LU80288A1 - Schnelldiagnosticum zur bestimmung von harnsaeure in koerperfluessigkeiten - Google Patents
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Description
D. 5ο.ο19
Λ Q Ο (flAND-DUCHÉ DE LUXEMBOURG Brevet N»...................Q \J Cm ™ Q
du ..27.. septe±are l978.. Monsieur le Ministre ,,,. , de l’Économie Nationale et des Classes Moyennes
Titre delivre : ........................................
Service de la Propriété Industrielle
7n T) LUXEMBOURG
If 4 [i/W
, n to.y Demande de Brevet d’invention % -l|r [ I. Requête ..........La.....société...dite, t.....B.QEHRIMG.BR .....LSSMIfD:.....d) ..........EOF,.....Alleii3agn.e....F.êdâra.le./....représen.fcéa....par.....KQnsienr.....Jacques......................
.........de....J3uyser·./......agis saut... en....quali té.....de...iaandataire........................................................................(2) dépose ce v.ing.t“.se.pt septembre..19.00... soixante-dix-huit (3) à..............15........ .. heures, au Ministère de l’Économie Nationale et des Classes Moyennes, à Luxembourg : 1. la présente requête pour l’obtention d’un brevet d’invention concernant : ...........lScImelldiagnos.tic\m....2iiur.....Bas.t±nMung.... Aron....E!,sr η s Eur e.....in....................................(4) * ...............Korperf lüssigkeitend.....................................................................................................................................................................................
déclare, en assumant la responsabilité de cette déclaration, que l’(es) inventeur(s) est (sont) : ..........l-.“..J:ralfgêng....IKHiBR,....Mai.ss£n^ ...........................Alliar.agne-.~FSdsra.le..................................................................................................................................................................................
...........2...“....Kaltar....RXTiEESDQEE./.....E2.ss.elar-S.tr.a3se.....6.,.............
...........................HOE.f....Allaiaagna....H’éddr.ale..........................................................................................................................................................
2. la délégation de pouvoir, datée de ........... le ...iQ.....SLO-ilt.....1S.7.3................
3. la description en langue..........2ll.S>û^D.Q.©.................................. de l’invention en deux exemplaires; 4.........//............. ... planches de dessin, en deux exemplaires ; 5. la quittance des taxes versées au Bureau de l'Enregistrement à Luxembourg, le............27.....Êsataré/ir <3.....1.S..7..8................................................................................................................................................................................................
revendique pour la susdite demande de brevet la priorité d’une (des) demande(s) de (6)________________________Lr.SiV.efc.............................................déposée(s) en (7)......Α11.01ΰδ5.Π.δ....Χβ0&.Γ.51.1.3................................................
le............ÀQ..„sGpt.ezsbr a..~19.7.7..........(iïo. £.2.7. 4.4 oA 6.6.)..........................................................................................(8) au nom de ......la....CLg.po.S£IltS..........................................................................................................................................................................................(9) élit domicile pour lui (elle) et, si désigné, pour son mandataire, à Luxembourg ........................................
...........35.,......bld......Eo^’ctl................................................................. .............................................................................................................. (10) sollicite la délivrance d’un brevet d’invention pour l’objet décrit et représenté dans les annexes ^usmenti^mé^—· avec ajournement de cette délivrance à ...... 18.............................. mois.
II. Procès-verbal de Dépôt
La susdite demande de brevet d’invention a été déposée au Ministère de l’Économie Nationale et des Classes Moyennes, Service de la Propriété Industrielle à Luxembourg, en date du : 27 .»ç-gvh--/: -bre 19 7 8 -r-ïf''”''···.. Pr. le Ministre a IB '· '·. de l’Économie National?’et des Classes Moyennes, /— , / a...............**"*........ ncuies »,· ·? ·.·. 4 ·.
I /·.. i f l 3' t-'~v * d · : / P· ri'' /1 d d g v / ; r·*. '·' f / ^ Λ ΤΆ. -y ' " "Ί D. 5ο.ο19
BEANSPRUCHUNG DER PRIORITÄT
* _der Patent/QW· - Anmeldung_
IN: DER BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND
Vom: 3o. SEPTEMBER 1977
PATENTANMELDUNG
in
Luxemburg
Anmelder: BOEHRINGER MANNHEIM GMBH
Betr.: "Schnelldiagnosticum zur Bestimmung von Harnsäure in Körperflüssigkeiten".
