JP3131924B2 - 検体測定のための改良法及び試薬 - Google Patents
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Description
法に有用な試薬組成物に関するものである。より詳細に
は、本発明は安定性を改良させた試薬、及び応答特性ま
たは応答曲線の変化の動的範囲を増幅させる試薬に関す
るものである。
量測定にある。特に問題なのは、血液、血清、尿その他
の体液試料の分析である。多種多様な検体の存在及び/
又はその量を調べ、ついで確立させたパラメーターと比
較することにより、病態すなわち異常状態の診断を行
う。
ばグルコース、コレステロール、クレアチン、サルコシ
ン、尿素、その他の物質の定量法を研究しているので、
体液試料の定量分析法に関する資料は膨大である。
イプの測定法がある。一つのタイプの測定法は連続反応
を基盤としている。反応の第一段階は、検体とその検体
に特異的に働く酵素間の反応である。この反応で酵素は
検体を「酸化」し、検体に1電子を失わせる。次の反応
で電子はメディエーター(媒体)に受容され、同時にメ
ディエーターは還元される。還元メディエーターはその
後、検体の存在や濃度を調べるために様々なインディケ
ーターシステム(指示薬)の中で利用できる。
に譲渡された米国特許第4,929,545号に記載されてい
る。そのシステムにおいて、フェリシアン化物は検体か
ら失われた電子によってフェロシアン化物に還元され
る。フェロシアン化物は鉄(III)化合物と結合して呈
色する。変色の有無及び程度がそれぞれ、試料中の検体
の存在及び検体濃度の指標となる。
は通常は、反射率の変化を検体濃度へと変換させるため
の内部「ルックアップ(look−up)」表またはアルゴリ
ズムを利用する計器の一部である。
ンまたはその同族体の1つを利用した。
ーターを用いる別のシステムについては、共通に譲渡さ
れた係属中の米国特許出願USSN 07/451,671(1989年12
月15日付)に記載されている。このシステムにおいて還
元されたメディエーターは、電流を流すことにより再酸
化され、そして、一定時間後の電流の減衰が測定され、
検体の濃度測定に利用される。
安定性が向上するのは常に望ましいことである。安定性
は商業上関心のある保存期間を確保するにも必要であ
る。如何なるシステムでも、光反射率の変化はある範囲
にわたって測定されるので、米国特許第4,949,545号に
記載のシステムにおいては、その範囲を増幅させること
は望ましい。範囲を大きくすれば測定される光反射率の
変化量が増大し、その結果精度が向上するのである。
はかることが本発明の目的である。
に応答して変色する成分を含む試薬の光反射率の変化の
範囲を増幅させることもまた、本発明の目的である。
立って試薬の安定性を向上させ、かつ、測定を実施する
間メディエーターの還元を著しくは阻害しない酸化剤及
び被還元性メディエーターを含有する試薬組成物により
達成される。
択された酸化剤がメディエーターの還元に応答して変色
する成分の反射率の変動範囲を増幅させるという、驚嘆
すべきかつ予期せざる発見に基づくものである。
期還元を抑制するが、測定実施中にはメディエーターの
還元を妨害しないような酸化剤ならば、本発明には有用
である。米国特許第4,949,545号に記載の色調をベース
とする測定法において、メディエーターがフェリシアン
化物で、インディケーターが塩化第二鉄か硫酸第二鉄の
ような可溶性の鉄(III)化合物であり、酵素がグルコ
ースオキシダーゼまたはコレステロールオキシダーゼで
ある場合は、重クロム酸ナトリウムや重クロム酸カリウ
ムのような重クロム酸アルカリ金属塩が本発明における
使用に適当であることが見出された。
用できる好ましい試薬には、フェリシアン化カリウム、
可溶性の鉄(III)化合物、グルコースオキシダーゼ及
び、極微量〜約17.5×10-4g/kUグルコースオキシダーゼ
の濃度の重クロム酸カリウムが含まれている。このよう
な試薬は重クロム酸塩を含まない試薬と比較して、何倍
もの安定性を有しており、問題の反射率領域の変化の動
的範囲を増幅させるであろう。
剤がインディケーターの早期変色を起こす可能性がある
ような他の試薬成分中の不純物をも酸化すると考えられ
るが、完全には分かっていない。酸化剤はまた、光線、
熱、及び湿度の還元作用に対してメディエーターを安定
化させるが、検体と酵素間の反応により供給される電子
の還元作用に対してはメディエーターを安定化しないと
考えられている。驚くべきことには、酸化剤は全く酵素
の不活性化には関与しない。
