JP2005077314A - 比色分析方法およびそれに用いる試薬 - Google Patents
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Abstract
【課題】 分析値に信頼性があって、反応系が単純化された比色分析方法の提供する。
【解決手段】 酸化還元酵素により、分析対象物を酸化させ、その際に、還元性発色剤を還元させて発色させ、その発色の程度を分析することにより前記分析対象物の定性若しくは定量分析を行う。前記発色剤は、メディエータ機能を有するテトラゾリウム塩であって、例えば、ＭＴＴ、Ｎｉｔｒｏ−ＴＢ、ＩＮＴ等を使用する。
この比色分析方法は、メディエータ機能を有するテトラゾリウム塩を使用することで、反応系が単純化し、測定値の信頼性も高い。
【選択図】 なし
【解決手段】 酸化還元酵素により、分析対象物を酸化させ、その際に、還元性発色剤を還元させて発色させ、その発色の程度を分析することにより前記分析対象物の定性若しくは定量分析を行う。前記発色剤は、メディエータ機能を有するテトラゾリウム塩であって、例えば、ＭＴＴ、Ｎｉｔｒｏ−ＴＢ、ＩＮＴ等を使用する。
この比色分析方法は、メディエータ機能を有するテトラゾリウム塩を使用することで、反応系が単純化し、測定値の信頼性も高い。
【選択図】 なし
Description
本発明は、比色分析方法およびそれに使用する試薬に関する。
臨床検査や生化学検査等の分野において、グルコース、コレステロール、尿酸、乳酸等の成分分析が行われており、その一手法として、比色分析がある。例えば、グルコースの比色分析では、まずグルコースオキシダーゼをグルコース(基質)に作用させて、グルコノラクトンおよび過酸化水素を発生させ、その過酸化水素を、ペルオキシダーゼ存在下で、トリンダー試薬等の発色剤により検出するのが一般的である（例えば、特許文献１、非特許文献１参照。）。このように、過酸化水素を介して間接的に基質濃度を測定するという手法は、グルコースに限らず、コレステロール等の他の成分分析にも適用されている。
しかし、従来の比色分析では、次のような問題があった。まず、分析対象物を直接測定するのではなく、過酸化水素を介して、間接的に測定するため、測定に時間がかかる。また、２種類の酵素反応系を同時に安定化する必要があり、条件設定が難しい。そして、酸素を必要とするため、酸素が不十分であると、反応が十分におこらないという問題もあった。
そこで、最近では、酸化還元酵素により、分析対象物からメディエータを介して、還元により発色する発色剤に電子を伝達し、その結果生じる前記発色剤の発色を測定する方法が採用されるようになった（例えば、特許文献２、特許文献３参照。）。前記発色剤としては、テトラゾリウム塩が汎用されている。
しかしながら、酵素と発色剤との間にメディエータを介した場合、酵素−メディエータ間とメディエータ−発色剤間とでは、各々の反応条件、例えば、ｐＨ等が異なるため、反応系の設計が難しいという問題があった。さらに、酵素−メディエータ間とメディエータ−発色剤間との組み合わせによっては、全く反応しないことや、凝集するという問題もあった。
特開平５−３７９９号公報
特許第２８２５７５４号明細書
特許第３００１３６８号明細書
K.Tamaoku、「Anal. chim. Acta.」、1982、136、p121-127
したがって、本発明は、分析値に信頼性があり、反応系が単純化された比色分析方法の提供を目的とする。
前記目的を達成するために、本発明の比色分析方法は、酸化還元酵素により、分析対象物を酸化させ、その際に、還元性発色剤を還元させることで発色させ、その発色の程度を分析することにより、前記分析対象物の定性若しくは定量分析を行う比色分析方法であって、前記発色剤が、メディエータ機能を有するテトラゾリウム塩である方法である。さらに、本発明の試薬は、前記比色分析方法に使用する試薬であって、メディエータ機能を有するテトラゾリウム塩を含む試薬である。
このように、本発明では、発色剤としてメディエータ機能を有するテトラゾリウム塩を使用するため、別途メディエータを使用する必要がなく、反応系を酵素と発色剤との間のみの一つにすることができる。この結果、本発明によれば、メディエータを使用した場合の従来の問題が解決され、しかも、得られる分析値は信頼性が高い。
