DK159171B - Materiale til detektering af naervaerelsen af et peroxidativt aktivt stof i en testproeve, testmiddel indeholdende materialet samt fremgangsmaade til fremstilling af testmidlet. - Google Patents

Description

i

DK 159171 B

o

Den foreliggende opfindelse angår et materiale til detektering af nærværelsen af et peroxidativt aktivt stof i en testprøve, hvilket materiale indeholder et organisk hydroperoxid og en indikator, der er i stand til at tilve-5 jebringe et detekterbart respons i nærværelse af det peroxidativt aktive stof og peroxid. Opfindelsen angår desuden et testmiddel indeholdende det nævnte materiale samt en fremgangsmåde til fremstilling af testmidlet.

Der er i øjeblikket mange analytiske metoder tilgæn-10 gelige til detektering af nærværelsen af peroxidativt aktive stoffer i biologiske prøver, f.eks. urin, fækale suspensioner og gastrointestinale bestanddele. Eksempelvis er hæmoglobin og derivater deraf, dvs. de analyter, der bestemmes ved konventionelle tests for okkult blod, typiske for per-15 oxidativt aktive stoffer, eftersom de opfører sig på en måde, der minder om enzymet peroxidase. Som sådanne betegnes stofferne også pseudo-peroxidaser. Peroxidativt aktive stoffer er enzym-lignende på grund af deres katalyse af redox-reak-tionen mellem peroxider eller hydroperoxider og sådanne in-20 dikatorforbindelser som benzidin, o-tolidin, 3,3',5,5'-te- tramethylbenzidin, 2,7-diaminofluoren og lignende forbindelser, idet de tilvejebringer et detekterbart respons, f.eks. en farveændring. De bedste metoder til bestemmelse af nærværelsen af okkult blod i testprøver beror således på denne 25 pseudoperoxidaseaktivitet.

Der er blevet udviklet et antal analytiske metoder til bestemmelse af peroxidativt aktive stoffer, og disse metoder beror på den enzymlignende katalyse af den peroxidati-ve oxidation af farvedannende indikatorer. Primært omfatter 30 disse metoder vådkemiske eller opløsnings-procedurer samt reagensbærende strimler af den såkaldte "dyp-og-aflæs"-type.

Et typisk eksempel på de førstnævnte er angivet i R.M. Henry et al.,Clinical Chemistry Principles and Techniques, 2. udg., 1124-1125 (Hagerstown, Maryland: Harper and Row, 1974).

35 Denne som eksempel valgte procedure omfatter anvendelsen af iseddikesyre (puffer), diphenylamin (indikator) og hydrogen-peroxid. Medens sådanne vådkemiske metoder har vist sig at

DK 159171B

2 o være analytisk anvendelige, har de dog mange ulemper, og to eksempler på sådanne ulemper er ringe reagensstabilitet og utilstrækkelig sensitivitet.

Ved en anden metode til bestemmelse af peroxidativt 5 aktive stoffer, en metode, der i øjeblikket foretrækkes af de fleste kliniske analytikere, anvendes det såkaldte "dyp--og-aflæs"-reagensstrimmelmateriale. Et typisk sådant "dyp--og-aflæs"-materiale er et materiale, der er kommercielt tilgængeligt fra Ames Division of Miles Laboratories, Inc.

10 under varemærket "Hemastix® ". Dette materiale omfatter en porøs papirmatrix, der er imprægneret med en pufret blanding af et organisk hydroperoxid og en indikator, fastgjort til en plaststrimmel eller et håndtag. Ved neddypning af matrixen i en væske indeholdende hæmoglobin, myoglobin, erythro-15 cyter eller andre peroxidativt aktive stoffer, dvs. pseudo-peroxidaser, udvikles der en blå farve i matrixen, og denne farves intensitet er proportional med koncentrationen af stoffet i prøven. Ved sammenligning af den i matrixen udviklede farve med et standard-farvekort kan analytikeren på semi-20 kvantitativ basis bestemme mængden af analyt, der er til stede i prøven.

Fordelene ved sådanne reagensstrimler i forhold til vådkemiske metoder er primært følgende: 1) strimmelformatet er lettere at anvende, idet det hverken kræver fremstilling 25 af reagenser eller hjælpeapparatur, og 2) der opnås større stabilitet af reagenser i strimlen, hvilket resulterer i forbedret nøjagtighed, sensitivitet og økonomi.

Hvadenten en bestemt analyse for et peroxidativt aktivt stof udføres ved den ene eller den anden af de ovenfor 30 beskrevne metoder, eksisterer der et problem, der er fælles for begge: interferens forårsaget ved nærværelsen i prøven af reducerende midler i almindelighed og ascorbinsyre eller ascorbation i særdeleshed (herefter betegnet som ascorbat--interferens). Eksempelvis i tilfælde af urinanalyse har den 35 nylige popularitet af kost, der omfatter høje doser af vita-

O

DK 159171 B

3 min C (ascorbinsyre), resulteret i alvorlige ascorbat-inter-ferensproblemer ved analyse for visse urinbestanddele, f.eks. okkult blod. Patienter, der indtager en sådan kost, udviser typisk forøgede niveauer af urin-ascorbat.

5 Så tidligt som i 1938 har man erkendt de uønskede virkninger af reducerende midler såsom ascorbat, jfr.

R. Kohn og R.M. Watrous, Journal of Biological Chemistry, 124, 163-168 (1938). Det samme problem optræder stadig i dette område af den diagnostiske analyse, hvilket fremgår 10 af et forslag fra 1979 gående ud på, at når der udføres en analyse for okkult blod (en pseudoperoxidase), bør der også udføres en samtidig ascorbat-analyse til måling af nøjagtigheden af bestemmelsen af det okkulte blod, jfr. L. Nielsen, P.J. Jørgensen og A.C. Hansen, Ugeskrift for Læger, 15 141, 791-793 (1979).

Mange forsøg på fjernelse af ascorbat-interferens i forbindelse med testsystemer, f.eks. systemer indeholdende glucose-sensitive reagenser, er rapporteret i litteraturen.

Med hensyn til glucose-sensitive bestemmelser har forsøge-20 ne strakt sig fra udfiltrering af ascorbat, inden dette når frem til reagenserne, til anvendelsen af et enzym til sønderdeling deraf in situ.

I det canadiske patentskrift nr. 844.564 er der således beskrevet et materiale til glucosebestemmelse i urin 25 eller andre medier, og dette materiale omfatter ud over en porøs del, der er imprægneret med normale glucose-responsive reagenser, en yderligere del til modtagelse af urin-test-prøven. Den prøvemodtagende del omfatter et ionbyttermateriale, hvis eneste funktion i midlet er at adsorbere ascorbat, der 30 måtte være til stede i urinprøven.

Ifølge USA-patentskrift nr. 4.168.205 er det blevet foreslået at inkorporere enzymet ascorbat-oxidase i test-reagenspræparatet. Ethvert ascorbat, der er til stede i prøven, vil blive enzymatisk oxideret af ascorbat-oxidasen til 35 dannelse af dehydroascorbat, der er en forbindelse, som ikke

O

DK 159171B

4 uønsket påvirker den ønskede analyse.

Et andet forsøg på ophævelse af ascorbat-interferens fremgår af den japanske patentpublikation nr. 55757/1983.

_ Denne publikation beskriver anvendelsen af metalchelater af

O

forskellige ligander såsom ethylendiamintetraeddikesyre og diethylentriaminpentaeddikesyre til forbehandling af en prøve, som dernæst anvendes til bestemmelse af cholesterol, glucose eller andre bestanddele såsom urinsyre.

10 I USA-patentskrift nr. 3.411.887 beskrives elimine ringen af ascorbat-interferens med reagenssysterner, der er baseret på enzymatiske oxiderende stoffer, f.eks. glucose-oxidase, ved anvendelse af et ascorbat-opfangningssystem.

Dette opfangningssystem omfatter en ioniserbar tungmetalfor-15 bindelse, der, når den er ioniseret, har et oxidations-re-duktions-potentiale, der ligger mellem et redox-indikator--farvestof og ascorbat. Nogle egnede metaller, der er anført som eksempler, omfatter cobalt, jern, kviksølv og nikkel .

20 I USA-patentskrift nr. 4.288.541 beskrives anvendel sen af mércuriion-komplekser, f.eks. mercuri-sarcosinat, til at meddele ascorbat-resistens til et glucose-glucoseoxi-dase-bestemmelsessystem.

Ud over det i det foregående angivne manifesterer in-25 teressen for ascorbat-problemet i forbindelse med glucose--tests sig i følgende 1itteratursteder: 1. H. Gifford et al., J. Amer. Med. Assoc., 178, 149-150 (1961).

2. P. O'Gorman et al., Brit. Med. J., 603-606 (1960).

30 3. R. Brandt et al., Clin. Chem. Acta, 51, 103-104 (1974) .

4.. R. Brandt et al., Am. J. Clin. Pathol., 68, 592--594 (1977).

På lignende måde som det forslag, der er angivet i 35 det ovennævnte USA-patentskrift nr. 3.411.887, er der i an- 5

DK 159171B

O

den litteratur tale om kompleksdannelse og oxidation af as-corbat under anvendelse af cobalt. Det rapporteres eksempelvis af G. Bragagnolo, Ann. Chim. Applicata, 31, 350-368, 1941, at opløsninger af ascorbinsyre oxideres med luft i nær-5 værelse af cobaltmetal. En lignende aktivitet er også blevet rapporteret med hensyn til CoiNH^gCl^ af Tomokichi Iwasaki i Journal of the Chemical Society of Japan, £3, 820-826 (1942) .

Skønt den i det foregående angivne teknik i udstrakt -10 grad vedrører analytiske systemer til glucosebestemmelser, er der ikke fremsat nogen forslag med hensyn til løsningen af ascorbat-interferensproblemet i forbindelse med bestemmelsen af sådanne peroxidativt aktive stoffer som peroxidase og pseudoperoxidaser, f.eks. okkult blod (hæmoglobin). Uanset 15 angivelserne i det ovennævnte USA-patentskrift nr. 3.411.887 viser den førnævnte teknik, at metalioner, f.eks. Co(III), i virkeligheden også er pseudoperoxidaser. Eksempelvis anvendes Co(III)-acetat kommercielt til katalytisk sønderdeling af cumen-hydroperoxid? jfr. The Merck Index, 9. udg., 311 20 (1976). En række Co(III)-komplekser er blevet rapporteret katalytisk at sønderdele peroxider, jfr. K. Lohs, Monatsber.

