HU176756B

HU176756B - Quick-diagnosicum for determining uric acid in body liquides

Info

Publication number: HU176756B
Application number: HU78BO1737A
Authority: HU
Inventors: Wolfgang Werner; Walter Rittersdorf
Original assignee: Boehringer Mannheim Gmbh
Priority date: 1977-09-30
Filing date: 1978-09-29
Publication date: 1981-05-28
Also published as: CA1104042A; LU80288A1; FR2404852B1; ZA785416B; NZ188514A; IL55647A; JPS5463893A; GB2005017A; IL55647A0; IT1099606B; FI782914A; BE870755A; BR7806408A; ATA704778A; IT7828103A0; CS215110B2; DE2744046A1; GR74887B; NL7809690A; IE781954L

Description

A találmány tárgya gyorsdiagnosztikum húgysavnak testfolyadékokban, főként vérben és szérumban való meghatározására.

A húgysav vérben, illetve szérumban való meghatározása nagy jelentőséggel bír a köszvény és más olyan betegségek diagnózisa szempontjából, amelyekben a purinvázas vegyületek anyagcseréje megváltozik. Normálisan az emberi vérben legfeljebb 7 mg húgysav van 100 ml-enként, patologikus állapotban ez az érték a kétszeresére, háromszorosára is emelkedhet.

Nagyszámú kvantitatív mérési eljárás ismeretes, amelyek lényegében két módszeren alapulnak:

a) olyan reakciók, amelyekben húgysavat redukálószerként alkalmaznak; például foszfor-volframsav redukciója, és a létrejövő kék elszíneződés kolorimetriás kiértékelése; és

b) húgysav enzimatikus meghatározása urikázzal, ahol a keletkezett hidrogén-peroxid peroxidáz jelenlétében egy színképzőt színezékké oxidál, amelynek színmélysége a jelenlevő húgysav koncentrációjával arányos.

Ezek az eljárások azonban legtöbbnyire csak viszonylag használhatók, és ezenkívül időrablók, mivel a reakció előtt a szérumban jelenlevő összes proteint el kell távolítani. így a jelenlegi legpontosabb eljárás, a Kageyamaféle [Clin. Chim. Acta 31, 421 (1971)], amely az urikázzal történő enzimatikus meghatározáson alapul, összesen mintegy 75 perc analízisidőt igényel.

Nem hiányoztak eddig olyan kísérletek sem, hogy a húgysav meghatározására gyorsdiagnosztikumokat fej2 lesszenek ki. Gyorsdiagnosztikumokon itt olyan eszközöket értünk, amelyek lehetővé teszik, hogy a kívánt anyagokat gyorsan és egyszerűen, tehát például kiképzetlen személyzettel is meg lehessen határozni. Ezek rendszerint olyan szívóképes hordozók, amelyek a megfelelő reagensekkel át vannak itatva, vagy olyan vízálló filmek, amelyekbe a reagensek be vannak építve. A vizsgálandó folyadékba történő bemártás vagy a vizsgált folyadékkal történő lecseppentés színváltozást hoz létre, amely például egy összehasonlító színskálával kiértékelhető.

így a 3,536.448 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban egy olyan gyorsdiagnosztikumot írnak le, amely két papírból ált, amelyeket összeragasztottak, és védőréteggel vontak be. Az egyik papír etilén-diamin-tetraecetsavat, nátrium-volframátot és hidrazin-szulfátot tartalmaz, a másik foszfor-volframátot. Ez a gyorsdiagnosztikum azonban csak húgysav kvalitatív meghatározását teszi lehetővé, és nem ad semmilyen felvilágosítást esetleges patologikus állapotról.

Az 1.282.089. sz. nagy-britanniai szabadalmi leírásban olyan papírokat írnak le, amelyek vas(III)-sókat, perszulfátot· és 2,4,6-trisz(2-piridil)-l,3,5-triazint vagy 2.2¹: 6^I,2^ll-terpiridilt tartalmaznak. A vas(lll)-sók a triazinnal vagy a terpiridillel komplexeket képeznek, amelyeket azután a húgysav vas(II)-komplexekké redukál, mire színváltozás jön létre, amely egyenesen arányos a húgysavkoncentrációval. Ezek a papírok azonban rendkívül fényérzékenyek, és így a gyakorlatban kevéssé alkalmazhatók.