本発明の比色分析方法および試薬において、前記テトラゾリウム塩としては、例えば、ニトロフェニル基、チアゾリル基およびベンゾチアゾリル基の少なくとも一つの基を有するものが好ましい。前記テトラゾリウム塩としては、例えば、3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide(MTT)、2-(4-Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-phenyl-2H-tetrazolium chloride(INT)、3,3'-[3,3'-Dimethoxy-(1,1'-biphenyl)-4,4'-diyl]-bis[2-(4-nitrophenyl)-5-phenyl-2H-tetrazolium chloride](Nitro-TB)、2-(4-Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium, monosodium salt(WST-1)、2-(4-Iodophenyl)-3-(2,4-dinitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium, monosodium salt(WST-3)、2-benzothiazolyl-3-(4-carboxy-2-methoxyphenyl)-5-[4-(2-sulfoethylcarbamoyl)phenyl]-2H-tetrazolium(WST-4)、2,2'-dibenzothiazolyl-5,5'-bis[4-di(2-sulfophenyl)carbamoylphenyl]-3,3'-(3,3'-dimethoxy-4,4'-biphenylene)ditetrazolium disodium salt(WST-5)、2-(2-Methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium, monosodium salt(WST-8)、2,3-Bis(4-nitrophenyl)-5-phenyltetrazolium Chloride、2-(2-Benzothiazolyl)-3,5-dophenyltetrazolium Bromide、2-(2-Benzothiazolyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-phenyltetrazolium Bromide、2,3-Di(4-nitrophenyl)tetrazolium Perchlorate、3-(3-Nitrophenyl)-5-methyl-2-phenyltetrazolium Chloride、3-(4-Nitrophenyl)-5-methyl-2-phenyltetrazolium Chloride等がある。
本発明の比色分析方法および試薬において、分析対象物としては、例えば、グルコース、コレステロール、乳酸、尿酸、ピルビン酸、クレアチン、クレアチニン等が好ましく、この場合の好ましい酸化還元酵素は、前記各分析対象物に対応する脱水素酵素若しくは酸化酵素である。前記酸化還元酵素としては、例えば、グルコースデヒドロゲナーゼ、グルコースオキシダーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ、コレステロールオキシダーゼ、乳酸脱水素酵素、ウリカーゼ等がある。
つぎに、本発明の試験片は、前記本発明の試薬を含む試験片である。
本発明の試験片において、テトラゾリウム塩、分析対象物および酸化還元酵素は、前述のとおりである。
本発明の試験片において、前記試薬に加え、さらに無機ゲルを含むことが好ましい。無機ゲルを添加することで、例えば、より均一で安定な発色を得ることができる。
前記無機ゲルとしては、例えば、ペントナイト、スメクタイト、バーミキュラライト、合成フッ素雲母等があげられ、その中でも、スメクタイトが好ましい。
つぎに、本発明の比色分析方法を試験片に適用した例について、発色剤としてＭＴＴを使用し、分析対象物としてグルコースを使用した場合を例にとり説明する。なお、コレステロール等のその他の成分分析は、それに応じて酸化還元酵素を変える以外は、基本的に同様である。
まず、ＭＴＴ、グルコースデヒドロゲナーゼ(ＧＤＨ)、バインダー等の添加剤（任意成分）をバッファー液に溶解して試薬液とする。なお、水に溶解してもよいが、バッファー液に溶解するのが好ましい。
前記ＭＴＴの濃度は、特に制限されない。前記ＧＤＨの濃度は、例えば、５００〜５０００Ｕ／ｍｌの範囲であって、好ましくは１０００〜３０００Ｕ／ｍｌである。