ように作用するかについては、現在のところ十分に分か
っていない。それは観察された作用であるが、好ましい
態様において、例えば、酸化剤は還元されたフェロシア
ン化物に働き、プルシアンブルーを生成するフェロシア
ン化物と鉄(III)化合物間の反応を抑制するが故に、
変色の範囲を制限していると予想される。
と、1.3×10-4g/kU酵素の分量が加温時において約12倍
安定性を増大させること、そして17.5×10-4g/kU酵素の
量まで呈色を妨害することなく使用できることが実験か
ら見出されている。
塩が問題の反射率領域の動的範囲を約5%ポイント、す
なわち、動的範囲の大きさの約10%の増加に相当する分
だけ増幅させることも見出されている。
な商業上の用途を有している。Ralph McCroskeyらによ
りUSSN 07/661,788(1991年2月27日付)として本発明
と同一日付で出願され、共通に譲渡された係属中の特許
出願に記載されるような分析装置での使用が好ましく、
その際試薬は新規なテストストリップ構造の担体上に塗
布されている。その実施態様において、試薬層は予め決
められた量で試薬層に保持される全血と接触する。
するものではない下記の実施例中に説明されている。本
発明の範囲内に含まれる他の態様については、当該技術
の通常の知識を有する者には容易に理解されよう。
本発明の使用を示すためにこれを用いた。コーティング
物質1キログラム当たり30gの4−アミノ酪酸、3.9gの
硫酸第二鉄、36gのフェリシアン化物塩及び1,000kUのグ
ルコースオキシダーゼを含むコーティング物質を調製し
た。当該物質の残部を占める非反応性成分には白色色素
である酸化チタン、Tween−20(非イオン性界面活性
剤)、PROPIOFAN−70D(フィルム形成剤)及びNATROSOL
(増粘剤)が含まれていた。この物質のpHは4.1であっ
た。このコーティング物質のアリコートに、重クロム酸
カリウムを下記の表1a及び1bに示すような、極微量〜1
7.52×10-4gの範囲の濃度で添加した。次に、アリコー
トをいくつか取り、サーマルストレスチャンバーの中で
分解加速試験に供した。この加速試験は通常の保存期間
の予測を目的として、試薬を加温するものである。
た。酵素に特異的な検体を含有する液体試料と接する前
に、試薬が変色するのは不安定性及び保存期間の短縮を
示すものである。種々のアリコート中の重クロム酸塩濃
度、試験期間、ストレスチャンバーの温度、及び重クロ
ム酸塩を含まないアリコートに対する保存期間の延長を
下記の表1aに示す。この結果、重クロム酸塩を極微量で
も添加すれば著しく安定性を向上させることが観察さ
れ、さらに添加量を増やせば一層長期に渡って安定性が
向上するだろう。
のグルコースを含むグルコース含有標準溶液の試験試料
に供した。表1bは種々のアリコートの重クロム酸塩濃度
を示し、また、呈色が許容されるか妨げられるかについ
て示している。その結果、重クロム酸塩はかなりの高濃
度に到るまで試薬の呈色を妨害しないことがわかる。
エーターの還元体と反応し発色させるインディケーター
を含む試薬に対し、可溶性の重クロム酸塩を添加するこ
とにより、使用濃度範囲では酵素の失活を招くことなく
また呈色を抑えることなく、試薬の安定性が向上するこ
とを示している。
薬に添加する際に、反射率変化の範囲が良くなることを
示すためにこれを用いた。
チを用意する。1つのバッチは重クロム酸塩を含まず、
他のバッチは約0.9×10-4gの重クロム酸塩/kU酵素を含
む。各バッチはアリコートに分け、テストストリップの
一部である透明な支持体層上に塗布する。各バッチの試
薬より作成されたテストストリップは種々の濃度のグル
コースを含む試料溶液に供する。ついで、塗布した側の
反対側から反射率光度計でこれらの層の応答を調べる。
重クロム酸塩を含有または含有しない試薬に対する660n
Mの光の反射率の範囲は下記の表2に示されている。
て、反射率変化の動的範囲を5%ポイント、すなわち、
この範囲の大きさの約10%の増加に相当する分だけ増幅
させることを示している。
者が実施し、使用できるように、また、本発明を実施す
るための最良の態様が分かるように、さらに、それを他
の発明や旧式のものから区別できるように、十分簡潔に
かつ明瞭に説明してきた。本発明についての数多くの変
更、及び自明の応用が容易に念頭に浮かぶであろう。こ
れらは以下に請求されるように、本発明の範囲内に入る
ものである。
Claims (16)
- 【請求項1】液体試料中に存在する検体の測定のための
アッセイに有用であり且つ酵素と、その特異的な検体に
対する該酵素の作用に応答して還元される可溶性メディ