A 9096—789 sz. japán nyilvánosságra hozatali irat szerint egy urikázt és segédanyagokat tartalmazó papírt húgysavat tartalmazó szérumba merítenek. Miután az urikáz a húgysavat hidrogén-peroxiddá és allantoinná oxidálja, ezt a papírt egy másik papírra nyomjuk, amely peroxidázt és o-toluidint tartalmaz. Ekkor a hidrogén-peroxid az o-toluidinnel egy színezékké reagál. Kézenfekvő, hogy ez az eljárás körülményes, és az egyik papírról a másikra történő szükséges diffúzió miatt nem lehet nagyon pontos.

Míg az előbbiekben ismertetett gyorsdiagnosztikumok a direkt kolorimetriás meghatározás elvét alkalmazzák, amelynél a létrejött elszíneződés a mérendő húgysav koncentrációjával arányos, a 2,550.634. sz. német szövetségi köztársaságbeli nyilvánosságra hozatali iratban az „inverz kolorimetria” vizsgálati elvét írják le. Itt egy előzetesen meghatározott mennyiségű elszineződött indikátort visznek fel egy szilárd, iners hordozóra. A meghatározandó anyag elszínteleníti az indikátort, úgy hogy a színgyengülés arányos a meghatározandó anyag mennyiségével. A meghatározandó anyag kritikus határkoncentrációjának túllépése ezen módszer szerint megfelelő indikátormennyiség teljes elszíntelenedésével nagyon pontosan meghatározható.

A 2,550.634 sz. német szövetségi köztársaságbeli nyilvánosságra hozatali iratban többek között szintén leírnak egy gyorsdiagnosztikumot húgysav meghatározására vérben. Itt üvegszálpapírt impregnálnak jóddal, kálium-jodiddal és keményítővel, és utóimpregnálás után egy kollódiumbóí álló membránnal és egy kollódiumból és szilárd nátrium-karbonátból álló második membránnal vonják be. Húgysavtartalmú vér elszínteleníti a jód-keményítő komplexet, a vér lemosása után az elhalványodás fokozata kiértékelhető. A jód-keményítő komplex koncentrációja beállítható ügy, hogy pontosan az éppen patologikus húgysavmennyiségnek feleljen meg, és így igen-nem választ tegyen lehetővé. Más jódkoncentrációval készülő további vizsgálópapírokkal fokozatos meghatározások végezhetők. Ennek az önmagában hasznos gyorsdiagnosztikumnak mégis lényeges hátrányai vannak: A háromszoros impregnálás nagyon költséges. Ha a második membránt elhagyjuk, úgy a vizsgálandó folyadékot előzetesen meg kell lúgosítani, ami a felhasználónak körülményes. Továbbá a tesztcsík nem tárolható, mert a jód alkálinyomokkal való érintkezéstől diszproporcionálódik.

Fennállt tehát az igény egy egyszerűen előállítható és alkalmazható stabil gyorsdiagnosztikumra húgysavnak szérumban és különösen vérben történő meghatározására.

Meglepően azt találtuk, hogy ilyen gyorsdiagnosztikumot kapunk, ha az „inverz kolorimetria” elvét alkalmazzuk, és indikátorként az I általános képletű heterociklusos azin gyököket — ahol

R jelentése rövidszénláncú alkilcsoport és Me jelentése alkálifém atom vagy ammónium-csoport — használjuk.

Rövidszénláncú alkilcsoporton 1—6, előnyösen 1—4 szénatomos alkilcsoportok értendők, különösen a metilés etil-csoport.

Sókként különösen azammónium-, lítium- és nátrium-sók jönnek számításba.

Az I általános képletű gyökök élénkszínű vegyületek, amelyek húgysavtól a színtelen azinokká redukálódnak. Adott gyökmennyiség esetén az elszíneződés foka a húgysavkoncentrációval arányos. Előre nem volt látható, hogy a találmány szerinti gyökök lehetővé teszik húgysav meghatározását gyorsdiagnosztikumokkal. Az volt csak ismeretes, hogy a húgysav valahogyan reagál az I általános képletű gyökkel, mert húgysav zavarja az azinok oxidációját a megfelelő gyökké, például glükóznak az l,648.840sz. és a 2,042.828sz.német szövetségi köztársaságbeli szabadalmi leírás szerinti meghatározásánál ; az is ismeretes volt azonban, hogy ez a „zavarás” nem sztöchiometrikus [D. Eberhardt et al., Z. kiin. Chem, u. kiin. Biochem. 9, 362—363 (1971)]. Ezért azt kellett feltételezni, hogy az azinok és az I általános képletű gyökök nem megfelelők a húgysav meghatározására.