Der Text enthält:
Eine Beschreibung: Seite 3 bis 15 gefolgt von:
Patentansprüchen : Seite 1 bis 2 % , - 3 - »
Die Erfindung betrifft ein Schnelldiagnosticum zur Bestimmung von Harnsäure in Körperflüssigkeiten, vorzugsweise in Blut und Serum.
Die Bestimmung von Harnsäure in Blut bzw. Serum ist von großer Bedeutung für die Diagnose der Gicht und anderer Erkrankungen, bei denen der Purinkörper-Stoffwechsel beeinflußt ist. Normalerweise sind im menschlichen Blut bis zu 7 mg Harnsäure/100 ml enthalten, bei pathologischen Zuständen kann dieser Wert auf das Doppelte bis Dreifache steigen.
»
Es sind eine größere Anzahl von quantitativen Naßverfahren bekannt, die im wesentlichen auf zwei Methoden basieren: a) Reaktionen, in denen Harnsäure als Reduktionsmittel verwendet wird, z.B, Reduktion von Phosphor-wolframsäure und kolorimetrische Auswertung der entstandenen Blaufärbung, und b) enzymatische Bestimmung von Harnsäure mit Uricase, wobei das gebildete Wasserstoffperoxid in Gegenwart von Peroxidase ein Chromogen zu einem Farbstoff oxidiert, dessen Farbtiefe ein Maß für die Konzentration der"vorhandenen Harnsäure ist. Diese Verfahren sind jedoch meist relativ aufwendig und außerdem zeitraubend, da vor der Reaktion alle im Serum enthaltenen Proteine entfernt werden müssen. So benötigt das z.Zt. exakteste Verfahren nach Kageyama (Clin.Chim. Acta 3J_, 421 (1971)), das auf der enzymatischen Be-* Stimmung mit Uricase basiert, eine Gesamtanalysenzeit von ca. 75 Minuten.
Es hat daher nicht an Versuchen gefehlt, Schnelldiagnosti-ca für die Bestimmung der Harnsäure zu entwickeln. Mit Schnelldiagnostica sind hier Vorrichtungen gemeint, die es gestatten, die gewünschten Substanzen schnell und un-
V
- 4 - kompliziert, z.B. durch ungeschultes Personal bestimmen zu lassen. Es sind dies meist saugfähige Träger, die mit den entsprechenden Reagenzien getränkt sind oder wasserfeste Filme, in die die Reagenzien eingearbeitet sind. Eintauchen in die oder Betropfen mit der zu untersuchenden Flüssigkeit bewirkt einen Farbwechsel, der z.B. anhand von Vergleichsfarben ausgewertet werden kann.
So wird im US-Patent No. 3.536.448 ein Schnelldiagnosti-cum beschrieben, das aus zwei Papieren besteht, die zu-- sammengeklebt und.mit- einer Schutzschicht überzogen werden. * Ein Papier enthält dabei Äthylendiamintetraessigsäure,
Natriumwolframat und Hydrazinsulfat, das andere Phosphor-wolframat. Dieses Schnelldiagnosticum gestattet jedoch nur einen qualitativen Nachweis von Harnsäure und gibt keine Aussage über eventuelle pathologische Zustände.
Im Brit. Patent No. 1.282.089 werden Papiere beschrieben, die Eisen-III-salze, Persulfat und 2,4,6-Tris(2-pyridyl)- 1 1 11 1,3,5-triazin oder 2,2 : 6 , 2 -Terpyridyl enthalten.
Es wird angenommen, daß die Eisen-(III)-Salze mit dem Triazin oder Terpyridyl Komplexe bilden, die dann durch Harnsäure zu Eisen-(II)-Komplexen reduziert werden, wobei ein Farbwechsel stattfindet, der direkt proportional der Harnsäure-Konzentration ist. Diese Papiere sind jedoch extrem lichtempfindlich und somit wenig praxis gerecht.