エーターとを含有する試薬組成物、の安定性を向上させ
るための組成物であって、該組成物が該試薬組成物に可
溶性の約1.3×10-4g/kU酵素〜約17.5×10-4g/kU酵素の
重クロム酸アルカリ金属塩を含み、該重クロム酸アルカ
リ金属塩は、試料中に存在しうる検体への該酵素の作用
に応答する際該メディエーターとしてのフェリシアン化
化合物の還元を妨害しないが、そうでないときには該フ
ェリシアン化化合物の還元を遅らせる、ことを特徴とす
る前記組成物。 - 【請求項2】前記重クロム酸アルカリ金属塩が重クロム
酸カリウムである、請求項1記載の組成物。 - 【請求項3】前記検体がグルコースであり、また前記酵
素がグルコースオキシダーゼである、請求項1記載の組
成物。 - 【請求項4】前記検体がコレステロールであり、また前
記酵素がコレステロールオキシダーゼである、請求項1
記載の組成物。 - 【請求項5】支持体上に塗布された、請求項1記載の組
成物。 - 【請求項6】液体試料中に存在する検体の測定のための
アッセイに有用であり且つ(a)検体と特異的に反応す
る酵素、(b)該酵素と該検体との間の反応の存在下で
還元され得る可溶性メディエーター、(c)還元された
メディエーターと反応して肉眼的または光学的に検出可
能な反応生成物を形成する可溶性の鉄(III)化合物お
よび(d)反応生成物の形成を妨害せずに組成物のpHを
約3.0〜約6.0とする緩衝剤を含有する試薬組成物、の安
定性を向上させるための組成物であって、該組成物が該
試薬組成物に可溶性の約1.3×10-4g/kU酵素〜約17.5×1
0-4g/kU酵素の重クロム酸アルカリ金属塩を含み、該重
クロム酸アルカリ金属塩は、試料中に存在しうる検体へ
の該酵素の作用に応答する際該メディエーターとしての
フェリシアン化化合物の還元を妨害しないが、そうでな
いときには該フェリシアン化化合物の還元を遅らせる、
ことを特徴とする前記組成物。 - 【請求項7】前記酵素がグルコースオキシダーゼかまた
はコレステロールオキシダーゼである、請求項6記載の
組成物。 - 【請求項8】支持体上に塗布された、請求項6記載の組
成物。 - 【請求項9】(a)検体と特異的に反応する酵素、
(b)該酵素と該検体との間の反応の存在下で還元され
てフェロシアン化化合物を生成させる可溶性フェリシア
ン化化合物、(c)フェリシアン化化合物と反応して肉
眼的または光学的に検出可能な反応生成物を形成する可
溶性の鉄(III)化合物および(d)反応生成物の形成
を妨害せずに組成物のpHを約3.0〜7.0とする緩衝剤を含
有する試薬組成物の安定性を向上させる方法であって、
該試薬組成物に、試料中に存在しうる検体への該酵素の
作用に応答する際該フェリシアン化化合物の還元を妨害
しないが、そうでないときには該フェリシアン化化合物
の還元を遅らせる、該試薬組成物に可溶性の、約1.3×1
0-4g/kU酵素〜約17.5×10-4g/kU酵素の重クロム酸アル
カリ金属塩を加えることからなる、前記方法。 - 【請求項10】前記重クロム酸アルカリ金属塩が重クロ
ム酸カリウムと重クロム酸ナトリウムの群から選択され
る、請求項9記載の方法。 - 【請求項11】前記酵素がグルコースオキシダーゼかま
たはコレステロールオキシダーゼである、請求項9記載
の方法。 - 【請求項12】前記酵素がグルコースオキシダーゼであ
り、また前記重クロム酸アルカリ金属塩が重クロム酸カ
リウムである、請求項9記載の方法。 - 【請求項13】酵素と、その特異的な検体に対する該酵
素の作用に応答して還元される可溶性メディエーター化
合物とを含有する試薬組成物の安定性を向上させるため
の方法であって、該試薬組成物に、試料中に存在しうる
検体への該酵素の作用に応答する際該メディエーターと
してのフェリシアン化化合物の還元を妨害しないが、そ
うでないときには該フェリシアン化化合物の還元を遅ら
せる、該試薬組成物に可溶性の、約1.3×10-4g/kU酵素
〜約17.5×10-4g/kU酵素の重クロム酸アルカリ金属塩を
加えることからなる、前記方法。 - 【請求項14】前記重クロム酸アルカリ金属塩が重クロ
ム酸カリウムと重クロム酸ナトリウムの群から選択され
る、請求項13記載の方法。 - 【請求項15】前記酵素がグルコースオキシダーゼかま
たはコレステロールオキシダーゼである、請求項13記載
の方法。 - 【請求項16】前記酵素がグルコースオキシダーゼであ
り、また前記重クロム酸アルカリ金属塩が重クロム酸カ
リウムである、請求項13記載の方法。
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