前記バッファー液としては、例えば、リン酸バッファー、グッドバッファー等が使用できる。前記バッファー液のｐＨは、例えば、ｐＨ６〜８の範囲であって、好ましくはｐＨ６．５〜７．５である。また、前記バッファー液の濃度は、例えば、１０〜２００ｍＭの範囲であって、好ましくは５０〜１００ｍＭである。
前記バインダーとしては、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリアクリルアミド、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）等があげられ、その中でも、ＨＰＣが好ましい。前記バインダーの濃度は、例えば、０.５〜５重量％の範囲である。
そして、前記試薬液をろ紙製若しくは樹脂製の多孔質シートに含浸させ、その後乾燥させることにより、グルコース分析用試験片が作成できる。前記樹脂の材質としては、例えば、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリカーボネート、ポリビニルアルコール、ポリテトラフルオロエチレン（テフロン(登録商標)）、ポリイミド、ポリ塩化ビニル等があげられ、その中でも、ポリスルホンが好ましい。
また、前記多孔質シートは、口径が厚み方向またはシート面方向にしたがい変化する非対称多孔質シートでもよい。
なお、前記試薬液含浸に先立ち、無機ゲル溶液を前記多孔質シートに含浸させ、乾燥させることが好ましい。
前記無機ゲル溶液全体に対する前記無機ゲルの濃度は、例えば、１〜５重量％の範囲であって、好ましくは１〜３重量％、より好ましくは１．５〜２重量％である。
前記無機ゲル溶液には、例えば、3-［（3-Cholamidopropyl）dimethylammonio］-1-propanesulfonate(商品名ＣＨＡＰＳ：同仁化学社製)、Octanoyl-N-methylglucamide（商品名ＭＥＧＡ−８：同仁化学社製）等の界面活性剤を含有させてもよい。前記無機ゲル溶液全体に対する前記界面活性剤の濃度は、例えば、０．１〜２．０重量％の範囲であって、好ましくは０．１〜１．０重量％、より好ましくは０．２〜０．５重量％である。
前記無機ゲル溶液の前記多孔質シートに対する含浸量は、多孔質シートの空隙体積基準で、例えば、１〜５０ｍｇ／ｃｍ3の範囲であって、好ましくは１０〜３０ｍｇ／ｃｍ3、より好ましくは１５〜２０ｍｇ／ｃｍ3である。
この試験片に、血液等のグルコースを含む試料を点着すると、グルコースがＧＤＨにより還元される。その結果、ＭＴＴに電子が伝達され、ホルマザンを生じる。このホルマザンの発色の程度を測定することにより、グルコースの定性若しくは定量分析が可能となる。また、分析に必要な時間は、試料点着後、例えば、３０〜４０秒である。この発色の程度を、目視で確認してもよいし、反射率計等を用いて測定してもよい。前記試料の添加量は、例えば、１〜１０μｌの範囲であって、好ましくは１〜５μｌ、より好ましくは２〜３μｌである。反応温度は、例えば、１０℃〜３７℃の範囲であって、好ましくは１５℃〜３７℃、より好ましくは２５℃〜３０℃である。
つぎに、本発明の比色分析方法を液系分析に適用した例について、発色剤としてＭＴＴを使用し、分析対象としてグルコースを試用した場合を例にとり説明する。なお、コレステロール等のその他の成分分析は、それに応じて酸化還元酵素を変える以外は、基本的に同様である。
まず、ＭＴＴ、ＧＤＨ、界面活性剤（任意成分）をバッファー液に溶解して試薬液とする。なお、水に溶解してもよいが、バッファー液に溶解するのが好ましい。
前記バッファー、その濃度およびそのｐＨ、ならびに前記ＭＴＴの濃度は、前述の試験片の場合と同様である。
前記ＧＤＨの濃度は、例えば、１０〜１０００Ｕ／ｍｌの範囲であって、好ましくは５０〜５００Ｕ／ｍｌであって、より好ましくは１００〜２００Ｕ／ｍｌである。
前記界面活性剤としては、例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（１０）Ｏｃｔｙｌｐｈｅｎｙｌ Ｅｔｈｅｒ）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−４０５、3-［（3-Cholamidopropyl）dimethylammonio］-1-propanesulfonate(商品名ＣＨＡＰＳ：同仁化学社製)、Octanoyl-N-methylglucamide（商品名ＭＥＧＡ−８：同仁化学社製）、スクロースモノラウレート（同仁化学社製）等がある。この中で好ましいものは、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−４０５、スクロースモノラウレート（同仁化学社製）である。
