehr.
Als Verdickungsmittel können Alginate, Celluloseäther,
Carboxymethylcellulose und dergleichen verwendet werden.
Als Kunststoffdispersionen zur Herstellung von Testfilmen,
können z.B. die im DBP 1.598.153 beschriebenen verwendet werden, bevorzugt werden Polyvinylpropionat, -acetat und
Mischpolymerisate hiervon.
Die Testpapiere bzw. Testfilme werden in üblicher Weise hergestellt, in kleine Vierecke (z.B. 6x6 mm) geschnitten
und auf stäbchenförmige Träger, vorzugsweise auf Folien aufgeklebt, aufgesiegelt oder in anderer Weise befestigt.
Teststäbchen mit nur einem Testbezirk eignen sich bevorzugt für die Messung in einfachen Reflexionsphotometern
oder für den visuellen Vergleich mit Vergleichsfarben. Von besonderem Vorteil ist es jedoch, auf einem Teststäbchen
mehrere Testbezirke mit steigenden Radikalkonzentrationen aufzubringen. Man erhält hierbei nach dem
Aufbringen der Untersuchungsflüssigkeit eine Reihe ganz, teilweise und gar nicht entfärbter Testbezirke, in der
der Äquivalenzpunkt, d.h. der Punkt der gerade stattgefundenen Entfärbung auch ohne Vergleichs farben eindeutig
zu erkennen ist.
In den nachfolgenden Beispielen soll die Erfindung näher erläutert werden, wobei folgende Abkürzungen gebraucht
werden:
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- το -
27440Α6
Radikal A = Radikal des Diammonium-Salzes der Azinobis-N-äthyl-benzthiazolon-disulfosäure
Radikal B = Radikal des Dilithium-Salzes der Azinobis-N-äthyl-benzthiazolon-disulfosäure
Radikal C = Radikal des Dilithium-Salzes der Azinobis-N-methylbenzthiazolon-disulfosäure
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27AA0A6
Beispiel 1
Polyvinylacetatpropionat-Dispersion 45 g
Natriumalginat, 1,85 % in 0,5 M Phosphat- 35 g puffer pH 5,6
Radikal A ~~| χ g
I in 22 ml
Azino-bis-N-äthyl-benzthiazolon-di- j>Wasser
sulfosäure, Diammonium-Salz I y g
sulfosäure, Diammonium-Salz I y g
Dioctylnatriumsulfosuccinat in 8 ml 0,75 g
Methanol
Rezeptur
χ 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08 0,09 0,1 g y 0,25 0,30 0,35 0,40 0,45 0,50 0,60 g
Die Bestandteile wurden gründlich verrührt und zur Entfernung von Luftblasen 5 min. lang bei 1500U/min. zentrifugiert.
Danach wurden 0,38 mm dicke Filme auf einer PoIycarbonatfolie
aufgestrichen und 30 min. bei 500C getrocknet. Die beschichteten Materialien wurden in 6mm breite
Streifen geschnitten und im Abstand von 1 mm nebeneinander auf eine Polyesterfolie aufgesiegelt. Diese wurde in 6 mm
breite Stäbchen geschnitten, so daß man Teststreifen erhielt, die nebeneinander die sieben Testbezirke a bis g
enthielten.
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Die Teststreifen wurden mit Seren, welche 2, 4, 6, 8 und 10 mg Harnsäure/100 ml enthielten, betropft und
nach 5 min. abgewischt. Es wurde folgendes Ergebnis erhalten:
Serum
mg/100 ml
mg/100 ml
2 kein Testbezirk vollständig entfärbt
4 Entfärbung der Testbezirke a und b
6 Entfärbung der Testbezirke a bis d
8 Entfärbung der Testbezirke a bis f
10 Entfärbung aller Testbezirke
Der Harnsäuregehalt des Serums kann also auf folgende Weise leicht abgeschätzt werden:
mg Harnsäure/100 ml = Zahl der entfärbten Testbezirke +
Polyvinylacetatpropionat-Dispersion 45 g
Natriumalginat, 1,85 % in 0,5 M Lithium-
citrat-Puffer pH 5 35 g
Radikal 6 0,2 g
Azino-bis-N-äthyl-benzthiazolon-disulfo-
säure, Dilithium-Salz 0,2 g
Fluoriertes nichtionogenes Netzmittel
(Forafac 1110") 0,2 g
Wasser dest. 20 ml
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-Ii-
Die Masse wurde wie in Beispiel 1 beschrieben gemischt, zentrifugiert, ausgestrichen und getrocknet.