Deut. Akad. Wiss. Berlin, 8, 657-659 (1966), se også Chemical Abstracts, £7, 120383z, 1967. En fagmand ville derfor klart ledes til at mene, at anvendelsen af alle sådanne metalkom-25 plekser i et typisk analytisk præparat til bestemmelse af peroxidativt aktive stoffer, dvs. et præparat indeholdende et organisk hydroperoxid og en indikator, ville forårsage skadelig interaktion med hydroperoxidet, enten ved tilvejebringelse af "falske positive" resultater, eller på anden 30 måde ved at gøre det ikke-reaktivt over for det peroxidativt aktive stof, der er af interesse, f.eks. okkult blod, og dermed uanvendeligt til sådanne bestemmelser. Forsøg på at anvende mercuri-komplekser, f.eks. mercurisarcosinat, ved tests for okkult blod, er således slået fejl.

35 USA-patentskrift nr. 4.310.626 beskæftiger sig med

O

6

DK 159171 B

det foregående problem ved beskrivelse af anvendelsen af ammonium-Co(III)-komplekser til ophævelse af ascorbat-in-terferens med materialer til bestemmelse af peroxidativt aktive stoffer. Det nævnte patentskrift beskriver sådanne 5 materialer, der indeholder et organisk hydroperoxid og en egnet indikator, f.eks. 3,3',5,5'-tetramethylbenzidin, sammen med ammonium-Co(III)-komplekser såsom bl.a. CoiNH^igCl^. Disse komplekser giver imidlertid ikke tilstrækkelig ascor-bat-resistens til, at en test for okkult blod kan blive 10 kommercielt fordelagtig.

Andre forsøg på fjernelse af ascorbat-interferens ved analytiske bestemmelser af peroxidativt aktive stoffer omfatter eksempelvis det, der er angivet i det tyske patentskrift nr. 2.907.628. Dette tyske patentskrift omfatter 15 urinanalyse i opløsningf idet en urinprøve forbehandles med en eller flere oxidanter til fjernelse af ascorbat, hvorpå der tilvejebringes kontakt med de anvendte analytiske reagenser. De beskrevne oxidanter er natriumiodat, natriumper-iodat, calciumhydrochlorit, kaliumtriiodid, natriumhydrochlo-20 rit, chloramin og bromsuccinimid.

Sammenfattende kan det anføres, at forskellige forsøg på at ophæve eller formindske interferensproblemet, der frembydes af ascorbinsyre ved bestemmelse af peroxidativt aktive stoffer, har omfattet sådan teknik som anvendelsen af for-25 skellige Co(III)-ammonium-komplekser, forbehandling af prøven med oxidationsmidler og direkte tilsætning til reagens-sammensætningen af alkalimetaliodater.

Pseudoperoxidaser såsom hæmoglobin studeres ofte som alternative peroxidasesystemer med henblik på at opnå viden 30 om virkningsmekanismen for naturlige peroxidaser, såsom de, der fås fra kilder som peberrod eller kartoffel. Ascorbinsyre har længe været kendt som et klassisk substrat for peroxidase, og ascorbinsyre-oxidation i nærværelse af metalchelater, der virker som pseudoperoxidaser, er et kendt fænomen. I 1967 35 og 1968 har M. Khan og A. Martell rapporteret vedrørende kine-

O

7 DK 159171 B

tiske studier af ascorbinsyre-oxidation i nærværelse af en række ferri- og cupri-chelater over et pH-område fra 1,8 til 3,45, jfr. M. Khan og A. Martell, J. Am. Chem. Soc., 89. 4176 (1967), J. Am. Chem. Soc., 89, 7104 (1967) og J.

5 Am. Chem. Soc., JK), 3386 (1968). En række forskellige kinetiske og thermodynamiske parametre blev undersøgt ved disse studier. Resultatet var en rækkefølge for effektivitet af forskellige chelater i overensstemmelse med deres evner til oxidation af ascorbinsyre. Ud af fire aminopolycarboxyl-10 syrer, der er blevet studeret af de nævnte forfattere, har N-(2-hydroxyethyD-ethylendiamintrieddikesyre (HEDTA)-chela-tet af Fe^+ vist sig at være det hurtigste oxidationsmiddel. Såvel Martell's arbejde som et tidligere studium af Grinstead betragter denne ascorbinsyre-oxidations-aktivi-15 tet som udgørende et "model"-peroxidasesystem, jfr. R.R.

Grinstead, J. Am. Chem. Soc., 82, 3464 (1960). Sådanne studier som det førnævnte studium af Grinstead udgør et forsøg på at studere peroxidase-mekanismen ved hjælp af et bestemt ferri-chelat, hvis struktur kan minde om strukturen for den 20 jernholdige hæm, der findes ved det aktive sted i enzymet peroxidase. Forfatterne anvender faktisk betegnelsen "model--peroxidasesystem" gentagne gange i deres værker. På grund af den "model"-peroxidaseaktivitet, der udvises af dette chelat og andre, der minder herom med hensyn til reaktivi-25 tet, ville man imidlertid bestemt ikke forvente, at sådanne stoffer kunne inkorporeres i organiske hydroperoxid-indika-tor-systemer, såsom de, der nu typisk anvendes i analytiske reagensmaterialer og -midler til bestemmelse af peroxidase eller andre peroxidativt aktive stoffer. Endvidere har under-30 søgelser, der er udført af Miles Inc. i forbindelse med peroxidase-aktivitet, afsløret, at med indikatorer såsom 3,3',5,5'-tetramethylbenzidin (TMB) eller o-tolidin (indikatorer, der typisk anvendes i analytiske systemer til bestemmelse af nærværelsen af peroxidativt aktive stoffer), kunne 35 sådan aktivitet forventes at forekomme omkring 200 gange hur-

O

DK 159171 B

8 tigere end med ascorbinsyre, jfr. White-Stevens, R.H., Clin. Chem., 28, 578 (1982). Det kan således antages, at såfremt sådanne peroxiclativt aktive metalchelater, "model "-peroxi-daser, virker til i den grad let at oxidere ascorbinsyre, 5 en antagelse gjort af Khan, Martell og Grinstead, vil per-oxidase-reaktionen med sådanne indikatorer som TMB forløbe i det mindste med samme hastighed som ved ascorbinsyre, og ikke omkring 200 gange hurtigere, som foreslået i forbindelse med disse senere studier, der blev udført med peberrods-10 -peroxidase. Det er klart, at såfremt en yderst reaktiv ana-lyt inkorporeres i selve det reagenspræparat, der skal ændre farve i nærværelse af denne analyt, må det forventes, at der vil opnås "falske positive" resultater.

Til trods for de i det foregående beskrevne kendte 15 forslag har det nu vist sig, at visse peroxidativt aktive metalchelater, især visse metalchelater af polycarboxyalkyl-aminer, når disse anvendes på den her beskrevne måde, ikke blot undlader at frembringe forventede "falske positive” resultater i et præparat indeholdende et system af reagenser 20 til bestemmelse af peroxidativt aktive stoffer, men faktisk er uventet fordelagtige i sådanne systemer med hensyn til pålidelighed, stabilitet og sensitivitet af systemet over for en analyt, der skal bestemmes. Det har endvidere vist sig, at anvendelsen af de her omhandlede metalchelater er 25 særlig fordelagtig til overvindelse af de unøjagtigheder, der kan forårsages ved interferens fra ascorbation, der er til stede i en testprøve.

Den foreliggende opfindelse er således baseret på denne erkendelse, og som angivet ovenfor angår opfindelsen et 30 materiale til analytisk bestemmelse af peroxidativt aktive stoffer, der er resistente mod ascorbatinterferens, især bestemmelser, hvor der anvendes et materiale, der omfatter et organisk hydroperoxid og en redox-indikator, f.eks. o-to-lidin eller 3,3',5,5•-tetramethylbenzidin, samt et peroxi-35 dativt aktivt metalchelat. Ved sådanne bestemmelser kataly- 9

DK 159171B

O

serer eller på anden måde deltager den peroxidativt aktive analyt i en reaktion mellem indikatoren og det organiske hydroperoxid, fordi analytten imiterer enzymet peroxidase. Reaktionen giver en farve eller et andet detekterbart re-5 spons, hvis intensitet indikerer koncentrationen af analytten. Når ascorbation er til stede, forårsager dette et alvorligt interferensproblem. Nærværelsen af et peroxidativt aktivt metalchelat i materialet måtte altså forventes at interferere med den analytiske bestemmelse af en peroxida-10 tivt aktiv analyt. Ikke desto mindre har det vist sig, at hidtil ukendte materialer, testmidler og testorganer, der er resistente mod de interfererende virkninger af ascorbin-syre i en prøve, kan fremstilles med held til detektering af nærværelsen af et peroxidativt aktivt stof i prøven, og 15 disse materialer, testmidler og testorganer omfatter metal-chelater af polycarboxyalkylamin-derivater, der også kendes som "model-peroxidaser”.

Materialet ifølge opfindelsen, der er af den allerede angivne art, er således ejendommeligt ved, at det yder-20 ligere omfatter et metalchelat af et polycarboxyalkylamin--derivat med den almene formel ^ r Rx ' Γ Ry 1 R1 ) > r2--li-rP---li-Rq--N-R3 /m 25 \ ')

-1 nL Jm / J

hvilken 2 2-3 carbonatomer, R2, R2, Rx og R^, der er ens eller forskellige, er ligekædede eller forgrenede alkylalkohol- eller alkylcarboxylsyre-grupper med fra 2-3 carbonatomer, idet mindst to af substituenterne R1, R^, R2, RX eller Ry er alkylcarb-35 oxylsyre-grupper som defineret ovenfor, 3 (a) R1 betyder hydrogen eller ligekædede eller forgre-30 nede alkylalkohol- eller alkylcarboxylsyre-grupper med fra

DK 159171 B

10 (b) RP og R^, der er ens eller forskellige, er lige-kædede eller forgrenede alkylengrupper med fra 1-3 carbon-atomer eller divalente 1,2-cycloaliphatiske grupper med fra 6-9 carbonatomer, 5 (c) n er et helt tal med en værdi fra 0 til 1, m er et helt tal med en værdi fra 0 til 2, idet såfremt m er 2, 2 R^-grupper kan være ens eller forskellige, og (d) M betyder_Fe+3.

Foretrukne forbindelser er de, hvor m er 0, n er 1, 10 og rP er en ethylengruppe. Særligt foretrukne er metalche-laterne af polycarboxyalkylamin-derivater, i hvilke alkyl-carboxylsyre-grupperne er -CH2COOH.

Et foretrukket metalchelat er et ferrichelat af N-(2--hydroxyethyl)-ethylendiamintrieddikesyre (Fe-HEDTA).