A találmány szerinti gyorsdiagnosztikumok a következőképpen készíthetők:

Húgysav szérumban való meghatározására szolgáló gyorsteszthez szívóképes hordozóként papír vagy gyapjú használható. Szűrőpapírt impregnálunk tehát egy I általános képletű gyökkel, továbbá pufferral, valamint szokásos segédanyagokkal, így nedvesítőszerekkel, sűrítőkkei stb.

Húgysav teljes vérben való meghatározására szolgáló gyorsteszt készítésénél a fenti papírt végül az 1,272.019 sz. német szövetségi köztársaságbeli szabadalmi leírás szerint cellulóz-éterekkel, illetve -észterekkel vagy az 1,598.048. sz. német szövetségi köztársaságbeli szabadalmi leírás szerint szerves oldószerekben oldott viaszokkal utánimpregnáljuk. A képződő membrán, illetve a tesztpapír hidrofobizálása teszi lehetővé ezután a vér lemosását. Előnyösebb azonban az I általános képletű gyököket az 1,598.153. sz. német szövetségi köztársaságbeli szabadalmi leírás szerint vízálló filmekbe beágyazni, amelyekről a vért egyszerűen csak le kell öblíteni.

Az I általános képletű gyökök kipreparálható anyagként maguk is előállíthatók, mégpedig a megfelelő azinok jóddal, ólom-tetraacetáttal, ólom(IV)-oxiddal vagy más megfelelő oxidálószerekkel végzett oxidációjával [lásd például Hunig, Liebigs Ann. Chem. 676, 36—51 (1964)]. Előállíthatók azonban ezekkel az oxidálószerekkel vagy hidrogén-peroxiddal és peroxidázzal közvetlenül az impregnálóoldatban is. A receptúrákban alkalmazandó gyökmennyiségek a meghatározni kívánt húgysavmennyiséghez igazodnak, és tapasztalati úton könnyen megállapíthatók.

Célszerű azonban a receptúrákban még a megfelelő azinokat is hozzáadni, mert így meggátolható a gyökök esetleges diszproporcionálódása.

Ilyen diszproporcionálódás még semleges szervetlen alkálisók, így kloridok, bromidok, szulfátok stb. hozzáadásával is meggátolható.

Pufféiként a gyorsteszteknél szokásos rendszerek, így például citrát, italát stb. jöhetnek számításba. Mivel nagyobb mennyiségű gyök bevitelekor (nagyobb húgysavkoncentrációhoz) kisózási jelenségek léphetnek fel, célszerű ilyenkor kationként a fenti pufferekben lítiumot használni.

A puffer pH-jának 3 és 7, előnyösen 4 és 6 között kell lennie. Magasabb pH-értékek célszerűtlenek, mivel a gyökök bomlását okozhatják.

Nedvesítőszerekként szokásos nem ionogén, anionos és kationos szerek jönnek számításba, így például lauril-szulfát, dioktil-szulfoszukcinát, lauril-poliglikol-éter, lauril-piridinium-klorid és még mások.

Sűrítőszerekként alginátok, cellulózéterek, karboxi-metil-cellulóz és effélék alkalmazhatók.

A tesztfilmek készítéséhez műanyagdiszperziókként például az 1,598. 153. sz. német szövetségi köztársaságbeli szabadalmi leírásban leírtak alkalmazhatók, előnyös a polivinil-propíonát, -acetát és ezek vegyes polimerizátumai.