前記界面活性剤の濃度は、前述の試験片の場合と同様である。
前記試薬液に、血液等のグルコースを含む試料を添加すると、前述の試験片の場合と同様の反応がおこる。この発色の程度を測定することにより、グルコースの定性若しくは定量分析が可能となる。また、分析に必要な時間は、試料添加後、例えば、５〜３０秒である。この変化は目視で確認してもよいし、分光光度計等の光学系測定装置を用いて測定してもよい。前記試料の添加量は、例えば、１〜１００μｌ、好ましくは３〜１０μｌ、より好ましくは５〜１０μｌである。反応温度は、例えば、１０℃〜３７℃の範囲であって、好ましくは１５℃〜３５℃、より好ましくは２５℃〜３０℃である。
つぎに、本発明の実施例について説明する。なお、下記において、ＰＱＱとはピロロキノリンキノンを示し、その他の試薬の詳細は以下のとおりである。
（実施例１）
下記組成の反応試薬液をそれぞれ調製した。前記それぞれの試薬液を５００μｌずつ、光路長１０ｍｍのマイクロセル（材質・ポリメタクリレート）に入れ、分光光度計（日本分光社製Ｖ−５５０型）にて波長４００ｎｍ〜９００ｎｍの吸収スペクトルを測定し、これをブランク（酸化型）とした。このセル中に３０ｍＭグルコース水溶液を１０μｌ添加して、室温下で撹拌し、添加１分後に、色調変化後の吸収スペクトルを測定した。この結果を図１のグラフに示す。図示したように、酵素反応によりＭＴＴは還元され、５６０ｎｍ付近に発色が確認された。
下記組成の反応試薬液をそれぞれ調製した。前記それぞれの試薬液を５００μｌずつ、光路長１０ｍｍのマイクロセル（材質・ポリメタクリレート）に入れ、分光光度計（日本分光社製Ｖ−５５０型）にて波長４００ｎｍ〜９００ｎｍの吸収スペクトルを測定し、これをブランク（酸化型）とした。このセル中に３０ｍＭグルコース水溶液を１０μｌ添加して、室温下で撹拌し、添加１分後に、色調変化後の吸収スペクトルを測定した。この結果を図１のグラフに示す。図示したように、酵素反応によりＭＴＴは還元され、５６０ｎｍ付近に発色が確認された。
（反応試薬液組成Ａ）
ＭＴＴ ２ｍＭ
（反応試薬液組成Ｂ）
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０） ５０ｍＭ
ＰＱＱ−ＧＤＨ ５０Ｕ／ｍｌ
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ０．５重量％
ＭＴＴ ２ｍＭ
（反応試薬液組成Ｂ）
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０） ５０ｍＭ
ＰＱＱ−ＧＤＨ ５０Ｕ／ｍｌ
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ０．５重量％
（実施例２）
下記組成の反応試薬液をそれぞれ調製した。前記試薬液をそれぞれ５００μｌずつ、光路長１０ｍｍのマイクロセル（材質・ポリメタクリレート）に入れ、分光光度計（日本分光社製Ｖ−５５０型）にて波長４００ｎｍ〜９００ｎｍの吸収スペクトルを測定し、これをブランク（酸化型）とした。このセル中に３０ｍＭグルコース水溶液を１０μｌ添加して、室温下で撹拌し、添加１分後に、色調変化後の吸収スペクトルを測定した。この結果を図２のグラフに示す。図示したように、酵素反応によりＮｉｔｒｏ−ＴＢは還元され、５３０ｎｍ付近に発色が確認された。
下記組成の反応試薬液をそれぞれ調製した。前記試薬液をそれぞれ５００μｌずつ、光路長１０ｍｍのマイクロセル（材質・ポリメタクリレート）に入れ、分光光度計（日本分光社製Ｖ−５５０型）にて波長４００ｎｍ〜９００ｎｍの吸収スペクトルを測定し、これをブランク（酸化型）とした。このセル中に３０ｍＭグルコース水溶液を１０μｌ添加して、室温下で撹拌し、添加１分後に、色調変化後の吸収スペクトルを測定した。この結果を図２のグラフに示す。図示したように、酵素反応によりＮｉｔｒｏ−ＴＢは還元され、５３０ｎｍ付近に発色が確認された。
（反応試薬液組成Ａ）
Ｎｉｔｒｏ−ＴＢ ２ｍＭ
（反応試薬液組成Ｂ）
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０） ５０ｍＭ
ＰＱＱ−ＧＤＨ ５０Ｕ／ｍｌ
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ０．５重量％