15 I en foretrukken udførelsesform for opfindelsen in korporeres materialet i en bærematrix, f.eks. et sugende papir, til dannelse af et testmiddel, der kan fastgøres til en indifferent understøtning til dannelse af et testorgan, og opfindelsen angår således også et testmiddel til bestem-20 melse af et peroxidativt aktivt stof i en testprøve, og dette middel er ejendommeligt ved, at det omfatter en bærer-matrix, hvori der er inkorporeret et materiale ifølge opfindelsen som ovenfor defineret. Desuden tilvejebringes der med den foreliggende opfindelse en fremgangsmåde til frem-25 stilling.af testmidlet.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af et testmiddel til-bestemmelse af nærværelsen af et peroxidativt aktivt stof i en testprøve, hvor testmidlet er resistent mod interfererende virkninger af ascorbat, der 30 kan være til stede i prøven, er ejendommelig ved, at denne fremgangsmåde omfatter følgende trin: a) fremstilling af en første reagensopløsning indeholdende et organisk hydroperoxid og et metalchelat af et polycarboxyalkylamin-derivat med den almene formel

DK 159171B

11

( RX RY ) M

> R3--i-RP---N-Rq--N-R2 V

V _ n L J m '' 1 s V ^ y i hvilken (i) R1 betyder hydrogen eller ligekædede eller forgrenede alkylalkohol- eller alkylcarboxylsyre-grupper med fra 2-3 carbonatomer, R2, R3, Rx og RY, der er ens eller for- 10 skellige, er ligekædede eller forgrenede alkylalkohol- eller alkylcarboxylsyre-grupper med fra 2-3 carbonatomer, idet mindst to af substituenterne R1, R2, R3, Rx eller RV er alkylcarboxylsyre-grupper som defineret ovenfor, (ii) RP og r3, der er ens eller forskellige, er lige- 15 kædede eller forgrenede alkylengrupper med fra 1-3 carbonatomer eller divalente 1,2-cycloaliphatiske grupper med fra 6-9 carbonatomer, (iii) n er et helt tal med en værdi fra 0 til 1, m er et helt tal med en værdi fra 0 til 2, idet såfremt m er 20 2,2 R^-grupper kan være ens eliler forskellige, og (iv) M betyder Fe+3, b) inkorporering af den første reagensopløsning i en bærermatrix ved fugtning af matrixen med den første opløsning, 25 c) tørring af den fugtede matrix til efterladelse af en remanens af metalchelatet og hydroperoxidet, d) fremstilling af en anden reagensopløsning indeholdende en indikator og et opløsningsmiddel, idet indikatoren er i stand til at tilvejebringe et detekterbart respons i 30 nærværelse af et peroxid og det peroxidativt aktive stof, e) inkorporering af den anden reagensopløsning i den tørrede bærermatrix ved fugtning af matrixen med den anden reagensopløsning, og f) tørring af matrixen til efterladelse af en kom- 35 bineret remanens indeholdende metalchelatet, hydroperoxidet og indikatoren.

DK 159171B

12

Anvendelse af et metalchelat ifølge opfindelsen medfører, at materialerne og testmidlet ikke blot får en fortrinlig resistens mod ascorbat-interferens, men også en uventet fordelagtig stabilitet, hvilket genspejles i ekspe-5 rimentelle resultater med hensyn til god opbevaringsstabilitet og stabilitet ved forhøjede temperaturer samt undgåelse af "falske positive" resultater.

Indledende vådkemiske forsøg udført under udviklingen af den foreliggende opfindelse, og ved hvilke der an-10 vendes kun ferrichelatet af N-2-(hydroxyethyl)-ethylendiamin-trieddikesyre (her betegnet Fe-HEDTA, idet denne betegnelse anvendes af bekvemmelighedsgrunde og ikke skal antyde noget om eksistensen af en covalent binding mellem metalionen og polycarboxyalkylamin-derivatet), ascorbinsyre og puffer, be-15 kræftede hurtigheden af ascorbinsyre-oxidationen i nærværelse af dette chelat, et resultat, der kunne forventes ud fra de tidligere nævnte rapporter fra Khan og Martell. I betragtning af, hvor meget hurtigere TMB har vist sig at blive oxideret i peroxidaseholdige materialer, sammenlignet med 20 ascorbinsyre-oxidation med sådanne materialer, forventedes det således, at et materiale, der indeholder et organisk hydroperoxid, en oxiderbar indikator såsom TMB samt yderligere et sådant metalchelat, ville være yderst ustabilt og hurtigt give "falske positive" resultater.

25 Ved yderligere forsøg har det imidlertid vist sig, at der kan fremstilles et materiale, der omfatter sådanne metalchelater, og som er egnet.til detektering af peroxi-dativt aktivt stof, og endvidere kan tilpasses en tør, fast tilstand, idet materialet udviser god reagensstabilitet un-30 der fremstillingen og ved opbevaring samt undgåelse af "falske positive" resultater, ved kontakt med kendt hæmoglobin-negativ urin. Dette resultat som opnået med den foreliggende opfindelse står i modsætning til ethvert forslag i den kendte teknik, der som tidligere diskuteret foreslår, 35 at metalchelater såsom Fe-HEDTA kan anvendes som "model--peroxidaser", og således ville være uegnede til anvendelse i et materiale til bestemmelse af koncentrationen af en peroxidativt aktiv analyt.

DK 159171 B

13

Testmidler til detektering af okkult blod (OB), dvs. hæmoglobin, i biologiske væsker såsom urin, der er fremstillet ud fra det hidtil ukendte materiale ifølge opfindelsen, har vist sig at være resistente mod unormalt forhøjede as-5 corbinsyreniveauer i urin. Som tidligere diskuteret er in-hibering på grund af ascorbinsyre et alvorligt problem, navnlig i betragtning af den kendsgerning, at omkring 25% af urinprøver kan forventes at udvise ascorbinsyre-niveauer, der er højere end 10 mg pr. dl (mg/dl). Konventionelle OBIO -midler eller -organer, der ikke omfatter et ascorbat-inter-ferens-retarderende middel af en eller anden art, viser sig sædvanligvis at blive inhiberet, dvs. gjort mindre følsomme over for nærværelsen af hæmoglobin, ved ascorbinsyrekon-centrationer så lave som 5 mg/dl. Midler, der fremstilles 15 ifølge den foreliggende opfindelse, er imidlertid i høj grad fordelagtige med hensyn til ascorbat-interferens-resi-stens, i forhold til sådanne konventionelle midler og organer, idet midlerne ifølge opfindelsen muliggør detektering af peroxidativt aktive stoffer i væsker, der indeholder 20 forholdsvis høje niveauer af ascorbinsyre, f.eks. af størrelsesordenen 50 mg/dl.

Med den foreliggende opfindelse tilvejebringes der således et materiale og et testmiddel til bestemmelse af peroxidativt aktive stoffer i biologiske væsker såsom urin.

25 Ud over hæmoglobin kan der også detekteres andre peroxidativt aktive stoffer ved hjælp at de her omhandlede materialer og midler, herunder f.eks. peroxidase, myoglobin, erythrocyter og andre pseudoperoxidaser. Opfindelsen involverer anvendelsen af et metalchelat, der er et derivat af en polycarboxy-30 alkylamin, og som også kendes som en "model-peroxidase", med det formål at reducere eller eliminere de ødelæggende og uønskede virkninger af ascorbinsyre på analytiske bestemmelser udført på biologiske væsker. I denne henseende virker metalchelatet således, at det letter oxidationen af ascor-35 bationer, der kan være til stede i sådanne væsker.

DK 159171 B

o 14

Materialet og testmidlet ifølge opfindelsen har vist sig at være væsentligt mindre udsat for ascorbat-interferens, og at give et respons, der er visuelt eller instrumentalt detekterbart, f.eks. et farverespons, på nærværelsen af 5 spor-hæmoglobinniveauer af størrelsesordenen 0,03 mg/dl eller endog mindre.

Det organiske hydroperoxid, der skal anvendes i materialet ifølge opfindelsen, kan udvælges blandt mange velkendte organiske hydroperoxider. Et udvalgt hydroperoxid 10 skal imidlertid være i stand til at reagere med et peroxida-tivt aktivt stof i nærværelse af en indikator til frembringelse af et detekterbart respons, f.eks. en farveændring eller en ændring i den mængde lys, der absorberes eller reflekteres af testmaterialet. Blandt hydroperoxider, der 15 er særligt egnede, kan nævnes cumen-hydroperoxid, tert.buty 1-hydroperoxid, diisopropylbenzen-hydroperoxid, 2,5-di-methylhexan-2,5-dihydroperoxid, paramenthan-hydroperoxid samt andre velkendte hydroperoxider, der er egnede til oxidation af den anvendte indikator, eller blandinger af dis-20 se forbindelser. Blandt de ovennævnte hydroperoxider er cumen -hydroperoxid det mest foretrukne.

Mange indikatorer er egnede til anvendelse i det her omhandlede materiale, blot de er i stand til ved interaktion at frembringe et detekterbart respons i nærværelse af 25 et organisk hydroperoxid og et peroxidativt aktivt stof.

Disse indikatorer omfatter eksempelvis forbindelserne af den såkaldte "benzidin-type", benzidin, o-tolidin, 3,3',5,5'-te-tra-(lavere alkyl)-benzidin, 2,7-diaminofluoren og blandinger af disse forbindelser og forskellige andre. Betegnelsen 30 "lavere alkyl" henviser til en alkylgruppe med fra 1 til 6 carbonatomer, herunder methyl, ethyl, n-propyl og isopropyl, og de forskellige butyl-, pentyl- og hexyl-isomere. Indikatoren 3,3',5,5'-tetramethylbenzidin (TMB) er særlig fore trukken.

35 Egnetheden af et bestemt metalchelat, der udvælges til anvendelse, bestemmes ikke blot af dets evne til at

O

15

DK 159171B

lette oxidationen af ascorbinsyre, men også af dets forenelighed med de andre bestanddele af materialet. Sådanne egnede chelater har således vist sig at omfatte metalchela-ter af polycarboxyalkylamin-derivater, der kan repræsente-5 res ved den almene formel:

( RX RY R1 J

< R2--N-RP---1-Rq--N-R2 Λ. ^ H

10 - _ n __ m ^

Eksempler på metalchelater, der har vist sig egnede til anvendelse i forbindelse med den foreliggende opfindel-15 se, omfatter således ferri-chelaterne af N-(2-hydroxyethyl)--ethylendiamintrieddikesyre (Fe-HEDTA), ethylendiamintetra-eddikesyre (Fe-EDTA), cyclohexylendiamintetraeddikesyre (Fe--CDTA), nitrilotrieddikesyre (Fe-NTA), iminodieddikesyre (Fe-IMDA), ethylendiamindieddikesyre-dipropionsyre (Fe-EDDP), 20 både a- og β-former, samt hydroxyethyliminodieddikesyre (Fe--HIMDA) og blandinger deraf. Ferrichelat-formerne foretrækkes almindeligvis, og mest foretrukne er forbindelserne Fe--HEDTA og Fe-EDTA, idet Fe-HEDTA navnlig foretrækkes. Ud over de her specifikt angivne chelater kan der imidlertid 25 ifølge opfindelsen anvendes mange andre egnede chelater, hvilket vil være åbenbart for en fagmand med kendskab til det foregående.