A tesztpapírokat, illetve tesztfilmeket a szokásos módon készítjük, kis (például 6x6 mm-es) négyzetekre vágjuk, és csíkalakú hordozókra, előnyösen fóliákra felragasztva, felhegesztve vagy más módon rögzítjük. A csak egy tesztfelülettel rendelkező tesztcsíkok előnyösen egyszerű reflexiós fotométerekben való mérésre vagy összehasonlító színekkel való vizuális összehasonlításra alkalmasak. Különösen előnyös azonban egy tesztcsíkra több, növekvő gyökkoncentrációjú tesztfelületet felvinni. Ilyenkor a vizsgálandó folyadék felvitele után egy sor egészen, részben és egyáltalán nem elszíntelenedett tesztfelületet kapunk, amelyekben az ekvivalenciapont, azaz az éppenhogy végbement elszíntelenedés pontja összehasonlító színskála nélkül is egyértelműen megállapítható.

A következő példákban a találmányt részletesebben megmagyarázzuk. A leírás során az alábbi rövidítéseket használjuk:

A gyök == az azino-bisz-N-etil-benztiazolon-diszulfonsav-diammóniumsó gyöke;

B gyök=az azino-bisz-N-etil-benztiazolon-diszulfonsav-dilítiumsó gyöke;

C gyök=az azino-bisz-N-metil-benztiazolon-diszulfonsav-dilítiumsó gyöke.

1. példa

Összetétel:

Polivinil-acetát-propionát diszperzió 45 g

Nátrium-alginát, 1,85%-os oldat 0,5 mólos,

5,6 pH-jú nátrium-foszfát pufferben	35 g
A gyök (33,8/ó-os) ι	x g
Azino-bisz-N-etil-benztiazolon-122 ml
-diszulfonsav-diammóniumsóJ vízben	y g
Dioktil-nátrium-szulfoszukcinát 8 ml
metanolban	0,75 g
Receptúra a b c d e	f g

x 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08 0,09 0,1 g y 0,25 0,30 0,35 0,40 0,45 0,50 0,60 g

Az alkotórészeket alaposan összekeverjük, és a légbuborékok eltávolítása céljából 5 percig 1500 ford/percnél centrifugáljuk. Utána polikarbonát fóliára 0,38 mm vastag filmet kenünk fel, és 30 percig szárítjuk 50 °C-on. A megkent anyagot 6 mm széles csíkokra vágjuk, és egymástól 1 mm távolságra egymás mellé rakva felhegesztjük egy poliészterfóliára. Ezt 6 mm széles csíkokra vágjuk, így olyan tesztcsíkokat kapunk, amelyek a hét tesztfelületet a-tól g-ig egymás mellett tartalmazzák.

A tesztcsíkokat szérumokkal becseppentjük, amelyek 100 ml-enként 2, 4, 6, 8 és 10 mg húgysavat tartalmaznak, és 5 perc elteltével letöröljük. A következő eredményt kapjuk: Szérum mg/100 ml egy tesztfelület sem színtelenedhet el teljesen, 4 az a és b (2) tesztfelület elszíntelenedett, 6 az a—d (4) tesztfelület elszíntelenedett.

az a—f (6) tesztfelület elszíntelenedett, az összes (7) tesztfelület elszíntelenedett.

A szérum húgysavtartalma tehát a fentiek alapján a következő módon könnyen értékelhető:

mg húgysav/100 ml=az elszíntelenedett tesztfelületek száma +2.

2. példa

Összetétel:

Polivinil-acetát-propionát diszperzió45 g

Nátrium-alginát, 1,85%-os oldat 0,5 mólos, pH-jú lítium-citrát pufferben35 g

B gyök (35,1%-os)0,2 g

Azino-bisz-N-etil-benztiazolon-diszulfonsav-dilítiumsó0,2 g

Fluorozott nem-ionogén nedvesítőszer (Forafac 1110)0,2 g

Desztillált víz 20 ml.

Az anyagot az 1. táblázatban leírtakhoz hasonlóan összekeverjük, centrifugáljuk, kikenjük és megszárítjuk.

A felvágás után az 1. példához hasonlóan olyan tesztcsíkokat készítünk, amelyek csak egy tesztfelülettel rendelkeznek.

A tesztfelületet húgysavtartalmú vérrel lecseppentjük.

perc elteltével leöblítjük, és valamilyen kereskedelmi forgalomban levő reflexiósfotométeren (Reflomat®) mérjük.

