JP3127160B2 - 被検体を測定するための改善された方法および試薬 - Google Patents
被検体を測定するための改善された方法および試薬Info
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Description
法、およびその方法に有用な試薬組成物に関するもので
ある。より特定的には、この発明は、改善された安定性
を有する試薬、および応答特性または応答曲線変化の動
的幅が増大した試薬に関するものである。
的および定量的な測定にある。特に、血液、血清、尿そ
の他の体液試料の分析に関心が持たれる。種々の被検体
の存在および/または量を測定し、続いて既定のパラメ
ータと比較することによって、疾病または異常状態の診
断が行なわれる。
ばこの分野で、血液、血清、尿その他の試料中のグルコ
ース、コレステロール、クレアチン、サルコシン、尿素
その他の物質の測定について研究されてきた。
検定法がある。検定の1タイプに、一連の反応に基づい
たものがある。最初の反応は被検体とこの被検体に特異
的な酵素との反応である。この反応において、酵素は被
検体を、電子1こを失わせることによって“酸化”す
る。続く反応において、その電子はあるメディエーター
に受容され、すなわちこのメディエーターは還元され
る。さらにこの還元されたメディエーターが種々の指示
薬系で使用されて、被検体の存在および濃度が測定され
る。
許第4929545号に記載されている。この系においては、
被検体から失われた電子によって、フェリシアン化物が
還元されて、フェロシアン化物になる。そのフェロシア
ン化物が鉄(III)化合物と結合して呈色する。変色の
出現およびその度合いが、それぞれ試料中の被検体の存
在および濃度の指標となる。
ができる。光度計は通常、反射率の変化を被検体濃度に
換算するための“ルック−アップ(look−up)”表また
はアルゴリズムを内部に備えた測定器の一部分となって
いる。
ンまたはその類似体を使用している。
ディエーターを使用する別の系が、共通に譲渡された係
属中の米国特許出願USSN 07/451671(1989年12月15日
出願)に記載されている。この系においては、還元され
たメディエーターが電流を通すことによって再酸化さ
れ、一定時間後の電流の減少度を測定して、被検体の濃
度の測定に使用する。
安定性の向上が、常に要求される。安定性は、実用上有
効な保存期間を得るために必要である。米国特許第4949
545号に記載された系においても、光反射率の変化をあ
る幅で測定する他の系におけると同様に、その幅を増大
させることが望まれる。幅が大きくなるほど、測定され
る反射率の変化量が増大し、つまり精度が増大する。
向上が、この発明の一つの目的である。
に応答して変色をする成分を含んでいる試薬の光反射率
の変化の幅を増大させることもまた、この発明の目的で
ある。
ーとともに、検定に使用する前の試薬の安定性を高め、
検定の実施中のメディエーターの還元を事実上妨げない
ような酸化剤を含んでいる試薬組成物によって達成され
る。
された酸化剤がメディエーターの還元に応答して変色を
する成分の光反射率の変化の幅を増大させるという、驚
くべき、また予期しない発見に基づいている。
が、検定の実施中のメディエーターの還元を妨害しない
ような酸化剤であれば、何でもこの発明に使用できる。
米国特許第4949545号に記載された呈色検定において、
メディエーターがフェリシアン化物、指示薬が塩化第二
鉄や硫酸第二鉄のような可溶性の鉄(III)化合物、酵
素がグルコースオキシダーゼまたはコレステロールオキ
シダーゼであるとき、重クロム酸ナトリウムまたはカリ
ウムのような重クロム酸のアルカリ金属塩が本発明の使
用に適していることが、発見された。
使用に好適な試薬は、フェリシアン化カリウム、可溶性
鉄(III)化合物、グルコースオキシダーゼおよびグル
コースオキシダーゼ1kUあたり微量ないし約17.5X10-4g
濃度の重クロム酸カリウムを含むものである。このよう
な試薬は重クロム酸塩を含まない同様な試薬よりも数倍
の安定性を有し、問題の反射率領域の変化の動的幅を増
大させると考えられる。
他の試薬成分中の不純物を酸化するものと思われるが、
安定性の向上に関しての酸化剤の作用機序は完全にはわ
かっていない。酸化剤が、メディエーターを光、熱およ
び湿気による還元作用に対しては安定化するが、被検体
と酵素との反応によって生成する電子による還元作用に
対しては安定化しないこと、そして驚くべきことに、酵
素を全然不活性化しないことも考えられる。
作用機序は、現在のところ完全にはわかっていない。そ