Det har således vist sig eksperimentelt, at Fe-HEDTA og Fe-EDTA, især Fe-HEDTA, giver fortrinlige resultater i 30 det her omhandlede materiale og testmiddel, idet der på særdeles tilfredsstillende måde tilvejebringes ascorbinsyre--interferens-resistens ved tests for okkult blod (hvilket muliggør detektering af hæmoglobin), idet der tilvejebringes god reagensstabilitet inden anvendelsen og undgåelse 35 af "falske positive" resultater. Endvidere vil andre her angivne metalchelat-forbindelser samt adskillige andre

DK 159171 B

16 o virke tilfredsstillende. Væsentlige variationer i den hastighed, med hvilket et peroxidativt aktivt stof kan detek-teres, når der anvendes sådanne andre forbindelser, kan imidlertid forventes på grund af varierende hastigheder for as-5 corbat-oxidation. Det vil således forstås, at egnede metal-chelater til anvendelse i forbindelse med den foreliggende opfindelsen kan udvælges fra vilkårlige sådanne, der er po-lycarboxyalkylamin-derivater inden for den klasse af forbindelser, der tidligere er beskrevet, og at alle sådanne 10 forbindelser kan forventes på tilfredsstillende måde at muliggøre oxidation af ascorbat, hvilket betyder, at disse forbindelser falder inden for opfindelsens rammer. Mange forbindelser vil dog i denne henseende virke langsomt og er således mindre praktisk egnede til kommerciel anvendelse og fo-15 retrækkes ikke.

Egnede metalchelater til anvende]se i forbindelse med opfindelsen kan fremstilles ved konventionelle laboratoriemetoder under anvendelse af polycarboxyalkylamin-derivater, der er kommercielt tilgængelige fra eksempelvis Aldrich 20 Chemical Co., Sigma Chemical Company eller andre leverandører. Eksempelvis kan metalchelatet Fe-HEDTA fremstilles ved blanding af ækvimolære mængder af kommercielt tilgængelig HEDTA og FeCl^-G^O i vandig opløsning til tilvejebringelse af en 1:1 (mol:mol) Fe-HEDTA-opløsning af jernrchelat. Andre 25 opløsningskoncentrationsforhold mellem metal og chelat kan let fremstilles ved variation af de respektive koncentrationer af de sammenblandede opløsninger. Det har vist sig, at de bedste resultater med hensyn til overvindelse af ascorbat--interferens opnås, når koncentrationen af metalion i forhold 30 til polycarboxyalkylamin-derivat i chelatet er ca. 1:1 (mol: mol) .

Et foretrukket koncentrationsområde for et givet me-talchelat vil variere betydeligt ved forskellige udførelsesformer for opfindelsen. Eksempelvis i tilfælde af Fe-HEDTA 35 ligger et foretrukket koncentrationsområde i øjeblikket fra ca. 0,5 millimolær (mM) til ca. 50 mM, når det anvendes i et

O

17

DK 159171B

materiale indeholdende et organisk hydroperoxid og en tetra--(lavere alkyl)-benzidin-indikator. Dette område er blevet bestemt som det optimale til opnåelse af resistens op til ca. et ascorbat-koncentrationsniveau på 50 mg/dl i urinprøver.

5 Det har ved forsøg endvidere vist sig, at lavere koncentrationer af nogle egnede ferrichelater muliggør forholdsvis hurtig hæmoglobindetektering, medens højere koncentrationer af de samme chelater eller af andre chelater var mindre effektive. Disse tilsyneladende unormale resultater er nærmere 10 angivet i det følgende og viser den manglende generelle sammenhæng mellem chelatkoncentration og funktionalitet eller egnethed i det her omhandlede materiale.

Det har eksperimentelt vist sig, at hovedparten af egnede metalchelater, der virker tilfredsstillende i det 15 her omhandlede materiale, strukturelt har en alkylamin- eller en amin-centralgruppe, samt carboxylsyre-radikalet -CK^COOH. Andre chelater, der ikke har sådanne karakteristika, men som falder inden for det generelle omfang for forbindelserne, der tidligere er angivet, kan imidlertid 20 generelt være effektive til overvindelse af ascorbat-inter-ferens og tilvejebringelse af tilfredsstillende sensitivitet og stabilitet, og disse er derfor tilfredsstillende til anvendelse .

Det vil forstås, at ved anvendelsen vil ydeevnen af 25 en bestemt udførelsesform for et materiale eller et testmiddel, der er baseret på den generelle opfindelsestanke, afhænge af mange forskellige faktorer. Eftersom en typisk urinprøve fra et menneske, der er vænnet til indtagelse af store mængder ascorbinsyre (vitamin C), ofte indeholder 30 fra 25-100 mg/dl ascorbat eller mere, er et reference-as-corbatniveau til researchformål blevet valgt til ca. 50 mg/dl. Foretrukne udførelsesformer for det ascorbat-resi-stente materiale og testmidlet ifølge opfindelsen har vist sig at muliggøre detektering af peroxidativt aktive stoffer 35 i sådanne prøver, ikke blot ved referenceniveauet på ca.

50 mg/dl, men også ved forskellige andre ascorbat-niveau-

DK 159171B

18 o er. I de fleste tilfælde kan der forekomme en forlænget tid for respons med ascorbat-niveauer, der er meget større end chelat-koncentrationsniveauet. Som det fremgår af det følgende, har "forsinkelsestider", dvs. den tid, der for-5 løber, indtil der fremkommer et iagttageligt respons, eksperimentelt vist sig at ligge i området fra mindre end 1/3 minut til ca. 1/2 time, for foretrukne udførelsesformer for opfindelsen med forskellige chelat-koncentrationsni-veauer, der er afprøvet for deres evne til detektering af 10 hæmoglobin i urin i nærværelse af et niveau på 50 mg/dl af ascorbat.

I en foretrukken udførelsesform anvendes materialet ifølge opfindelsen til fremstilling af et testmiddel til bestemmelse af et peroxidativt aktivt stof. I en sådan fo-15 retrukken udførelsesform kan materialet inkorporeres i en egnet bærermatrix til dannelse af et testorgan. Bærermatrixen kan have mange former, f.eks. de, der er beskrevet i USA-patentskrift nr. 3.846.247 (filt, porøse keramiske strimler og vævede eller matterede glasfibre). Også egne-20 de er de matrixer, der er beskrevet i USA-patentskrift nr. 3.552.928 (træstrimler, stof, svampemateriale og lerag-tige stoffer). Anvendelsen af syntetiske harpiksflor og glasfiberfilt som bærematrixer er foreslået i det britiske patentskrift nr. 1.369.139. Ifølge et andet britisk patent, 25 nr. 1.349.623, foreslås anvendelsen af lyspermeable netværk af tynde filamenter som et overtræk for en underliggende pa-pirmatrix. Polyamidfibre er beskrevet i det franske patentskrift nr. 2.170.397. Til trods for disse angivelser er de materialer, der konventionelt anvendes som bærematrixerr og 30 som er særligt foretrukne og egnede til anvendelse i forbindelse med den foreliggende opfindelse, sugende materialer såsom filterpapir og lignende. Det må imidlertid bemærkes, at bærematrixen kan have forskellige fysiske former som ovenfor angivet, samt andre former, og at alle sådanne 35 former er egnede og kan anvendes i forbindelse med nærværende opfindelse.

O

19

DK 159171 B

Ved fremstillingen af testmaterialet ifølge opfindelsen kan materialets bestanddele inkorporeres i bærema-trixen på en række forskellige måder. Eksempelvis kan bestanddelene opløses eller suspenderes i vand eller et an-5 det egnet opløsningsmiddel, fortrinsvis et organisk opløsningsmiddel såsom ethanol, acetone eller dimethylformamid (DMF), samt blandinger af disse opløsningsmidler og andre. Opløsningen eller suspensionen kan derpå anvendes til imprægnering af sugende filtrerpapir, f.eks. i form af en svær-10 te, i hvilken reagenserne trykkes på en egnet matrix. Alternativt kan bærematrixen neddyppes i eller overtrækkes med materialet, f.eks. med en rakel.

Den i øjeblikket foretrukne metode til inkorporering af bestanddelene af materialet i bærematrixen består i im-15 prægnering af sugende filtrerpapir med to eller flere opløsninger eller suspensioner af bestanddelene. Imprægneringen opnås således ved neddypning af et stykke filtrerpapir to eller flere gange i sådanne opløsninger eller suspensioner, hvorpå det neddyppede papir tørres i en ovn efter hver ned-20 dypning. De således tildannede testmidler lamineres dernæst til den ene side af et stykke dobbeltsidet adhæsivt tape, laminatet skæres i strimler, og hver strimmel forbindes til et aflangt ark af bagklædningsmateriale af plast, f.eks. polystyren, som dernæst opskæres parallelt med dets korte di-25 mension til dennelse af aflange organer med det imprægnerede papir ved den ene ende, idet den anden ende tjener som et håndgreb. Det således fremstillede testorgan består således af et stykke af det dobbelt tørrede og imprægnerede testmateriale, der ved den ene ende er fastgjort til en plan side 30 af en aflang plastunderstøtning, som dernæst udgør et bekvemt håndgreb.

En foretrukken metode til fremstilling af testmidlet ifølge opfindelsen består eksempelvis i, at Fe-HEDTA indføres i filtrerpapiret sammen med det organiske hydroperoxid, 35 men inden tilsætningen af indikatoren, ved en vandig første neddypning. Filtrerpapiret kan således først imprægneres med 0

DK 159171B

20 en vandig opløsning af Fe-HEDTA og hydroperoxidet, sammen med et eller flere egnede opløsningsmidler og/eller puffere, f.eks. triethanolamin-borat og tris-(hydroxymethyl)-aminome-than-malonat (her betegnet TRIS-malonat), tørres, genimpræg-5 neres i en anden neddypningsopløsning af indikatoren i et egnet opløsningsmiddel, f.eks. ethanol, og tørres en yderligere gang. En sådan proces medto neddypninger, hvor metal-chelatet først imprægneres i papiret inden de andre aktive reagenser, har vist sig sig at give et testmiddel, der ud-10 viser fortrinlig ascorbat-resistens og opbevaringsstabilitet .