Ｎｉｔｒｏ−ＴＢ ２ｍＭ
（反応試薬液組成Ｂ）
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０） ５０ｍＭ
ＰＱＱ−ＧＤＨ ５０Ｕ／ｍｌ
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ０．５重量％
（実施例３）
下記組成の反応試薬液をそれぞれ調製した。前記試薬液をそれぞれ５００μｌずつ、光路長１０ｍｍのマイクロセル（材質・ポリメタクリレート）に入れ、分光光度計（日本分光社製Ｖ−５５０型）にて波長４００ｎｍ〜９００ｎｍの吸収スペクトルを測定し、これをブランク（酸化型）とした。このセル中に３０ｍＭグルコース水溶液を１０μｌ添加して、室温下で撹拌し、添加１分後に、色調変化後の吸収スペクトルを測定した。この結果を図３のグラフに示す。図示したように、酵素反応によりＩＮＴは還元され、４９０ｎｍ付近に発色が確認された。
下記組成の反応試薬液をそれぞれ調製した。前記試薬液をそれぞれ５００μｌずつ、光路長１０ｍｍのマイクロセル（材質・ポリメタクリレート）に入れ、分光光度計（日本分光社製Ｖ−５５０型）にて波長４００ｎｍ〜９００ｎｍの吸収スペクトルを測定し、これをブランク（酸化型）とした。このセル中に３０ｍＭグルコース水溶液を１０μｌ添加して、室温下で撹拌し、添加１分後に、色調変化後の吸収スペクトルを測定した。この結果を図３のグラフに示す。図示したように、酵素反応によりＩＮＴは還元され、４９０ｎｍ付近に発色が確認された。
（反応試薬液組成Ａ）
ＩＮＴ ２ｍＭ
（反応試薬液組成Ｂ）
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０） ５０ｍＭ
ＰＱＱ−ＧＤＨ ５０Ｕ／ｍｌ
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ０．５重量％
ＩＮＴ ２ｍＭ
（反応試薬液組成Ｂ）
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０） ５０ｍＭ
ＰＱＱ−ＧＤＨ ５０Ｕ／ｍｌ
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ０．５重量％
（実施例４）
下記組成の反応試薬液をそれぞれ調製した。前記試薬液をそれぞれ５００μｌずつ、光路長１０ｍｍのマイクロセル（材質・ポリメタクリレート）に入れ、分光光度計（日本分光社製Ｖ−５５０型）にて波長４００ｎｍ〜９００ｎｍの吸収スペクトルを測定し、これをブランク（酸化型）とした。このセル中に３０ｍＭグルコース水溶液を１０μｌ添加して、室温下で撹拌し、添加１分後に、色調変化後の吸収スペクトルを測定した。この結果を図４のグラフに示す。図示したように、酵素反応によりＢ１０４７は還元され、５３０ｎｍ付近に発色が確認された。
下記組成の反応試薬液をそれぞれ調製した。前記試薬液をそれぞれ５００μｌずつ、光路長１０ｍｍのマイクロセル（材質・ポリメタクリレート）に入れ、分光光度計（日本分光社製Ｖ−５５０型）にて波長４００ｎｍ〜９００ｎｍの吸収スペクトルを測定し、これをブランク（酸化型）とした。このセル中に３０ｍＭグルコース水溶液を１０μｌ添加して、室温下で撹拌し、添加１分後に、色調変化後の吸収スペクトルを測定した。この結果を図４のグラフに示す。図示したように、酵素反応によりＢ１０４７は還元され、５３０ｎｍ付近に発色が確認された。
（反応試薬液組成Ａ）
Ｂ１０４７ ２ｍＭ
（反応試薬液組成Ｂ）
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０） ５０ｍＭ
ＰＱＱ−ＧＤＨ ５０Ｕ／ｍｌ
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ０．５重量％
Ｂ１０４７ ２ｍＭ
（反応試薬液組成Ｂ）
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０） ５０ｍＭ
ＰＱＱ−ＧＤＨ ５０Ｕ／ｍｌ
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ０．５重量％
（実施例５）
