Vynález se týká rychlého diagnostika ke stanovení kyseliny močové v tělních . tekutinách, zejména v krvi a séru.
Stanovení kyseliny močové v krvi, popřípadě v séru je velmi důležité pro diagnózu dny a jiných onemocnění, při nichž je ovlivňován metabolismus purinových derivátů. V lidské krvi je obvykle obsaženo až 7 mg kyseliny močové/100 ml, při patologických stavech může však tato hodnota vystoupit na dvojnásobek až trojnásobek.
Je známo velké množství kvantitativních mokrých způsobů, které jsou v podstatě založeny na dvou metodách: a) reakce, .při nichž se používá kyseliny močové jako redukčního činidla, například redukce kyseliny fosfowolframové a kolorimetrické vyhodnocení vzniklého modrého zbarvení, b) enzymové stanovení kyseliny močové urikázou, při kterém vzniklý peroxid vodíku oxiduje v přítomnosti peroxidázy chromogen na barvivo, jehož hloubka zbarvení je mírou koncentrace přítomné kyseliny · močové. Tyto způsoby jsou však většinou poměrně nákladné a kromě toho náročné na čas, protože před reakcí musí být odstraněny všechny bílkoviny obsažené v séru. Tohoto času nejpřesnější způsob, který popsal Kageyama [Clin. Chim. Acta 31, 421, 1971), a který je založen na· enzymovém stanovení pomocí urikázy, vyžaduje celkovou dobu analýzy asi 75 minut.
Nechyběly tudíž pokusy vyvinout · rychlé diagnostikům pro stanovení kyseliny · močové. Jako rychlá diagnostika se zde míní pomůcky, které dovolují rychlé a nekomplikované stanovení požadovaných látek, například neskoleným personálem. Jsou to většinou savé nosiče, které jsou napojeny příslušnými reagenciemi nebo vodovzdorné filmy, do kterých jsou reagencie vpraveny. Ponoření nebo pokapání zkoušenou tekutinou vyvolá změnu barvy, kterou lze hodnotit například pomocí srovnávacích barev.
Tak je v USA patentu č. 3 536 448 popisováno rychlé diagnostikům, které se skládá ze dvou papírku, které jsou slepeny a potaženy ochrannou vrstvou. Jeden papírek přitom obsahuje kyselinu etyléndiamintetraoctovou, wolframan sodný a síran hydrazinu, druhý papírek fosfowolframan. Toto rychlé diagnostikům dovoluje však jenom kvalitativní důkaz kyseliny močové a neposkytuje žádnou indikaci případných patologických stavů.
V britském patentu č. 1 282 089 jsou popisovány papírky, které obsahují soli trojmocného železa, persíran a 2,4,6-tris(2-pyridyl)-1,3,5-triazin nebo 2,21: e^žU-terpyridyl.
Předpokládá se, že soli trojmocného železa tvoří komplexy s triazinem nebo terpyridylem, které jsou potom redukovány kyselinou močovou v komplexy dvojmocného železa, přičemž dochází ke změně barvy, která je přímo úměrná koncentraci kyseliny močové. Tyto papírky jsou však velice citlivé na světlo, tudíž málo vhodné pro praktické využití.
Podle japonského patentu č. 9096—-789 se namáčí do séra obsahujícího kyselinu močovou papírek, který obsahuje urikázu a pomocné látky. Když urlkáza zoxiduje kyselinu močovou na peroxid vodíku a alantoin, přitiskne se tento papírek na jiný papírek, který obsahuje peroxidázu a o-tolidin. Peroxid vodíku přitom reaguje s o-tolidinem za vzniku barviva. Je jasné, že tento způsob je zdlouhavý a vzhledem k nezbytným difúzním procesům z jednoho papírku na druhý nemůže být příliš přesný.
Zatímco výše uvedená rychlá diagnostika využívají principu přímého kolorimetrického stanovení, při němž vzniklé zbarvení je úměrné koncentraci měřené kyseliny močové, je v německém patentu č. 2 550 634 popsán princip testu „inverzní kolorimetrie“. Při něm se nanáší předem určené množství barevného indikátoru na pevný netečný nosič. Hodnocená látka odbarvuje indikátor tak, že odbarvení je úměrné množství stanovené látky. Překročení kritické mezní koncentrace stanovené látky lze touto metodou velice přesně určit pomocí úplného odbarvení odpovídajícího množství indikátoru.