En specielt foretrukken metode til fremstilling af testmidlat ifølge opfindelsen består i at indføre metal-chelatet og reagenserne, bortset fra indikatoren, i filtrer-15 papiret ved neddypning deraf i en første opløsning af reagenserne som tidligere beskrevet, hvorefter man tørrer papiret og derpå tilsætter indikatoren ved neddypning af det tørrede papir i en opløsning af indikatoren og et fortykkelsesmiddel, f.eks. polyvinylpyrrolidon, i et egnet opløs- 20 ningsmiddel, efterfulgt af en yderligere tørring.

Ud over de i det foregående beskrevne testmaterialereagenser og andre bestanddele kan der inkluderes yderligere bestanddele, f.eks. forskellige fortykkelsesmidler, fug-temidler, pufferstoffer, emulgeringsmidler og velkendte til-25 sætningsstoffer, i det her omhandlede materiale og det her omhandlede testmiddel. Eksempelvis kan der som fortykkelsesmidler anvendes forskellige materialer ud over eller i stedet for polyvinylpyrrolidon, f.eks. gelatine, algin, car-rageenin, casein, albumin, methylcellulose og lignende. Som 30 fugtemiddel er det foretrukket at anvende natriumdodecylsul-fat, men der kan også anvendes ethvert langkædet organisk sulfat eller sulfonat, f.eks. dioctylnatriumsulfosuccinat eller natriumdodecylbenzensulfonat. I puffersysternerne kan der udover triethanolaminborat og TRIS-malonat anvendes tartrat, 35

O

21

DK 159171 B

phosphat, phthalat, citrat, acetat, succinat eller andre puffere. Fortrinsvis pufres materialerne til en pH-værdi på fra ca. 6,0 til ca. 7,0. Som emulgeringsmidler kan der eksempelvis anvendes polyvinylalkohol, gummi arabicum eller 5 carboxyvinylpolymere. De organiske opløsningsmidler, der kan anvendes til suspendering af indikatoren, omfatter de fleste ikke-reaktive, organiske, flygtige opløsningsmidler såsom ethanol, acetone, DMF, chloroform, ethylendichlorid, benzen og ethylacetat. Naturligvis er valget af andre egne-10 de opløsningsmidler uden videre muligt for en fagmand på det foreliggende område.

Ved anvendelsen kan testmidlet neddyppes i en væskesuspension af det materiale, der skal testes, og dernæst øjeblikkeligt fjernes igen. Alternativt kan prøven, på fly-15 dende, fast eller halvfast form, påføres på testmidlet. I

nærværelse af et peroxidativt aktivt stof i prøven frembringer testmaterialet en farveændring eller et andet detekterbart respons. Såfremt det nævnte respons er en farve, kan denne sammenlignes med i forvejen kalibrerede farvestandarder til 20 bedømmelse af den kvantitative mængde af peroxidativt aktivt stof, der er indeholdt i prøven. Intakte peroxidativt aktive stoffer, f.eks. intakte røde blodlegemer, kan vise sig som prikker eller pletter af farve på den i øvrigt ufarvede matrix. Hæmolyserede peroxidativt aktive stoffer kan på ens-25 artet måde farve matrixen. Udover visuel sammenligning kan der også anvendes forskellige instrumentmetoder til bestemmelse af kvaliteten af farven eller et andet frembragt respons, hvorved man forøger nøjagtigheden af testen ved undgåelse af den subjektive bestemmelse ved hjælp af det men-30 neskelige øje.

De følgende eksempler tjener til nærmere illustration af opfindelsen og dennes fordele.

35

O

22

DK 159171 B

Eksempler A. Testmaterialet 5 Eksempel 1 — Fe-HEDTA

Der gennemføres et forsøg, hvor materialet ifølge opfindelsen, der kan anvendes til bestemmelse af nærværelsen af peroxidase eller et andet peroxidativt aktivt stof i en testprøve, især hæmoglobin, fremstilles. Materialet omfat-10 ter, som et ascorbat-interferens-retarderende middel, et 1:1 (mol til mol angivet som M:M)-ferrichelat af N-(2-hy-droxyethyl)-ethylendiamintrieddikesyre (FE-HEDTA). Fe-HEDTA-chelatet fremstilles ved opløsning af 0,278 g HEDTA i 100 ml destilleret vand til dannelse af en 10 mM HEDTA-15 -opløsning, hvorpå der opløses 0,270 g FeCl3.6H20 i den 10 mM HEDTA-opløsning. Ascorbinsyre i en koncentration på 5 mM sættes til materialet i en mængde, der er tilstrækkelig til at frembringe et koncentrationsniveau på 50 jiM i det endelige rumfang af opløsningen. Bestanddelen af mate-20 rialet og ascorbinsyren kombineres i den rækkefølge og i de mængder, der er angivet i den følgende tabel. Opløsningen af det endelige materiale indeholder en 100 jiM koncentration af Fe-HEDTA, hvilket er et koncentrationsniveau, der ligesom niveauet for de andre tilstedeværende bestand-25 dele er væsentligt mindre end det, der skulle anvendes i et tilsvarende materiale ifølge opfindelsen til inkorporering i et testmiddel i fast tilstand.

0,2 molær (M) natriumcitrat-puffer 9,5 ml 30 10 mM Fe-HEDTA 0,1 ml 10 g/dlK natriumdodecylsulfat 0,1 ml 1 M cumen-hydroperoxid 0,1 ml 10 mM 3,3',5,5'-tetramethylbenzidin 0,1 ml 5 mM ascorbinsyre 0,1 ml gram pr. deciliter 35 x

O

DK 159171B

23

Det således fremstillede materiale ifølge opfindelsen iagttages at danne en blå farve, når en vandig blodali-quot tilsættes til dannelse af en slutkoncentration på 0,139 mg hæmoglobin pr. dl i opløsningen, hvilket viser ma- 5 terialets evne til detektering af tilstedeværende hæmoglobin til trods for prøvens niveau af ascorbat på 50 pM.

Eksempel 2 — Fe-EDTA

Forsøget fra eksempel 1 gentages med den undtagelse, 10 at der anvendes 10 mM af ferrichelatet af ethylendiaminte-traeddikesyre (Fe-EDTA) i opløsning i stedet for Fe-HEDTA. Fe-EDTA fremstilles i det væsentlige som beskrevet i eksempel 1 ved opløsning af 0,292 g EDTA i 100 ml destilleret vand og tilsætning af FeCl3.6H20 som beskrevet i eksempel 1.

15 Det således fremstillede materiale danner, som i eksempel 1, en blå farve i nærværelse af 0,139 mg hæmoglobin pr. dl og 50 pM ascorbat.

Eksempel 3 — Fe-CDTA

20 Forsøget fra eksempel 1 gentages med den undtagelse, at der anvendes 10 mM af ferrichelatet af cyclohexylendiamin-tetraeddikesyre (Fe-CDTA) i opløsning i stedet for Fe-HEDTA. Fe-CDTA-opløsningen fremstilles ved opløsning af 0,346 g CDTA i 100 ml destilleret vand og tilsætning af FeCl3.6H20 25 som beskrevet i eksempel 1. Det således fremstillede materiale danner ligesom i eksempel 1 en blå farve i nærværelse af 0,139 mg hæmoglobin pr. dl og 50 pM ascorbat.

Eksempel 4 — Fe-IMDA

30 Forsøget fra eksempel 1 gentages med den undtagelse, at der anvendes 10 mM af ferrichelatet af iminodieddikesyre (Fe-IMDA) i opløsning i stedet for Fe-HEDTA. Fe-IMDA-opløsningen fremstilles ved opløsning af 0,133 g IMDA i 100 ml destilleret vand og tilsætning af FeCl3.6H20 som beskrevet 35 i eksempel 1. Det således dannede materiale frembringer ligesom i eksempel 1 en blå farve i nærværelse af 0,139 mg hæmoglobin pr. dl og 50 pM ascorbat.

O

24

DK 159171B

Eksempel 5 — Fe-NTA

Forsøget fra eksempel 1 gentages med den undtagelse, at der anvendes 10 mM af ferrichelatet af nitrilotrieddike-syre (Fe-NTA) i opløsning i stedet for Fe-HEDTA. Fe-NTA-op-5 løsningen fremstilles ved opløsning af 0,191 g NTA i 100 ml destilleret vand og tilsætning af FeClg-61^0 som beskrevet i eksempel 1. Det således fremstillede materiale danner ligesom i eksempel 1 en blå farve i nærværelse af 0,139 mg hæmoglobin pr. dl og 50 jaM ascorbat.

10

Eksempel 6 — Fe-EDDPa ~ Forsøget fra eksempel 1 gentages med den undtagelse, at der anvendes 10 mM af ferrichelatet af a-ethylendiamindi-eddikesyre-dipropionsyre (Fe-EDDPa) i opløsning i stedet for 15 Fe-HEDTA. Fe-EDDPa~opløsningen fremstilles ved opløsning af 0,320 g EDDPa i 100 ml destilleret vand, hvorpå der tilsættes FeCl2-6H20 som beskrevet i eksempel 1. Det således fremstillede materiale danner en blå farve ligesom i eksempel 1 i nærværelse af 0,139 mg hæmoglobin pr. dl og 50 jiM ascorbat.

20

Eksempel 7 — Fe-EDDP^

Forsøget fra eksempel 1 gentages med den undtagelse, at der anvendes 10 mM af ferrichelatet af β-ethylendiamindi-eddikesyre-dipropionsyre (Fe-EDDP^) i opløsning i stedet for 25 Fe-HEDTA. Fe-EDDP^-opløsningen fremstilles ved opløsning af 0,320 g EDDPg i 100 ml destilleret vand, hvorpå der tilsættes FeCl3.6H20 som beskrevet i eksempel 1. Det således fremstillede materiale danner ligesom i eksempel 1 en blå farve i nærværelse af 0,139 mg hæmoglobin pr. dl og 50 jiM ascorbat.

30

Eksempel 8 — Fe-HIMDA

Forsøget fra eksempel 1 gentages med den undtagelse, at der anvendes 10 mM af ferrichelatet af hydroxyethylimino-dieddikesyre (Fe-HIMDA) i opløsning i stedet for Fe-HEDTA.