Nach dem Schneiden wurden analog Beispiel 1 Teststreifen hergestellt, die nur einen Testbezirk trugen.
Der Testbezirk wurde mit harnsäurehaltigem Blut betropft, nach 1min. abgewischt und an einen handelsüblichen Reflexionsphotometer
(Reflomat®) vermessen.
Das Ergebnis ist in Tabelle 1 zusammengestellt:
| mg % Harnsäure | Skalenteile |
| O | 45 |
| 2 | 42 |
| 3 | 38,5 |
| 4 | 35 |
| 5 | 32 |
| 6 | 28 |
| 7 | 23,5 |
| 8 | 21,5 |
| 9 | 19 |
| 10 | 16 |
| 11 | 13,5 |
| 12 | 9 |
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B e i s ρ i e 1. 3
| 50 | ml |
| 0,175 | g |
| 0,2 | g |
| 0,1 | g |
| 100 | ml |
Filterpapier (Schleicher & Schüll 2316) wurde mit einer Lösung folgender Zusammensetzung imprägniert und bei
SO0C getrocknet:
Lithiumcitrat-Puffer pH 6, 0,5 molar Radikal C
Azino-bis-N-methylbenzthiazolon-disulfosäure,
Dilithiumsalz
Laurylpolyoxyäthylenäther
Wasser,dest. ad
Das Papier wird in 6 mm breite Streifen geschnitten und mittels eines Transferklebers auf eine Polystyrol-Folie
aufgeklebt. Diese wird in 6 mm breite Stäbchen geschnitten, die dann am unteren Ende einen quadratischen Testbezirk
tragen.
Die Teststäbchen werden in harnsäurehaltiges Serum getaucht und nach 60 see. beurteilt. Serum mit 8 mg Harnsäure/100
ral führt zu einer vollständigen Entfärbung, während solches mit 7 mg/100 ml noch eine grüne Färbung
erkennen läßt. Wünscht man die völlige Entfärbung bei 7 mg/100 ml, so muß man 0,155 g Radikal einwiegen; für
9 mg werden 0,195 g benötigt. Man kann auf diese Weise also jeden gewünschten Schwellenwert einstellen.
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Claims (6)
1.) Schnelldiagnosticum zur Bestimmung von Harnsäure in
Körperflüssigkeiten nach dem Prinzip der inversen Kolorimetrie, dadurch gekennzeichnet, daß als Indikator
ein Radikal der allgemeinen Formel I
in der
R eine niedere Alkylgruppe und Me ein Alkalimetallatom oder eine Ammoniumgruppe
bedeutet,
verwendet wird.
verwendet wird.
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2. Schnelldiagnosticum gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich zu dem Radikal der
Formel I das entsprechende Azin enthält.
3. Schnelldiagnosticum gemäß Anspruch 1 und 2, dadurch
gekennzeichnet, daß übliche Hilfsstoffe wie Puffer, Netzmittel und Verdickungsmittel enthalten sind.
4. Schnelldiagnosticum gemäß Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet,
daß die Reagenzien auf einen saugfähigen Träger imprägniert sind.
5. Schnelldiagnosticum gemäß Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet,
daß die Reagenzien in einen Kunststofffilm eingebettet sind.
6. Schnelldiagnosticum gemäß Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet,
daß mehrere Testfelder mit verschiedenen Indikatormengen nebeneinander auf einem Träger
befestigt sind.
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