V · německém patentu . č. 2 550 634 je popisováno rychlé diagnostikům pro stanovení kyseliny močové v krvi. Pro tento účel se impregnuje .papír ze skelných vláken jódem, jodidem draselným a škrobem a dalším impregnováním se potahuje membránou z kolodia a další membránou z kolodia a pevného · uhličitanu . sodného. Krev obsahující kyselinu močovou odbarvuje jódškrobový komplex, po smytí krve lze hodnotit · stupeň odbarvení. Koncentraci jódškrobového komplexu lze nastavit tak, že přesně odpovídá právě patologickému množství kyseliny močové a umožňuje kladné nebo záporné rozhodnutí. Pomocí dalších zkušebních oblastí s jinými koncentracemi jódu lze provádět odstupňovaná hodnocení. Toto samo o sobě použitelné diagnostikům má však podstatné nevýhody: trojnásobná impregnace je velmi nákladná. Vypustí-li se druhá membrána, musí být zkoušená tekutina předem zalkalizována, což je pro uživatele nevýhodné. Kromě toho · testovací proužek není skladovatelný, protože jód při styku se stopami alkálie disproporcionuje.
Existovala tudíž potřeba vyvinout jednoduše vyrobitelné a použitené stabilní, rychlé diagnostikům ke stanovení kyseliny močové v séru a zejména v krvi.
S překvapením bylo nyní zjištěno, že rychlou diagnózu kyseliny močové v séru nebo v krvi lze provádět pomocí reagenčního prostředku, především reagenčního proužku, na bázi inverzní kolorimetrie.
Podstata reagenčního prostředku, zejména reagenčního proužku, ke stanovení kyseliny močové v tělních tekutinách spočívá v tom, že obsahuje jako indikátor radikál obecného vzorce I
ve kterém znamenají
R metylovou nebo etylovou skupinu a
Me atom sodíku nebo lithia nebo amoniovou skupinu, příslušného azinu, pro nastavení hodnoty pH na 3 až 7, s výhodou na 4 až 6, pufr, například citrátový nebo ftalátový, a dále smáčedlo, například laurylfosfát, dioktylsulfosukcinát, laurylpolyglykoléter, nebo laurylpyridmiumchlorid a zahušťovadlo, například alginát, éter celulózy nebo karboxymetylcelulózu.
Radikály obecného vzorce I jsou tmavě zbarvené sloučeniny, které jsou redukovány kyselinou močovou v bezbarvé aziny. Při předem daném množství radikálů představuje stupeň odbarvení míru koncentrace kyseliny močové. Skutečnost, že radikály podle vynálezu dovolují stanovení kyseliny močové pomocí rychlých diagnostik nebyla předvídatelná. Bylo jenom známo, že kyselina močová reaguje nějakým způsobem s radikálem obecného vzorce í, protože například při stanovení glukózy podle německého patentu č. 1 648 840 a 2 042 828 ruší kyselina močová při oxidaci příslušných azinů v radikál: bylo však rovněž známo, že toto rušení není stechiometrické (D. Eberhardt se spol. Z. klín. Chem. u. kliň. Biochem. 9, 362 až 363, 1971). Bylo tedy nutno předpokládat, že aziny a radikály obecného vzorce I nejsou vhodné pro kvantitativní stanovení kyseliny močové.
Rychlá diagnostika podle vynálezu lze připravovat následujícím způsobem:
Pro rychlý test na kyselinu močovou v séru lze použít jako savého nosiče papíru nebo rouna. Filtrační papír se tedy impregnuje radikálem obecného vzorce I, dále pufrem, jakož i obvyklými pomocnými látkami jako smáčedly, zahušťovadly atd.
Pro rychlý test na kyselinu močovou v celé krvi lze výše zmíněné papíry potom impregnovat v organických rozpouštědlech étery celulózy, popřípadě estery celulózy, např. podle německého patentu č. 1 277 019 nebo vosky podle německého patentu č. 1 598 048. Vytvořená membrána a popřípadě i hydrofobizace zkušebního papírku dovolují potom smytí krve. Vhodnější je však vpravovat radikály obecného vzorce I do vodovzdorných filmů podle německého patentu č. 1 598 153, ze kterých stačí krev jenom setřít.