35 Fe-HIMDA-opløsningen fremstilles ved opløsning af 0,177 g

O

25

DK 159171 B

HIMDA i 100 ml destilleret vand, hvorpå der tilsættes FeCl3.6H20 som beskrevet i eksempel 1. Det således fremstillede materiale danner en blå farve ligesom i eksempel 1 i nærværelse af 0,139 mg hæmoglobin pr. dl og 50 pM ascor-5 bat.

Eksempel 9-16

Der udføres forsøg i det væsentlige som beskrevet i de foregående eksempler 1-8 til fremstilling af materialer 10 ifølge opfindelsen, men med den undtagelse, at der i hvert enkelt tilfælde anvendes 9,4 ml 0,2 M natriumcitratpuffer i stedet for 9,5 ml, og at der anvendes 0,2 ml af hvert fer-richelat i stedet for 0,1 ml. Dette gør det muligt, at der kan være en koncentration af ferrichelat på 200 pM til ste-15 de i hvert materiale. I hvert enkelt tilfælde iagttages materialet indeholdende 200 pM ferrichelat, når det testes som tidligere beskrevet, at danne blå farver i nærværelse af 0,139 mg hæmoglobin pr. dl og 50 pM ascorbat, hvilket viser en evne til detektering af hæmoglobin til trods for 20 nærværelsen af ascorbat i prøven. Der iagttages imidlertid forskelle mellem de tider, der kræves til farvedannelsen, ved sammenligning med de farvedannelsestider, der iagttages, når man på tilsvarende måde tester ferrichelat-materialerne med 100 pM i eksemplerne 1-8. Farvedannelsestiderne i hvert 25 enkelt tilfælde, der betegnes som "forsinkelsestider", er angivet i den følgende tabel og viser, at der som tidligere beskrevet ikke synes at være noget generelt forhold eller nogen generel korrelation mellem koncentrationen af me-talchelat, f.eks. et af de i det foregående nævnte ferri-30 -komplekser, som anvendes i et materiale ifølge opfindelsen, og materialets evne til at modvirke ascorbat-interfe-rens og tillade detektering af et peroxidativt aktivt stof.

35

DK 159171 B

26 03 rJ +3 +> ·

I M U G

o' ©© Ή · · · · ·

G S fn-iH-igPCPCG

O airl "d Ό -H -H -H -H -H

•rH 0)PPO3ggggg -t-> O Dj \ „

(ti oEdJCU'-HO'inoo'O

U N 0) X M r-f r-t 03 +j ω ,¾ λ: οι

G 44 -Η -H

0) M

O G

0 44 +3

P

Ό iH 00

•cf G) I

+J JG ...........

in U S 4X44DDCCCP

0) r-t P. Ή Q) Φ -H -H -rj -rj -Η -H

in p OJtntogggggg • •i—I 4-3 O Dj G) oEoor'fountnoorHO 034X4-3 g rH O) H >£> ΙΗΗΠ03 4-> G (ΰ to (0 ·Η 43 44

4-3 tn D H

i—I M 0 p o υ to ο-j to Φ p D - M ID 2 tP ffi Λ.

·©- Ή

tQ CD O

J-ι C lH 4->

O C — P

Ό 0) 0) Λ > ·· U C S CD <

>4 4-> I

ro rd+ QE^EHQ^QQS

lu r-tm HQPS^QOH

0) 0) tCHUHSWWffi ,Cl &j o i i i i i i i i PS + + + + + + + + 4j .. mnmnnnnn CDS 0)(1)(1)0)0)030)0) JS '—'

i—I

rH

i—I

0) OiHoiMrriD'i) p i O' i—I i—I i—1 i—I rH *—3 *—4 g · Q)D tPtjitT'D'D'D'tPCri

top OOOOOOOO

44 y rioiro'tfintof'-co

O

27

DK 159171 B

B. Testmidlet Eksempel 17

Der udføres et forsøg, hvor et testmiddel i fast 5 tilstand fremstilles i overensstemmelse med opfindelsen.

Midlet omfatter en bærematrix af papir, der er inkorporeret med materialet ifølge opfindelsen som beskrevet i eksempel 1, men med den undtagelse, at koncentrationerne af bestanddelene varieres til afpasning efter den faste til-10 stand. Inkorporering af matrixen med materialet og dannelsen af testanordningen udføres under anvendelse af de følgende procedurer:.

Et 50 mM, 1:1 (mol:mol) ferrichelat af N-(2-hydroxy-ethyl)-ethylendiamintrieddikesyre (Fe-HEDTA) fremstilles 15 ved opløsning i 100 ml destilleret vand af 1,39 g N-(2-hy-droxyethyl)-ethylendiamintrieddikesyre, hvorpå der til opløsningen sættes 1,35 g FeClg. 61^0.

Der fremstilles to opløsningerr hvis sammensætning er angivet i det følgende. Til fremstilling af testmateria-20 let imprægneres derpå et stykke VThatman 3 MM filtrerpapir med de omtrentlige dimensioner 15 cm x 10 cm med reagensopløsningerne, således at papiret bliver fuldstændigt inkorporeret med reagensmaterialet efter den anden neddyp-ning. Den anvendte procedure involverer imprægnering af 25 papiret ved neddypning deraf i den første opløsning, tørring af det imprægnerede papir og derefter yderligere imprægnering af det tørrede papir ved neddypning i den anden opløsning, efterfulgt af en afsluttende tørring. Tørringen udføres i en ovn med forceret træk ved 105°C i ca. 8 minut-30 ter efter den første imprægnering og ved ca. 50°C i ca.

5 minutter efter den anden imprægnering.

Den første reagensopløsning fremstilles ved blanding af de følgende bestanddele: 35 28

DK 159171B

O

Destilleret vand 74,0 ml 1 M Tris-malonat-puffer, pH 6,5 10,0 ml 5,5 m cumen-hydroperoxid 4,0 ml 10 g/dl natriumdodecylsulfat 2,0 ml 5 50 mM Fe-HEDTA (fremstillet som tidligere beskrevet) 10,0 ml

Den anden reagensopløsning fremstilles ved blanding af følgende bestanddele: 10 Ethanol 79,4 ml 6-methoxyquinolin, fri baseform 0,6 ml 20% (w/v) polyvinylpyrrolidon (vandig) (molekylvægt 40.000) 20,0 ml 3,3^5,51 -tetramethylbenzidin 0,6 g 15

Det tørrede, imprægnerede papir lamineres til den ene side af et stykke dobbeltsidet adhæsivt overføringstape, der er kommercielt tilgængeligt fra 3M Company, St. Paul, Minn.

55144. Laminatet opskæres dernæst i stykker, der måler ca.

20 15 cm x ca. 0,5 cm. Et af disse stykker knyttes ved hjælp af den ubenyttede adhæsive side til et polystyrenark, der måler ca. 9 cm x ca. 15 cm, og det resulterende laminat opskæres parallelt med dets korte dimension til dannelse af testmaterialer omfattende en ca. 9 cm aflang polystyrenstrim- 25 mel, der bærer et kvadrat af det imprægnerede papir ved den ene ende, idet den anden ende tjener som et håndgreb.

Afprøvning af testmaterialer fremstillet ved fremgangsmåden ifølge eksempel 17, i urinprøver, der indeholder forskellige koncentrationsniveauer af hæmoglobin og 30 en koncentration på 50 mg ascorbat pr. dl, giver let skelnelige blå farveniveauer, der svarer til de forskellige hæmoglobin-niveauer, hvilket viser materialets evne til detektering af det tilstedeværende hæmoglobin til trods for prøvernes høje indhold af ascorbat.

35

O

29

DK 159171B

Eksempel 18

Forsøget fra eksempel 17 gentages, men med den undtagelse, at der anvendes 10,0 ml af en 50 mM Fe-EDTA-opløs-ning i den første reagensopløsning i stedet for FE-HEDTA.

5 Afprøvning af materialer, der er fremstilles ifølge eksempel 18, udføres som tidligere beskrevet med urinprøver indeholdende forskellige koncentrationsniveauer af hæmoglobin og 50 mg ascorbat pr. dl, og der fås let skelnelige blå farveniveauer svarende til de forskellige hæmoglobin-niveau-10 er.

Eksempel 19

Forsøget fra eksempel 17 gentages, men med den undtagelse, at der anvendes 10,0 ml af en 50 mM Fe-CDTA-opløs-15 ning i den første reagensopløsning i stedet for Fe-HEDTA.

Afprøvning af materialer eller -anordninger, der er fremstillet ifølge eksempel 19, udføres som tidligere beskrevet med urinprøver indeholdende forskellige koncentrationsniveauer af hæmoglobin og 50 mg ascorbat pr. dl, og 20 der fås let skelnelige blå farveniveauer svarende til de forskellige hæmoglobin-niveauer.

Eksempel 20

Forsøget fra eksempel 17 gentages, men med den und-25 tagelse, at der anvendes 10,0 ml af en 50 mM Fe-IMDA-opløs-ning i den første reagensopløsning i stedet for Fe-HEDTA.

Afprøvning af materialer, der er fremstillet i overensstemmelse med eksempel 20, udføres som tidligere beskrevet med urinprøver indeholdende forskellige koncentrationer 30 af hæmoglobin og 50 mg ascorbat pr. dl, og der fås let skelnelige blå farveniveauer svarende til de forskellige hæmoglobin-niveauer.

35

O

30

DK 159171 B

Eksempel 21

Forsøget fra eksempel 17 gentages, men med den undtagelse, at der anvendes 10,0 ml af en 50 mM Fe-NTA-opløsning i den første reagensopløsning i stedet for Fe-HEDTA.

5 Afprøvning af testmaterialer, der er fremstillet ifølge eksempel 21, udføres som beskrevet i det foregående med urinprøver indeholdende forskellige koncentrationer af hæmoglobin og 50 mg ascorbat pr. dl, og der fås let skelnelige blå farveniveauer svarende til de forskellige hæmoglo-10 bin-niveauer.

C. Testmateriale. Ascorbat-interferens-resistens og -stabilitet.

Der gennemføres yderligere forsøg til bedømmelse af 15 evnen hos testmaterialerne, der er fremstillet som beskrevet i eksempel 17, til detektering af hæmoglobin i urin i nærværelse af ascorbat efter stress, der skal imitere lang tids opbevaring. Forsøgene udføres med nogle af materialerne umiddelbart efter, at de er fremstillet, samt med andre 20 materialer, efter at disse er blevet opbevaret i udstrakte perioder under forhøjede temperaturbetingelser. I særdeleshed testes og sammenlignes materialerne med hensyn til ydeevne \amiddelbart efter fremstillingen ved stuetemperatur (ca. 23°C) og efter 10 og 28 dage med "varme-stress" ved 25 ca. 50°C i en ovn.