れは観察された作用であっても、例えば好適な実施態様
において、酸化剤は還元されたフェロシアン化物に作用
して、フェロシアン化物と鉄(III)化合物が反応して
プルシアンブルーを生成するのを妨げ、変色の幅を制限
するだろうと予想される。
を改善すること、酵素1kUあたり1.3X10-4gでは加温下で
約12倍安定性を増大させること、そして酵素1kUあたり1
7.5X10-4の量でも発色を妨げずに使用できることがわか
った。
も問題の反射率領域の動的幅を約5%ポイント増大させ
ること、すなわちこの大きさの約10%の増加となること
もわかった。
上有用である。好ましい用途として、Ralph McCroskey
他によりUSSN07/661788(1991年2月27日出願)として
この発明と同日付で出願され、共通に譲渡された係属中
の特許出願に記載されたような検定器具があり、ここで
は試薬が新しい試験片の形態をなしている支持体に塗布
されている。この例においては、試薬層があらかじめ定
められた容量で試薬層に保持される全血と接触する。
説明するが、これらは内容を明らかにするためのもので
あって、これらに限定するものではない。この発明の範
囲にある他の実施態様は、この技術分野の通常の知識を
有する者にとって、容易に想起されるであろう。
験片を調製し、使用した。
3.9g、フェリシアン化塩36gおよびグルコースオキシダ
ーゼ1000kUからなる塗布用物質を調製した。塗布用物質
のその他の不活性成分として、白色顔料TiO2、TWEEN−2
0(非イオン性界面活性剤)、PROPIOFAN−70D(膜形成
剤)およびNATROSOL(増粘剤)を含ませた。この物質の
pHは4.1であった。
を、下記表1aおよび1bに示すように、微量から17.52X10
-4gまでの濃度で添加した。アリコートのいくらかを、
さらに熱ストレス室での分解促進試験に供した。この促
進試験は、通常の保存期間を予知するために、試薬を加
温するものである。
験した。酵素に特異的な被検体を含んでいる液体試料に
接触させる前の試薬の変色は、不安定性および保存期間
の減少を示すものである。種々のアリコートにおける重
クロム酸塩の濃度、試験の持続時間、ストレス室の温度
および重クロム酸塩を添加しないアリコートに対する保
存期間の増大の結果を下記表1aに示す。観察の結果、重
クロム酸塩を微量添加しただけでも有意な改善が見られ
ること、もっと多量ではより長期にわたる安定性の改善
が得られるであろうということが示された。
程度にグルコースを含有する標準溶液の試料に供した。
表1bは、種々のアリコートの重クロム酸塩濃度を示し、
発色が許容されるか妨害されるかを示している。この結
果は、重クロム酸塩はかなり高濃度になるまで、試薬の
発色を妨害しないことを示している。
およびメディエーターの還元型と反応して呈色する指示
薬を含む試薬に対し可溶性の重クロム酸塩を添加する
と、有用な濃度範囲にわたって、酵素を不活性化するこ
とも発色を妨げることもなく、試薬の安定性が改善され
ることを示している。
化の幅が改善されることを示すため、試験片を調製し、
使用した。
1バッチは重クロム酸塩を含まず、他のバッチは酵素1k
Uあたり重クロム酸塩0.9X10-4g含有している。それぞれ
をアリコートに分けて、試験片を構成している透明な担
体層に塗布する。各バッチの試薬より調製した試験片
を、グルコース濃度を変えたグルコース溶液試料に供す
る。そして塗布面の反対側から反射率光度計でこれらの
層を測定した。重クロム酸塩を含む試薬および含まない
試薬についての660nMにおける光反射率の幅を、下記表
2に示す。
率変化の動的幅が5%ポイント増大すること、すなわち
この幅の大きさの約10%の増加となることを示してい
る。
野の当業者がこの発明を実施、使用し、実用上の最適条
件を定め、他の発明および以前の技術との差異を認める
ことができるように、十分明快簡潔に開示された。この
発明の多くの変形および自明な応用はすぐに想起される
ものと考えられるが、それらは下記の請求の範囲に示さ
れる本発明の範囲内に入るものである。
Claims (20)
- 【請求項1】液体試料中に存在する被検体の呈色検定に
使用するための反射率変化の動的幅が増大された試薬組
成物であって、該試料中の被検体に作用する酵素と、該
酵素の被検体への作用に応答して還元され、被検体の存
在または濃度に応じて試薬中で変色を生じる可溶性フェ
リシアン化化合物メディエーターと、該試薬組成物に可
溶性で、酵素1kUあたり約0.9×10-4g〜約17.5×10-4gの
重クロム酸アルカリ金属塩とを含む前記試薬組成物。 - 【請求項2】前記酵素がグルコースオキシダーゼまたは