Gemäß der Jap. OS 9096-789 wird ein Papier, das Uricase und Hilfsstoffe enthält, in Harnsäure-haltiges Serum getaucht. Nachdem die Uricase die Harnsäure zu Wasserstoffperoxid und Allantoin oxidiert hat, wird dieses Papier auf ein anderes Papier gedrückt, welches Peroxidase und o-Tolidin enthält. Dabei reagiert das Wasserstoffperoxid mit dem o-Tolidin zu einem Farbstoff. Es liegt auf der
V
- 5 -
Hand, daß dieses Verfahren umständlich ist und wegen der nötigen Diffusionsvorgänge von einem auf das andere Papier nicht sehr genau sein kann.
Während die oben geschilderten Schnelldiagnostica von dem Prinzip der direkten kolorimetrischen Bestimmung Gebrauch machen, bei dem die erzeugte Färbung proportional zur Konzentration der zu messenden Harnsäure ist, wird in der DT-OS 2.550,63¾. das Testprinzip der "inversen Kolori-metrie" beschrieben. Hierzu wird eine vorausbestimmte Menge eines gefärbten Indikators auf einen festen, inerten Träger gebracht. Der nachzuweisende Stoff entfärbt den Indikator, so daß die Entfärbung proportional zur Menge des zu bestimmenden Stoffes ist. Die Überschreitung der kritischen Grenzkonzentration des zu bestimmenden Stoffes kann durch die totale Entfärbung einer entsprechenden Indikatormenge nach dieser Methode sehr genau bestimmt werden.
In der DT-OS^ 2.550.634 wird u.a. auch ein Schnelldiagnosti-cum für Harnsäure in Blut beschrieben. Hierzu wird Glasfaserpapier mit Jod, Kaliumjodid und Stärke imprägniert, und durch Nachimprägnieren mit einer Membran aus Kollodium und einer zweiten Membran aus Kollodium und festen Natriumcarbonat überzogen. Harnsäurehaltiges Blut entfärbt den Jod-Stärke-Komplex, nach dem Abwaschen des Blutes kann der Grad, der Entfärbung beurteilt werden. Die Konzentration des Jod-Stärke-Komplexes kann so eingestellt werden, daß » sie gerade der eben pathologischen Harnsäuremenge entspricht und somit eine Ja-Nein-Entscheidung gestattet.
Durch weitere Testbezirke mit anderen Jodkonzentrationen können abgestufte Entscheidungen herbeigeführt werden. Dieses an sich brauchbare Schnelldiagnosticum hat jedoch wesentliche Nachteile: Die dreifache Imprägnierung ist sehr aufwendig. Wird die zweite Membran weggelassen, so muß die zu untersuchende Flüssigkeit vorher alkalisch ge- -*fc - 6 - macht werden, was für den Benutzer umständlich ist. Des-weiteren ist der Teststreifen nicht haltbar, weil Jod bei Berührung mit Alkalispuren disproportioniert.
Es bestand also das Bedürfnis nach einem einfach herzustellenden und anzuwendenden stabilen Schnelldiagnosti-cum zur Bestimmung von Harnsäure im Serum und insbesondere im Blut.
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß man ein ' solches Sehnelldiagnosticum erhält, wenn man von dem Prinzip der "inversen Kolorimetrie" Gebrauch macht und dabei als Indikatoren die Radikale heterocyclischer Azine der allgemeinen Formel I
f (I)> + l λ •R S.
in der R eine niedere Alkylgruppe und Me ein Alkalimetallatom oder die Ammonium-Gruppe ^ bedeutet, verwendet.
Unter einer niederen Alkylgruppe sind Alkylgruppen mit 1-6, vorzugsweise 1-4 Kohlenstoffatomen zu verstehen, insbesondere jedoch die Methyl- und Äthylgruppe.
4 *» - 7 -
Als Salze kommen insbesondere die Ammonium·; Lithium-und Natrium-Salze infrage.
Die Radikale der Formel I sind tieffarbige Verbindungen, die durch Harnsäure zu den farblosen Azinen reduziert werden. Bei vorgegebener Radikalmenge ist der Grad der Entfärbung ein Maß für die Harnsäurekonzentration. Daß die erfindungsgemäßen Radikale die Bestimmung von Harnsäure mit Schnelldiagnostica gestatten, war nicht vorauszusehen. Es war nur bekannt, daß Harnsäure irgend-. wie mit dem Radikal der Formel I reagiert, weil Harnsäure die Oxidation der entsprechenden Azine zum Radikal,z.B. bei der Bestimmung von Glucose gemäß DBP 1.648.840 und DBP 2.042.828, stört; jedoch war auch bekannt, daß diese Störung nicht stöchiometrisch ist(D. EBERHARDT et. al.