Der fremstilles en række urin-testopløsninger, der indeholder forskellige hæmoglobinniveauer. Der fremstilles også to hæmoglobinopløsninger, de indeholder ascorbat i en koncentration på 50 mg/dl.

30 Der fremstilles en forrådsopløsning indeholdende 15,4 mg hæmoglobin pr. dl ved fortynding af helblod med destilleret vand til en koncentration på 15,4 mg hæmoglobin pr. 100 ml vand. Hæmoglobinindholdet i helblodet er i forvenen blevet bestemt ved anvendelse af konventionel teknik.

35 En prøve af sammenblandet urin, der tidligere er screenet ψ

O

31

DK 159171B

som negativ med hensyn til hæmoglobin og ascorbinsyre, henstilles som en blindprøve. Testopløsningerne fremstilles dernæst ved afpipettering af aliguoter af blodopløsningen i den sammenblandede urin til dannelse af urinopløsninger indehol-5 dende 0,015, 0,031, 0,062 og 0,139 mg hæmoglobin pr. dl. En del af urinopløsningerne indeholdende 0,031 og 0,062 mg hæmoglobin pr. dl isoleres i særskilte beholdere, og der tilsættes ascorbinsyre således, at opløsningerne bringes op på et niveau af 50 mg ascorbat pr. dl umiddelbart forud for af-10 prøvningen.

Et sæt testmaterialer, der er fremstillet som beskrevet i eksempel 17, samt et kontrolsæt, der er fremstillet som beskrevet i det nævnte eksempel, men med den undtagelse, at de ikke indeholder noget Fe-HEDTA, testes ved blindforsøg 15 og i hver af hæmoglobin-urin-opløsningerne. Materialerne ned-dyppes momentant i hver opløsning, hvorefter de fjernes, og farvedannelse i materialerne iagttages efter 1 minuts forløb.

De farver, der dannes, sammenlignes visuelt med hinanden og med et standard-farvekort til fastlæggelse af den relative 20 intensitet 1 minut efter neddypningen. Farverne strækker sig fra farveløs (for blindprøvens vedkommende) til mørk grønblå med hæmoglobinopløsningen indeholdende 0,138 mg/dl.

Resultaterne af denne afprøvning, der sammenfattet i den følgende tabel, viser, at de her omhandlede testmateria-25 ler, når de afprøves i de to hæmoglobinprøver indeholdende ascorbat, såvel efter at være frisk fremstillet som efter udsættelse for forhøjet temperatur på 50°C i 10 dage, giver far-ve-respons på nærværelsen af hæmoglobin ligesom respons fra de materialer, der anvendes til afprøvning af urinprøverne uden 30 ascorbat. Resultaterne fra tilsvarende afprøvning af kontrolmaterialerne, der ikke omfatter Fe-HEDTA, viser, at det respons, der fås fra kontrolmaterialerne, hæmmes praktisk taget fuldstændigt på grund af ascorbat i prøven. De materialer, der fremstilles ifølge den foreliggende foretrukne udførelsesform 35 for opfindelsen udviser imidlertid en evne til let detektering 32

DK 159171 B

O

af hæmoglobin i koncentrationer på 0,031 og 0,062 mg/dl, til trods for nærværelsen af en ascorbatkoncentration på 50 mg/dl. Nærværelsen af Fe-HEDTA viser sig således på drastisk vis at kompensere for ascorbat-interferens.

5 10 15 20 25 30 t 35

33 DK 159171 B

Η ·—- 0 h Η · (1)

E H Ή Ή £ Η H 0 O 4-) V H tn +J

tn c tu tu o Ό C 4i <U H

h S)( o cm o m o o g L*n_in> HHrtHCMrorO'tf HH H ft H O' +-> a> e-ι <3 _ 'O ° ε h w <“ . § -n

tu O' 33 ΰ > O

U E 1 n S (5 ^ lij η <D O H C - ^ U £ *W 0)

_V n-< * CD

in ø c +» » ft 0 •H > <U ^ 5 φ .

U Π3 O ·Η *

k, p ϋ Μ +1 H

^ ^ ® O H Ό * > 4J 0\ jj tu Vi ιί Λ O’

tu S' « Jj ® S

Π m H Q !> øh ι Λ H m Ϊ U Ό (0 It) H.

S CO S4 J H O

η (M 10 J·

q, Ό tn 0) O

0 h o ^ cm O æ Oco G 0 H

^ ΗΗίΜΓΟΡΟ CM CM (BH4JM

fli ti r i 44 (1) CU

H ø O in S Ό h id < h O ,. h

Hf ε tn m c *£ φ

HD H ^ S H

(U ta Η Ό rrl 2 . 5 ij æ d) 'O *H · *h Ε 0 11® o 1 a hXo H S H B1 irg ø ^ °ø f ε ·

.5 c b S E HUD S C

SS S -S p s g «= -g jj h > Ε Ε £ Λ

BH 0 O 9«WIJj O

P O XI H ” ® ^ in r O· f0 w'

0 0 OH O O m O O cm o £ Μ Ε P O

4JH H CM CM ΓΟ 'il1 CM ΓΟ B Ή O O E

HO > tn ft g HH 0 0 JJ g fri h o ø °ø o> roe Suo ΌΗΗΗΗ 0 s H. . * -H æ « c tn Η H I PJ 0 M \ >h hø « g*« g1 0 0) Ui > $12 I +j o> ø tn y b v HøHtnro

f C U H H ftj H

“o -8^.3 »0^0 S® HgH g g ° * g* 3 £ η 0 Λ 3 l Λ = 0

•r-I^. jj rrt P Π3 O vO

t n <l) <l)

Jj’H ø^^OOtncMun to cm H · a * “ HH^HCMCMCO^ CMro „ £ * ^ ° H C ft e 0 5 2 ^ ε p S S u c ^

m >pj (Π <U ·Η H C P

HHW HHOØU)

d +3 H Ø+JIWBO

“g 0 ? G H O

μΐ 3 ^ c h in > ø ~ ø ~ ^ λ ø η χ

Ό b> I Η H 0 H

\tns H ft 'rt n nT !lJ

0>CH O ΛΟΟ0Η

0 E H ft O (O^HC

> -^ XI Ό in^ H

«IjC øø occø

HGOH Η H 0 0 H

ftHOHinHCMCTiH^HCM Jj O’. ® DXtnXHrovxroOØ^vD O 'O C - >

HOØ'-'OOOH'v.COO SmØH

Ui—1 *te*«*0^*H ·*·*· d) O C H

ΟΟιβΟΟΟΟΟ Ε Λ O O H Vi Λ : i n ø H 0 w u 1 g, O HU »•«'f g g uo f ω E fts X! H w

^ C. X

O

34

DK 159171B

Resultaterne i den foranstående tabel viser også, at der kun er lille forskel i reaktivitet mellem testmaterialerne ifølge opfindelsen, der er blevet frisk fremstillet, og de, der er blevet opbevaret ved 50°C i 10 dage eller i 28 da-5 ge. Dette resultat står i modsætning til det forventede resultat: at interaktion mellem ferrichelat og et hydroperoxid i samme testmateriale ville forårsage en nedsættelse af materialets reaktivitet ved en højere hastighed under varmestress end ved opbevaring ved omgivelsernes temperatur. Det-10 te demonstrerer den gode stabilitet og fordelagtige opbevarings-levetid for materialet og midlet ifølge opfindelsen.

Som det ses af de i tabellen angivne data, er der øjensynlig kun lille eller ingen inkompatibilitet mellem det organiske hydroperoxid og Fe-HEDTA, mellem Fe-HEDTA og indikatoren, el-15 ler mellem disse stoffer og andre strimmel-bestanddele, selv efter forlænget opbevaring ved forhøjede temperaturer. Endvidere er metalchelat (Fe-HEDTA)-indeholdende testmaterialer og materialer, der tilsvarende fremstilles uden Fe-HEDTA, i det væsentlige ens med hensyn til sensitivitet for nærvæ-20 reisen af hæmoglobin i testopløsninger uden ascorbat og viser en undgåelse af "falske positive"-resultater, hvilket viser reagensernes fremragende forenelighed. Medens imidlertid materialerne, der er fremstillet uden Fe-HEDTA, praktisk taget fuldstændigt inhiberes ved tilstedeværelsen af ascorbat 25 i testopløsningerne, inhiberes strimlerne ifølge opfindelsen indeholdende Fe-HEDTA i langt mindre grad af ascorbat, og de er i virkeligheden i stand til at give respons, gennem fremkomsten af visuelt skelneligt farve efter 1 minut, på hæmoglobinniveauer så lave som 0,031 og 0,062 mg/dl.

30 Til yderligere påvisning af fordelene ved den fore liggende opfindelse udføres der yderligere eksperimentel afprøvning svarende til den foran beskrevne under anvendelse af midler, som fremstilles i eksempel 17, dvs. indeholdende Fe-HEDTA. Imidlertid følges farvedannelsen i stedet for ved 35 anvendelse af en visuel teknik ved benyttelse af et apparatur, r

O

35

DK 159171 B

der er kendt som en hurtigscanner ("Rapid Scanner"). Dette apparat er et scannings-reflektansspektrofotometer, der er tilsluttet en laboratorie-mikrocomputer. Instrumentet anvendes til hurtig måling af reflektansspektre i det syn-5 lige område. Computeren muliggør oplagring af spektraldata og udfører beregninger. Målinger af ydeevnen af reagensstrimler i hurtigscanneren har eksempelvis de følgende fordele i forhold til visuel iagttagelse af de samme strimler: 1. Lyskilden og betingelserne omkring prøven forbli-10 ver fikserede. Ved visuel iagttagelse kan lyskilden variere, ikke blot med hensyn til bølgelængde, men også i relation til positionen af den strimmel, som iagttages.

2. Detektor-karakteristika forbliver fikserede. Ved visuel iagttagelse kan detektoren, dvs. iagttagerens øjne, 15 variere fra person til person, og med en og samme person fra dag til dag.

3. Hurtigscanneren tillader mere præcis kvantisering af data end visuel iagttagelse, hvorved man opnår at kunne sammenligne resultater på en mere objektiv måde.

20 Rapid-Scanner-instrumentet er konstrueret af Ames

Division af Miles Laboratories, Inc., Elkhart, Indiana, hvorfra fuldstændige informationer med hensyn til strukturelle karakteristika og ydeevne kan fås, jfr. også M.A. Genshaw og R.W. Rogers, Anal. Chem., bind 53, side 1949-1952 (1981).