Radikály obecného vzorce I lze připravovat jako substance, a to oxidací příslušných azinů jódem, octanem olovičitým, kysličníkem olovičitým nebo jinými vhodnými oxidačními činidly (srovnej například Hůnig, Liebigs Ann. Chem. 676, 36 až 51,1964). Lze je však pomocí těchto oixdačních činidel nebo peroxidem vodíku a proxidázou vytvářet přímo v impregnačním roztoku. Množství radikálů, kterých se používá v recepturách, se řídí množstvím kyseliny močové, která má být stanovena, lze je stanovit snadno empiricky.
К udaným recepturám je účelné přidávat ještě příslušné aziny, aby se bezpečně zamezilo případné disproporcionaci radikálů.
Takové disproporcionaci lze zamezit dále přidáním neutrálních anorganických solí alkalických kovů, jako chloridů, bromidů, sulfátů a jiných.
Jako pufry přicházejí v úvahu obvyklé systémy pro rychlé testy, jako například citrátový, ftalátový aj. Protože podle okolností při použití většího množství radikálů (pro vyšší koncentrace kyseliny močové) může docházet к vysolovacím efektům, je občas účelné u výše uvedených pufrů jako kation používat lithium.
Hodnota pH pufru se má pohybovat mezí 3 a 7, s výhodou mezi 4 a 6. Vyšší hodnoty pH jsou neúčelné, neboť způsobují rozpad radikálů.
Jako smáčedla přicházejí v úvahu obvyklá smáčedla neiontogenní, aniontová a kationtová, Jako například laurylsulfát, dioktylsulfosukcinát, laurylpolyglykoléter, laurylpyridiniumchlorid a další.
Jako zahušťovadla lze používat algináty, étery celulózy, karboxymetylcelulózu apod.
Jako disperzí na bázi umělých hmot pro výrobu zkušebních filmů, lze používat těch, které jsou popsány v německém patentu č. 1 598 153, s výhodou polyvinylpropionátu, -acetátu a jejich směsných polymerů.
Zkušební papírky, popřípadě zkušební filmy, se vyrábějí obvyklým způsobem, řežou se na malé čtverečky (například 6 x x 6 mm) a přilepí, přivaří nebo jinak upevní na tyčinkovité nosiče, s výhodou na fólie. Zkušební tyčinky jenom s jednou zkušební plochou jsou vhodné především к mě ření pomocí jednoduchých reflexních fotometrů nebo к vizuálnímu srovnání se srovnávacími barvami. Zvláště výhodné je však nanášet na testovací tyčinku více zkušebních ploch se stoupající koncentrací radikálů. Přitom se získává po nanesení hodnocené kapaliny celá řada úplně a částečně odbarvených a vůbec neodbarvených zkušebních ploch, ve kterých lze rozeznat jednoznačně i bez srovnávacích barev ekvivalenční bod, tj. bod právě vzniklého odbarvení.
V příkladech bude vynález blíže vysvětlen, přičemž bude používáno následujících zkratek:
Radikál A = radikál diamonné soli kyselí-
213110 ny azino-bis-N-otylbenzthiazolon-disulfonové
Radikál B = radikál dvojlithné soli kyseliny azino-bis-N-etyl-benzthiazolon-disulfonové
Složení
Disperze polyvmylíícetátpropionátu
Alginát sodný, 1,85 % v 0,5 ' M pufru fosforečnanu sodného, pH 5,6
Radikál A (33,8 O/o)
Dvojamonná sůl kyseliny azino-N-etylbenzthiazolon-disulfonové ve 22 ml vody Dioktylsulfosukcinát sodný v 8 ml metanolu
Radikál C — radikál dvojlithné soli kyseliny azino-bis-N-metylbenzthiazolon-disulfonové
Příklad 1 g
g
........... x. g y g
0,75 g x 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08 0009 0,1 g y 0,25 0,30 0,35 0,40 0,45 0,50 0,60 g
Složky byly důkladně smíchány a k odstranění vzdušných bublin byly odstředěny po dobu 5 minut při 1500 ot/min. Filmy tlusté 0,38 mm byly potom natřeny na polykarbonátovou fólii a 30 minut sušeny při teplotě 50 QC. Povrstvené materiály byly nařezány na 6 mm široké pásy a · připevněny ve vzdálenosti 1 mm vedle sebe na polyesterovou fólii. Ta byla nařezána na 6 mm široké tyčinky, takže se získaly zkušební pásky, které obsahovaly vedle sebe sedm zkušebních ploch a až g. Na zkušební pásky byla nakapána séra, ’ která obsahovala 2, 4, 6, 8 a 10 mg kyseliny močové/100 ml a po 5 minutách otřena.