35	Az eredményt az 1. táblázatban összesítjük
	mg% húgysav	skálarész
	0	45
	2	42
40	3	38,5
	4	35
	5	32
	6	28
	7	23,5
45	8	21,5
	9	19
	10	16
	11	13,5
	12	9
50

3. példa

Szűrőpapírt (Schleicher és Schüll 2316) a következő összetételű oldattal impregnálunk, és 50 °C-on megszárítjuk:

pH-jú, 0,5 mólos lítium-citrát puffer 50 ml C gyök (32,5%-os) 0,175g

Azino-bisz-N-metil-benztiazolon-diszulfonsav-dilítiumsó0,2 g

Lauril-polioxi-etilén-éter0,1 g

Desztillált víz feltölteni 100 ml-re.

A papírt 6 mm széles csíkokra vágjuk, és transzferragasztó segítségével egy polisztirol fóliára ragasztjuk.

Ezt 6 mm széles darabokra vágjuk, amelyek alsó végükön egy négyzetalakú tesztfelületet tartalmaznak.

A tesztcsíkokat húgysavtartalmú szérumba mártjuk, és 60 másodperc múlva értékeljük ki. A 100 ml-enként 8 mg húgysavat tartalmazó szérum teljes elszíntelenedést 5 eredményez, míg 7 mg/100 ml esetén még zöld elszíneződés észlelhető. Ha 7 mg/100 ml koncentrációnál akarjuk a teljes elszíntelenedést, úgy 0,155 g gyököt kell bemérni ; 9 mg esetén 0,195 g szükséges. Ilyen módon tehát minden kívánt határérték beállítható. 10

Az eredményt a 2. táblázatban összegezzük:

mg/ζ húgysav °/_o remisszió

39,9

42.1

44.1

46.2

48,4

50,8

52,6

4. példa összetétel:

Polivinil-acetát-propionát diszperzió45 g

Nátrium-alginát, 1,5%-os oldat 0,5 mólos vizes ammónium-bromid oldatban35 g

A gyök (99,5%-os) 50mg

Azino-bisz-N-etil-benztíazoIon-diszulfonsav-diammóniumsó0,3 g

Fluorozott nem-ionogén nedvesítőszer0,2 g

Desztillált víz 14,0ml

0,5 mólos ammónium-hidroxid oldattal pH 5-rc állítani.

Az anyagból 0,3 mm vastag filmeket kenünk, amelyeket 30 percig 50 °C-on szárítunk, és a 2. példához hasonlóan olyan tesztcsíkokká dolgozzuk fel, amelyek egy tesztfelületet tartalmaznak. A tesztfelületet húgysavtartalmú szérummal lecseppentjük, egy perc múlva letöröljük, és további egy perc elteltével valamilyen kereskedelmi forgalomban levő rcmissziósfotométeren (Zeiss, PMQ ΠΙ) 620 nm-nél mérjük.

Szabadalmi igénypontok

Claims

Szabadalmi igénypontok

1. Gyorsdiagnosztikum húgysav inverz kolorimetria elve szerinti meghatározására testfolyadékokban, amely: gyorsdiagnosztikum indikátort, adott esetben az I általános képletű gyöknek megfelelő azint és szokásos segédanyagokat — így pufiért, nedvesítőszert és sűrítőszert — tartalmazó hordozóból áll, azzal jellemezve, hogy indikátorként egy I általános képletű gyököt tartalmaz, ahol a képletben

R jelentése rövidszénláncú alkilcsoport és

Me jelentése alkálifématom vagy ammóniumcsoport.
2. Az 1. igénypont szerinti gyorsdiagnosztikum kiviteli alakja, azzal jellemezve, hogy a reagensekkel impregnált hordozó szívóképes hordozó.
3. Az 1. igénypont szerinti gyorsdiagnosztikum kiviteli alakja, azzal jellemezve, hogy a reagensek egy műanyagfilmbe vannak ágyazva.
4. Az 1—3. igénypont bármelyike szerinti gyorsdiagnosztikum kiviteli alakja, azzal jellemezve, hogy egy második hordozón több, különböző indikátormennyiséget tartalmazó tesztfelület van egymás mellett rögzítve.

1 lap képletekkel

A kiadásirt ftlol: * Közgazdasági és Jogi Könyvkiadó igszgMója'

81.1421.66-42 Alföldi Nyomda, Debrecen — Felelős vezető: Benkö István igazgató