下記組成の反応試薬液をそれぞれ調製した。前記試薬液をそれぞれ５００μｌずつ、光路長１０ｍｍのマイクロセル（材質・ポリメタクリレート）に入れ、分光光度計（日本分光社製Ｖ−５５０型）にて波長４００ｎｍ〜９００ｎｍの吸収スペクトルを測定し、これをブランク（酸化型）とした。このセル中に３０ｍＭグルコース水溶液を１０μｌ添加して、室温下で撹拌し、添加１分後に、色調変化後の吸収スペクトルを測定した。この結果を図５のグラフに示す。図示したように、酵素反応によりＢ０３３３は還元され、５００〜６００ｎｍ付近に発色が確認された。
下記組成の反応試薬液をそれぞれ調製した。前記試薬液をそれぞれ５００μｌずつ、光路長１０ｍｍのマイクロセル（材質・ポリメタクリレート）に入れ、分光光度計（日本分光社製Ｖ−５５０型）にて波長４００ｎｍ〜９００ｎｍの吸収スペクトルを測定し、これをブランク（酸化型）とした。このセル中に３０ｍＭグルコース水溶液を１０μｌ添加して、室温下で撹拌し、添加１分後に、色調変化後の吸収スペクトルを測定した。この結果を図５のグラフに示す。図示したように、酵素反応によりＢ０３３３は還元され、５００〜６００ｎｍ付近に発色が確認された。
（反応試薬液組成Ａ）
Ｂ０３３３ ２ｍＭ
（反応試薬液組成Ｂ）
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０） ５０ｍＭ
ＰＱＱ−ＧＤＨ ５０Ｕ／ｍｌ
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ０．５重量％
Ｂ０３３３ ２ｍＭ
（反応試薬液組成Ｂ）
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０） ５０ｍＭ
ＰＱＱ−ＧＤＨ ５０Ｕ／ｍｌ
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ０．５重量％
（実施例６）
下記組成の反応試薬液をそれぞれ調製した。前記試薬液をそれぞれ５００μｌずつ、光路長１０ｍｍのマイクロセル（材質・ポリメタクリレート）に入れ、分光光度計（日本分光社製Ｖ−５５０型）にて波長４００ｎｍ〜９００ｎｍの吸収スペクトルを測定し、これをブランク（酸化型）とした。このセル中に３０ｍＭグルコース水溶液を１０μｌ添加して、室温下で撹拌し、添加１分後に、色調変化後の吸収スペクトルを測定した。この結果を図６のグラフに示す。図示したように、酵素反応によりＢ０２８９は還元され、４６０ｎｍ付近に発色が確認された。
下記組成の反応試薬液をそれぞれ調製した。前記試薬液をそれぞれ５００μｌずつ、光路長１０ｍｍのマイクロセル（材質・ポリメタクリレート）に入れ、分光光度計（日本分光社製Ｖ−５５０型）にて波長４００ｎｍ〜９００ｎｍの吸収スペクトルを測定し、これをブランク（酸化型）とした。このセル中に３０ｍＭグルコース水溶液を１０μｌ添加して、室温下で撹拌し、添加１分後に、色調変化後の吸収スペクトルを測定した。この結果を図６のグラフに示す。図示したように、酵素反応によりＢ０２８９は還元され、４６０ｎｍ付近に発色が確認された。
（反応試薬液組成Ａ）
Ｂ０２８９ ２ｍＭ
（反応試薬液組成Ｂ）
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０） ５０ｍＭ
ＰＱＱ−ＧＤＨ ５０Ｕ／ｍｌ
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ０．５重量％
Ｂ０２８９ ２ｍＭ
（反応試薬液組成Ｂ）
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０） ５０ｍＭ
ＰＱＱ−ＧＤＨ ５０Ｕ／ｍｌ
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ０．５重量％
（実施例７）
下記組成の反応試薬液をそれぞれ調製した。前記試薬液をそれぞれ５００μｌずつ、光路長１０ｍｍのマイクロセル（材質・ポリメタクリレート）に入れ、分光光度計（日本分光社製Ｖ−５５０型）にて波長４００ｎｍ〜９００ｎｍの吸収スペクトルを測定し、これをブランク（酸化型）とした。このセル中に３０ｍＭグルコース水溶液を１０μｌ添加して、室温下で撹拌し、添加１分後に、色調変化後の吸収スペクトルを測定した。この結果を図７のグラフに示す。図示したように、酵素反応によりＷＳＴ−３は還元され、４００〜５００ｎｍ付近に発色が確認された。
下記組成の反応試薬液をそれぞれ調製した。前記試薬液をそれぞれ５００μｌずつ、光路長１０ｍｍのマイクロセル（材質・ポリメタクリレート）に入れ、分光光度計（日本分光社製Ｖ−５５０型）にて波長４００ｎｍ〜９００ｎｍの吸収スペクトルを測定し、これをブランク（酸化型）とした。このセル中に３０ｍＭグルコース水溶液を１０μｌ添加して、室温下で撹拌し、添加１分後に、色調変化後の吸収スペクトルを測定した。この結果を図７のグラフに示す。図示したように、酵素反応によりＷＳＴ−３は還元され、４００〜５００ｎｍ付近に発色が確認された。