Byl získán následující výsledek:
Sérum ing/100 ml žádná zkušební plocha dokonale odbarvená odbarven í zkusební plochy a a b odbarvení zkušební plochy a až d odbarven í zkušebn í pRchy a aí f odbarvení všech zkušebních ploch
Obsah kyseliny močové lze tedy snadno odhadnout následujícím způsobem: mg kyseliny močové/100 ml = počet odbarvených zkušebních ploch + 2.
Příklad 2
Složení
Disperze polyvi^]^^]^l^(^i^itátpropionátu
Alginát sodný, 1,85 % v 0,5 M pufru citranu lithného, pH 6
Radikál B (35,1 %)
Dvoji^ná sůl kyseliny azino-N-etyl-benzthiazolon-disulfonové
Fluorované neionogenní smáčedlo (Forafac 1110)
Destilovaná voda g
g
0,2 g
0,2 g
0,2 g ml
Hmota byla smíchána jako v příkladu 1, odstředěna, natřena a sušena.
Po rozstříkání byly analogicky podle příkladu 1 vyrobeny zkušební pásky, které měly pouze jednu zkušební plochu.
Zkušební plocha byla pokapána krví obsahující kyselinu močovou, po 1 minutě otřena a změřena na komerčním reflexním fotometru (Réflomatu).
Výsledek je shrnut v tabulce 1:
mg % kyseliny močové
Díly stupnice
38.5
23.5
21.5
13.5
Příklad 3
Filtrační papír (Schleicher a Schull 2316 byl impregnován roztokem následujícího složení a sušen při teplotě 50 °C:
Pufr citranu sodného, pH 6, 0,5 molární Radikál C (32,5 °/o)
Dvojlithná sůl kyseliny azino-bis-N-metylbenzthiazolondisulfonové
Laurylpolyoxyetylénéter
Destilovaná voda do
Papír se nařeže na 6 mm široké pásky a nalepí pomocí vhodného lepidla na polystyrénovou fólii. Ta se nařeže na 6 mm široké tyčinky, které mají na spodním konci čtvercovou zkušební plochu.
Zkušební tyčinky se namáčejí do séra obsahujícího kyselinu močovou a po 60 vteřinách hodnotí. Sérum s 8 mg kyseliny močové/100 ml způsobí úplné odbarvení, zaSložení
Disperze polyvinylacetátpropionátu
Alginát sodný, 1,5 % v 0,2 M vodném roztoku bromidu amonného
Radikál A (99,5 %)
Dvojamonná sůl kyseliny azino-bis-N-etyl-benzthiazolon-disulfonové
Fluorované neiontogenní smáčedlo Destilovaná voda nastavená 0,5 M amoniakem na hodnotu pH 5
Z této hmoty byly vytaženy 0,2 mm tlusté filmy, které byly sušeny 30 minut při teplotě 50 °C a analogicky podle příkladu 2 dále zpracovány na zkušební (reagenční) proužky s jednou zkušební plochou.
Na zkušební plochu se nakape sérum s ml
0,175 g
0,2 g
0,1 g
100 ml tímco sérum se 7 mg/100 ml nechává ještě zelené zbarvení. Je-li při 7 mg/100 ml žádoucí úplné odbarvení, musí se navážit 0,155 gramu radikálu; pro 9 mg je zapotřebí 0,195 g. Tímto způsobem lze tudíž nastavit každou žádanou prahovou hodnotu.
Příklad 4 g
g
210 mg
1,05 g
0,2 g
14,0 ml obsahem kyseliny močové, po 5 minutách se otře a potom se měří na běžném komerčním remisním fotometru (Zeiss, PMQ III) při 620 μπι.
Výsledek je shrnut v tabulce 2:
Tabulka 2 % remise mg % kyseliny močové m s
4,1 |
32,8 |
0,36 |
6,0 |
37,2 |
0,7 |
8,1 |
43,5 |
0,49 |
10,4 |
52,2 |
0,64 |
12,4 |
57,5 |
0,35 |
PŘEDMĚT VYNALEZU