Z.klin.Chem.u.klin.Biochem, £, 362-363 (1971)0· Es mußte deshalb angenommen werden, daß die Azine und Radikale der Formel I für eine quantitative Bestimmung der .Harnsäure nicht geeignet sind.
Die erfindungsgemäßen Schnelldiagnostica können wie folgt hergestellt werden: Für einen Schnelltest für Harnsäure im Serum kann Papier oder Vlies als saugfähiger Träger verwendet werden. Filterpapier wird also imprägniert mit einem Radikal der Formel I, ferner einem Puffer sowie üblichen Hilfsstoffen, wie Netzmitteln, Verdickern usw.
Für einen Schnelltest für Harnsäure im Vollblut kann man die o.,g. Papiere anschließend mit Celluloseäthern bzw. -estern etwa gemäß DBP 1.272.019 oder mit Wachsen gemäß DBP 1.598.048 in organischen Lösungsmitteln nachimprägnieren. Die sich bildende Membran bzw. die Hydrophobierung des Testpapieres gestattet dann das Abwaschen des Blutes.
·/· -8- Günstiger ist es jedoch, die Radikale der allgemeinen Formel I in wasserfeste Filme gemäß DBP 1.598.153 einzuarbeiten, von denen das Blut lediglich abgewischt zu werden braucht.
Die Radikale der Formel I können in Substanz hergestellt werden und zwar durch Oxidation der entsprechenden Azine mit Jod, Bleitraacetat, Bleidioxid oder anderen geeigneten Oxidationsmitteln (vgl. z.B. Hünig, Liebigs Ann,
Chem. 676, 36-51 (1964)), Sie können aber auch durch diese Oxidationsmittel oder durch Wasserstoffperoxid und Peroxidase in der Imprägnierlösung direkt erzeugt werden. Die » Menge der Radikale, die in den Rezepturen eingesetzt werden, richtet sich nach der Menge an Harnsäure, die man zu bestimmen wünscht, sie kann empirisch leicht ermittelt werden.
Es ist zweckmäßig, den Rezepturen auch noch die entsprechenden Azine zuzusetzen, damit eine etwaige Disproportionierung der Radikale sicher verhindert werden kann.
Eine solche Disproportionierung kann weiterhin durch den Zusatz von neutralen anorganischen Alkalisalzen wie Chloriden, Bromiden', Sulfaten u.a. verhindert werden,
Als Puffer kommen die für Schnellteste üblichen Systeme, wie z.B. Citrat, Phthalat u.a. infrage. Da es unter Umständen beim Einsatz größerer Mengen Radikal (für höhere Harnsäurekonzentrationen) zu Aussalzerscheinungen kommen kann, ist es mitunter zweckmäßig, als Kation für die obigen Puffer Lithium einzusetzen.
Der pH-Wert der Puffer soll zwischen 3 und 7, vorzugsweise 4 und 6 liegen. Höhere pH-Werte sind unzweckmäßig, da sie einen Zerfall der Radikale bewirken.
• Λ - 9 -
Als Netzmittel kommen übliche nichtionogene, anionische und kationische infrage, wie z.B. Laurylsulfat, Dioc-tylsulfosuccinat, Laurylpolyglykoläther, Laurylpyridini-umchlorid und andere mehr.
Als Verdickungsmittel können Alginate, Celluloseäther, Carboxymethylcellulose und dergleichen verwendet werden.
Als Kunststoffdispersionen zur Herstellung von Testfilmen, können z.B. die im DBP 1.598.153 beschriebenen verwendet v werden, bevorzugt werden Polyvinylpropionat, -acetat und Mischpolymerisate hiervon.