コレステロールオキシダーゼである、請求項1記載の試
薬組成物。 - 【請求項3】前記酵素がグルコースオキシダーゼであ
り、また前記重クロム酸アルカリ金属塩が重クロム酸ナ
トリウムまたは重クロム酸カリウムである、請求項1記
載の試薬組成物。 - 【請求項4】試料中の被検体の測定に使用するための吸
光度変化の動的幅が改善された組成物であって、 (a)該被検体と特異的に反応する酵素、 (b)該酵素と該検体との間の反応の存在下で還元され
てフェロシアン化化合物に変化する可溶性のフェリシア
ン化化合物、 (c)該フェロシアン化化合物と反応して、被検体の濃
度に比例して試薬組成物の吸光度を変化させ、可視的に
または光学的に検知できる反応生成物を生成する、可溶
性の鉄(III)化合物、 (d)該反応生成物の生成を阻害せず、組成物のpHを約
3.0〜約7.0にする緩衝剤、そして (e)該フェリシアン化化合物の還元を妨害しない濃度
の重クロム酸アルカリ金属塩酸化剤 を含む組成物。 - 【請求項5】前記重クロム酸アルカリ金属塩が重クロム
酸カリウムまたは重クロム酸ナトリウムである、請求項
4記載の組成物。 - 【請求項6】前記酵素がグルコースオキシダーゼかまた
はコレステロールオキシダーゼである、請求項5記載の
組成物。 - 【請求項7】前記酵素がグルコースオキシダーゼであ
り、また前記重クロム酸アルカリ金属塩が酵素1kUあた
り約0.9×10-4g〜約17.5×10-4g濃度の重クロム酸カリ
ウムである、請求項6記載の組成物。 - 【請求項8】担体に塗布された、請求項1または4記載
の組成物。 - 【請求項9】液体試料中の被検体の存在または濃度測定
に使用する、酵素、被検体と酵素との反応に応答して還
元されるフェリシアン化化合物メディエーター、および
メディエーターの還元型と反応して組成物の吸光度をあ
る幅で変化させる反応物を含む組成物の吸光度の動的幅
を改善するための方法であって、酵素1kUあたり約0.9×
10-4g〜約17.5×10-4gの重クロム酸アルカリ金属塩を添
加することによって、吸光度変化の動的幅を増大させる
方法。 - 【請求項10】前記酵素がグルコースオキシダーゼかま
たはコレステロールオキシダーゼである、請求項9記載
の方法。 - 【請求項11】前記重クロム酸アルカリ金属塩が重クロ
ム酸ナトリウムまたは重クロム酸カリウムである、請求
項10記載の方法。 - 【請求項12】前記酵素がグルコースオキシダーゼであ
り、また前記重クロム酸アルカリ金属塩が酵素1kUあた
り約0.9×10-4g〜約17.5×10-4g濃度の重クロム酸カリ
ウムである、請求項11記載の方法。 - 【請求項13】(a)該被検体と特異的に反応する酵
素、(b)該酵素と該被検体との間の反応の存在下で還
元されてフェロシアン化化合物に変化する可溶性のフェ
リシアン化化合物、(c)該フェロシアン化化合物と反
応して、可視的にまたは光学的に検知できる反応生成物
を生成する、可溶性鉄(III)化合物、および(4)該
反応生成物の生成を阻害せず、組成物のpHを約3.0〜7.0
にする緩衝剤、を含む組成物の吸光度の動的幅を改善す
る方法であって、この組成物に、該フェリシアン化化合
物の還元を妨害しない濃度の重クロム酸アルカリ金属塩
酸化剤を添加することからなる方法。 - 【請求項14】前記重クロム酸アルカリ金属塩が重クロ
ム酸カリウムおよび重クロム酸ナトリウムから選択され
たものである、請求項13記載の方法。 - 【請求項15】前記酵素がグルコースオキシダーゼまた
はコレステロールオキシダーゼである、請求項14記載の
方法。 - 【請求項16】前記酵素がグルコースオキシダーゼであ
り、また前記重クロム酸アルカリ金属塩が酵素1kUあた
り約0.9×10-4g〜約17.5×10-4g濃度の重クロム酸カリ
ウムである、請求項15記載の方法。 - 【請求項17】液体試料中の、請求項4記載の組成物の
酵素と反応する被検体を測定する方法であって、液体試
料を請求項4記載の組成物と接触させて、その反応生成
物を被検体の尺度として測定することからなる前記方
法。 - 【請求項18】前記液体試料が体液である、請求項17記
載の方法。 - 【請求項19】前記被検体がグルコースまたはコレステ
ロールである、請求項17記載の方法。 - 【請求項20】(a)支持担体、および(b)支持担体
に塗布した、請求項1または4に記載の組成物を含む試
薬層、からなる、試料中の被検体を測定するのに有効な
分析要素。
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