25 Tri-stimulus-værdier fra hurtigscanneren anvendes til at beregne farvedifferensværdier (AE) ifølge den konvention, der findes i "Supplement No. 2 Commission Internationale de L'Eclairage (Paris, France), Publication No. 15, Colorimetry, (E. -1.3.1), 1971". De opnåede data fra dette instrument er 30 derfor angivet i det følgende som ΔE-værdier eller farvedif ferensenheder .

Teststrimlerne ifølge opfindelsen, der indeholder Fe-HEDTA, testes under anvendelse af den i det foregående beskrevne procedure for deres evne til detektering af hæmoglo-35 binkoncentration på 0,031 mg/dl og 0,062 mg/dl. Nogle af o

DK 159171B

36 strimlerne testes i urinprøver indeholdende 50 mg ascorbat pr. dl, og nogle testes i lignende prøver, der ikke indeholder ascorbat, idet nogle testes efter at være frisk fremstillet ved omgivelsernes temperatur, og nogle testes efter 5 opbevaring ved omgivelsernes temperatur og 50°C i perioder på henholdsvis 11 og 28 dage.

De farvedifferensenheder (ΔΕ) der fås ved hjælp af hurtigscanneren, svarer til forskellige hæmoglobinniveauer.

Når strimlerne indeholdende Pe-HEDTA testes i urinprøver in-10 deholdende 0,031 og 0,062 mg hæmoglobin pr. dl, med eller uden tilstedeværende ascorbat, fås de resultater, der fremgår af de følgende tabeller:

Frisk fremstillede testanordninger 15 Urinprøve Hæmoglobin Ascorbinsyre Hurtigscanningsresultater (aE) (mg/dl)_(mg/dl)_Testanordning_ 0,031 0 21,89 0,031 50 15,75 20 0,062 0 29,78 0,062 50 22,84

Anordninger opbevaret ved omgivelsernes temperatur i 28 dage 25 Urinprøve Hæmoglobin Ascorbinsyre Hurtigscanningsresultater (Δ E) (mg/dl)_(mg/dl)_Testanordning_ 0,031 0 15,50 0,031 50 13,29 30 0,062 0 26,31 0,062 50 18,20 ψ 35

O

37

DK 159171B

Anordninger opbevaret ved 50°C i 11 dage Urinprøve Hæmoglobin Ascorbinsyre Hurtigscanningsresultater (aE) (mg/dl)_(mg/dl)_Testanordning_ 5 0,031 O 20,86 0,031 50 12,36 0,062 O 30,04 0,062 50 27,26 10 Anordninger opbevaret ved 50°C i 28 dage

Urinprøver Hæmoglobin Ascorbinsyre Hurtigscanningsresultater (/SE) (mg/dl)_(mg/dl)_Testanordning_ 0,031 0 10,31 15 0,031 50 7,78 0,062 0 20,86 0,062 50 16,38

De foregående forsøg viser instrument-data, der be-20 kræfter de visuelle data, der fremgår af det foregående. De pågældende data viser stabiliteten af de her omhandlede materialer samt en signifikant ophævelse af ascorbat-interferens i sådanne materialer, selv efter lang tids opbevaring og opbevaring ved forhøjede temperaturer.

25 yderligere visuel afprøvning udføres på et sæt testma terialer, der er fremstillet ifølge opfindelsen som beskrevet i det foregående eksempel 18, dvs. som indeholder Fe-EDTA. Efter fremstilling af materialerne testes disse i urinprøver indeholdende forskellige koncentrationer af hæmoglobin, og i 30 prøver, der ikke indeholder hæmoglobin, samt i prøver med to hæmoglobinniveauer, der også indeholder 50 mg ascorbat pr. dl. Nogle af materialerne testes umiddelbart efter fremstillingen, og nogle testes efter opbevaring i en ovn ved 50°C i 28 dage. Resultaterne af denne afprøvning fremgår af den føl-35 gende tabel, i hvilken tallene svarer til de visuelle farve-

DK 159171B

O

38 værdier, der opnås ved reference til det tidligere omtalte HEMASTIX ®-standard-farvekort. Al afprøvning af disse materialer udføres som beskrevet i det foregående.

5 Stabilitets-ydeevne af teststrimmelanordninger

ifølge opfindelsen indeholdende Fe-EDTA

Hæmoglobin Frisk fremstillede (mg/dl) (ingen strimler ved omgi- Strimler opbevaret ved ascorbinsyre) veIsernes temp. 50°C i 28 dage 0 10 10 10 0,015 12 11 0,031 20 15 0,062 30 22 0,139 35 30 (50 mg/dl 15 ascorbinsyre) 0,031 20 14 0,062 30 22

Resultaterne af disse ovennævnte forsøg bekræfter sta-20 biliteten, undgåelsen af falske positive resultater samt en væsentlig resistens mod ascorbat-inhibering i materialer, der er fremstillet ifølge denne udførelsesform for opfindelsen.

25 30 0 35

Claims (9)

1. Materiale til detektering af nærværelsen af et peroxidativt aktivt stof i en testprøve, hvilket materiale 5 indeholder et organisk hydroperoxid og en indikator, der er i stand til at tilvejebringe et detekterbart respons i nærværelse af det peroxidativt aktive stof og peroxid, kendetegnet ved, at materialet yderligere omfatter et metalchelat af et polycarboxyalkylamin-derivat med den almene 10 formel f r rx 1 [ ?y t j \ e3--i,-RP---ti-rS--ά-R <_,H 1. m ^ \ 15 '' s i hvilken (a) R1 betyder hydrogen eller ligekædede eller forgrenede alkylalkohol- eller alkylcarboxylsyre-grupper med 20 fra 2-3 carbonatomer, R2, R3, Rx og r¥, der er ens eller forskellige, er ligekædede eller forgrenede alkylalkohol-eller alkylcarboxylsyre-grupper med fra 2-3 carbonatomer, idet mindst to af substituenterne R1, R2, R3, Rx eller RY er alkylcarboxylsyre-grupper som defineret ovenfor, 25 (b) RP og R^, der er ens eller forskellige, er lige kædede eller forgrenede alkylengrupper med fra 1-3 carbonatomer eller divalente 1,2-cycloaliphatiske grupper med fra 6-9 carbonatomer, (c) n er et helt tal med en værdi fra 0 til 1, m er 30 et helt tal med en værdi fra 0-2, idet såfremt m er 2, 2 R^-grupper kan være ens eller forskellige, og (d) M betyder Fe+3. DK 159171 B

2. Materiale ifølge krav 1, kendetegnet ved, at (a) m er 0, n er 1, og (b) RP er en ethylengruppe. 5

3. Materiale ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at mindst to af substituenterne R1, R^, R^, Rx og RY er alkylcarboxyl-gruppen -CH2COOH.

4. Materiale ifølge krav 1, kendetegnet ved, ved at metalchelatet er udvalgt fra gruppen bestående af ferrichelater af N-(2-hydroxyethyl)-ethylendiamintried-dikesyre, ethylendiamintetraeddikesyre, cyclohexylendiamin-tetraeddikesyre, nitrilotrieddikesyre, iminodieddikesyre, 15 a-ethylendiamindieddikesyre-dipropionsyre, j3-ethylendiamin-dieddikesyre-dipropionsyre, hydroxylethylaminodieddikesyre og blandinger deraf.

5. Materiale ifølge ethvert af kravene 1-4, k e n -20 detegnet ved, at det organiske hydroperoxid er cu- men-hydroperoxid, og at indikatoren er 3,3',5,5'-tetrameth-ylbenzidin.

6. Testmiddel til bestemmelse af nærværelsen af et 25 peroxidativt aktivt stof i en testprøve, kendetegnet ved, at det omfatter en bærermatrix, hvori der er inkorporeret et materiale ifølge ethvert af kravene 1-5.

7. Fremgangsmåde til fremstilling af et testmiddel 30 til bestemmelse af nærværelsen af et peroxidativt aktivt stof i en testprøve, hvor testmidlet er resistent mod interfererende virkninger af ascorbat, der kan være til stede i prøven, kendetegnet ved, at denne fremgangsmåde omfatter følgende trin: ψ DK 159171B a) fremstilling af en første reagensopløsning indeholdende et organisk hydroperoxid og et metalchelat af et polycarboxyalkylamin-derivat med den almene formel / r η r η Λ 5 ( , f f f ,1 « i R3--i-rP---Jr-Rq--$-R2 V _nL Jm i hvilken 10 (i) R1 betyder hydrogen eller ligekædede eller forgre nede alkylalkohol- eller alkylcarboxylsyre-grupper med fra 2-3 carbonatomer, R2, R3, Rx og RY, der er ens eller forskellige, er ligekædede eller forgrenede alkylalkohol- eller alkylcarboxylsyre-grupper med fra 2-3 carbonatomer, idet 15 mindst to af substituenterne R1, R2, R3, Rx eller R^ er alkylcarboxylsyre-grupper som defineret ovenfor, (ii) RP og R3, der er ens eller forskellige, er ligekædede eller forgrenede alkylengrupper med fra 1-3 carbonatomer eller divalente 1,2-cycloaliphatiske grupper med 20 fra 6-9 carbonatomer, (iii) n er et helt tal med en værdi fra 0 til 1, m er et helt tal med en værdi fra 0 til 2, idet såfremt m er 2, 2 R^-grupper kan være ens eliler forskellige, og (iv) M betyder Fe+3, 25 b) inkorporering af den første reagensopløsning i en bærermatrix ved fugtning af matrixen med den første opløsning, c) tørring af den fugtede matrix til efterladelse af en remanens af metalchelatet og hydroperoxidet, 30 d) fremstilling af en anden reagensopløsning indehol dende en indikator og et opløsningsmiddel, idet indikatoren er i stand til at tilvejebringe et detekterbart respons i nærværelse af et peroxid og det peroxidativt aktive stof, e) inkorporering af den anden reagensopløsning i den 35 tørrede bærermatrix ved fugtning af matrixen med den anden reagensopløsning, og > I DK 159171 B f) tørring af matrixen til efterladelse af en kombineret remanens indeholdende metalchelatet, hydroperoxidet og indikatoren.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendeteg net ved, at der som indikator anvendes benzidin, o-toli-din, en 3,3',5,51-tetra-(lavere alkyl)-benzidin, 2,7-diami-nofluoren eller blandinger deraf.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 7 eller 8, kende tegnet ved, at det organiske hydroperoxid er udvalgt fra gruppen bestående af cumen-hydroperoxid, tert.butyl-hydroperoxid, diisopropylbenzen-hydroperoxid, 2,5-dimethyl-hexan-2,5-dihydroperoxid, paramethan-hydroperoxid og blan-15 dinger deraf.