Die Testpapiere bzw. Testfilme werden in üblicher Weise hergestellt, in kleine Vierecke (z.B. 6x6 mm) geschnitten und auf stäbchenförmige Träger, vorzugsweise auf Folien aufgeklebt, aufgesiegelt oder in anderer Weise befestigt. Teststäbchen mit nur einem Testbezirk eignen sich bevorzugt für die Messung in einfachen Reflexionsphotometern oder für den visuellen Vergleich mit Vergleichsfarben.
Von besonderem Vorteil ist es jedoch, auf einem Teststäbchen mehrere Testbezirke mit steigenden Radikalkonzentrationen aufzubringen. Man erhält hierbei nach dem Aufbringen der Untersuchungsflüssigkeit eine Reihe ganz, teilweise und gar nicht entfärbter Testbezirke, in der der Äquivalenzpunkt, d.h. der Punkt der gerade stattgefundenen Entfärbung auch ohne Vergleichs'farben eindeutig , zu erkennen ist.
In den nachfolgenden Beispielen soll die Erfindung näher erläutert werden, wobei folgende Abkürzungen gebraucht werden: - 10 - ^ *
Radikal A = Radikal des Diammonium-Salzes der Azinobis -N-äthyl-benzthiazolon-disul£osäure
Radikal B = Radikal des Dilithium-Salzes der Azinobis -N-äthyl-benzthiazolon-disulfosäure
Radikal C = Radikal des Dilithium-Salzes der Azino-bis-N-methylbenzthiazolon-disulfosäure «
Beispiel 1 % - 11 - * -*
Zusammensetzung
Polyvinylacetatpropionat-Dispersion 45 g
Natriumalginat, 1,85 % in 0,5 M Natrium^Phospat- 35 g puffer pH 5,6
Radikal A (33,8lig) x g I in 22 ml
Azino-bis-N-äthyl-benzthiazolon-di- .^Wasser sulfosäure, Diämmonium-Salz y g
Dioctylnatriumsulfosuccinat in 8 ml 0,75 g
Methanol
Rezeptur a b c d e f g x 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08 0,09 0,1 g y 0,25 0,30 0,35 0,40 0,45 0,50 0,60 g
Die Bestandteile wurden gründlich verrührt und zur Entfernung von Luftblasen 5 min. lang bei 1500U/min. zentrifugiert. Danach wurden 0,38 mm dicke Filme auf einer Polycarbonatfolie aufgestrichen und 30 min. bei 50°C getrocknet. Die beschichteten Materialien wurden in 6mm breite Streifen geschnitten und im Abstand von 1 mm nebeneinander auf eine Polyesterfolie aufgesiegelt. Diese wurde in 6 mm breite Stäbchen geschnitten, so daß man Teststreifen erhielt, die nebeneinander die sieben Testbezirke a bis g enthielten.
·% - 12 - *
Die Teststreifen wurden mit Seren, welche 2, 4, 6, 8 und 10 mg Harnsäure/100 ml enthielten, betropft und nach 5 min. abgewischt. Es wurde folgendes Ergebnis erhalten:
Serum mg/100 ml 2 kein Testbezirk vollständig entfärbt 4 Entfärbung der Testbezirke a und b * 6 Entfärbung der Testbezirke a bis d 8 Entfärbung der Testbezirke a bis f 10 Entfärbung aller Testbezirke
Der Harnsäuregehalt des Serums kann also auf folgende Weise leicht abgeschätzt werden: mg Harnsäure/100 ml = Zahl der entfärbten Testbezirke + 2.
Beispiel 2
Zus amme ns e t z un g
Polyvinylacetatpropionat-Dispersion 45 g ' Natriumalginat, 1,85 % in 0,5 M Lithiumcitrat-Puffer pH 5 35 g
Radikal B (35,l%ig) 0,2 g
Azino-bis-N-äthyl-benzthiazolon-disulfo- säure, Dilithium-Salz 0,2 g
Fluoriertes nichtionogenes Netzmittel (Forafac 1110") 0,2 g
Wasser dest. 2C ml / »/ · - 13 - w *
Die Masse wurde wie in Beispiel 1 beschrieben gemischt, zentrifugiert, ausgestrichen und getrocknet.
Nach dem Schneiden wurden analog Beispiel 1 Teststreifen hergestellt, die nur einen Testbezirk trugen.
Der Testbezirk wurde mit harnsäurehaltigem Blut betropft, nach 1min. abgewischt und an einen handelsüblichen Reflexionsphotometer (Reflomat®) vermessen.
Das Ergebnis ist in Tabelle 1 zusammengestellt: mg % Harnsäure Skai enteile.
0 45 2 · 42 3 38,5 4 35 5 32 6 28 7 23,5 8 21,5 9 19 10 16 11 13,5 12 9 4
Bei. spiel. 3 - 14 -
Filterpapier (Schleicher & Schüll 2316) wurde mit einer Lösung folgender Zusammensetzung imprägniert und bei 50°C getrocknet:
Lithiumcitrat-Puffer pH 6, 0,5 molar 50 ml
Radikal C (32,5%ig) 0,175 g
Azino-bis-N-methylbenzthiazolon-di- sulfosäure, Dilithiumsalz 0,2 g
Laurylpolyoxyäthylenäther 0,1 g
Wasser,dest. ad 100 ml
Das Papier wird in 6 mm breite Streifen geschnitten und mittels eines Transferklebers auf eine Polystyrol-Folie aufgeklebt. Diese wird in 6 mm breite Stäbchen geschnitten, die dann am unteren Ende einen quadratischen Testbezirk tragen.
Die Teststäbchen werden in harnsäurehaltiges Serum getaucht und nach 60 sec. beurteilt, Serum mit 8 mg Harnsäure/ 100 ml führt zu einer vollständigen Entfärbung, während solches mit 7 mg/100 ml noch eine grüne Färbung * erkennen läßt. Wünscht man die völlige Entfärbung bei 7 mg/100 ml, so muß man 0,155 g Radikal einwiegen; für 9 mg werden· 0,195 g benötigt. Man kann auf diese Weise also jeden gewünschten Schwellenwert einstellen.
Μ *
Beispiel 4 - 15 -
Zus ammens etzung
Polyvinylacetatpropionat-Dispersion 45 g
Natriumalginat, 1,5 % in 0,5 M wässriger 35
Ammoniumbromid-Lösung ^
Radikal A (99,5Hg) 50 mg
Azino-bis-N-äthyl-benzthiazolon-disulfo- 03a säure, Diammoniumsalz ' 5
Fluoriertes nichtionogenes Netzmittel .0,2 g
Wasser, dest. 14,0 ml mit 0,5 M Ammoniak auf pH 5 einstellen.
Von der Masse wurden 0,3 mm dicke Filme ausgestrichen, die 30 min bei 50° C getrocknet und analog Beispiel 2 zu Teststreifen mit einem Testbezirk weiter verarbeitet, wurden.
Der Testbezirk wurde mit harnsäurehaltigem Serum betropft, nach einer Minute abgewischt und nach einer weiteren Minute an einem handelsüblichen Remissionsphotometer (Zeiß, PMQ III) bei 520 nm vermessen.
Das Ergebnis ist in Tabelle 2 zusammengestellt: ‘ mg % Harnsäure % Remission 1 39,9 3 42,1 5 44,1 7 46,2 9 48,4 11 50,8 13 52,6
Claims (6)
1. Schnelldiagnosticum zur Bestimmung von Harnsäure in Körperflüssigkeiten nach dem Prinzip der inversen Kolorimetrie, dadurch gekennzeichnet, daß als Indikator ein Radikal der allgemeinen Formel I CD, * \ \ R ' U | in der R eine niedere Alkylgruppe und Me ein Alkalimetallatom oder eine Ammoniumgruppe bedeutet, verwendet wird.
, - 2 - * V * 2. Schnelldiagnosticum gemäß Anspruch 1, dadurch ge kennzeichnet, daß es zusätzlich zu dem Radikal der Formel I das entsprechende Azin enthält.
3. Schnelldiagnosticum gemäß Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß'übliche Hilfsstoffe wie Puffer, Netzmittel und Verdickungsmittel enthalten sind. ♦
4. Schnelldiagnosticum gemäß Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagenzien auf einen saugfähigen Träger imprägniert sind.
5. Schnelldiagnosticum gemäß Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagenzien in einen Kunststofffilm eingebettet sind.
6. Schnelldiagnosticum gemäß Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß mehrere Testfelder mit verschiedenen Indikatormengen nebeneinander auf einem Träger befestigt sind. 4 *
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