（反応試薬液組成Ａ）
ＷＳＴ−３ ２ｍＭ
（反応試薬液組成Ｂ）
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０） ５０ｍＭ
ＰＱＱ−ＧＤＨ ５０Ｕ／ｍｌ
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ０．５重量％
ＷＳＴ−３ ２ｍＭ
（反応試薬液組成Ｂ）
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０） ５０ｍＭ
ＰＱＱ−ＧＤＨ ５０Ｕ／ｍｌ
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ０．５重量％
（実施例８）
下記組成の反応試薬液をそれぞれ調製した。前記試薬液をそれぞれ５００μｌずつ、光路長１０ｍｍのマイクロセル（材質・ポリメタクリレート）に入れ、分光光度計（日本分光社製Ｖ−５５０型）にて波長４００ｎｍ〜９００ｎｍの吸収スペクトルを測定し、これをブランク（酸化型）とした。このセル中に３０ｍＭグルコース水溶液を１０μｌ添加して、室温下で撹拌し、添加１分後に、色調変化後の吸収スペクトルを測定した。この結果を図８のグラフに示す。図示したように、酵素反応によりＷＳＴ−４は還元され４５０〜６５０ｎｍ付近に発色が確認された。
下記組成の反応試薬液をそれぞれ調製した。前記試薬液をそれぞれ５００μｌずつ、光路長１０ｍｍのマイクロセル（材質・ポリメタクリレート）に入れ、分光光度計（日本分光社製Ｖ−５５０型）にて波長４００ｎｍ〜９００ｎｍの吸収スペクトルを測定し、これをブランク（酸化型）とした。このセル中に３０ｍＭグルコース水溶液を１０μｌ添加して、室温下で撹拌し、添加１分後に、色調変化後の吸収スペクトルを測定した。この結果を図８のグラフに示す。図示したように、酵素反応によりＷＳＴ−４は還元され４５０〜６５０ｎｍ付近に発色が確認された。
（反応試薬液組成Ａ）
ＷＳＴ−４ ２ｍＭ
（反応試薬液組成Ｂ）
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０） ５０ｍＭ
ＰＱＱ−ＧＤＨ ５０Ｕ／ｍｌ
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ０．５重量％
ＷＳＴ−４ ２ｍＭ
（反応試薬液組成Ｂ）
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０） ５０ｍＭ
ＰＱＱ−ＧＤＨ ５０Ｕ／ｍｌ
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ０．５重量％
（実施例９）
下記組成の反応試薬液をそれぞれ調製した。前記試薬液をそれぞれ５００μｌずつ、光路長１０ｍｍのマイクロセル（材質・ポリメタクリレート）に入れ、分光光度計（日本分光社製Ｖ−５５０型）にて波長４００ｎｍ〜９００ｎｍの吸収スペクトルを測定し、これをブランク（酸化型）とした。このセル中に３０ｍＭグルコース水溶液を１０μｌ添加して、室温下で撹拌し、添加１分後に、色調変化後の吸収スペクトルを測定した。この結果を図９のグラフに示す。図示したように、酵素反応によりＷＳＴ−８は還元され、４６０ｎｍ付近に発色が確認された。
下記組成の反応試薬液をそれぞれ調製した。前記試薬液をそれぞれ５００μｌずつ、光路長１０ｍｍのマイクロセル（材質・ポリメタクリレート）に入れ、分光光度計（日本分光社製Ｖ−５５０型）にて波長４００ｎｍ〜９００ｎｍの吸収スペクトルを測定し、これをブランク（酸化型）とした。このセル中に３０ｍＭグルコース水溶液を１０μｌ添加して、室温下で撹拌し、添加１分後に、色調変化後の吸収スペクトルを測定した。この結果を図９のグラフに示す。図示したように、酵素反応によりＷＳＴ−８は還元され、４６０ｎｍ付近に発色が確認された。
（反応試薬液組成Ａ）
ＷＳＴ−８ ２ｍＭ
（反応試薬液組成Ｂ）
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０） ５０ｍＭ
ＰＱＱ−ＧＤＨ ５０Ｕ／ｍｌ
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ０．５重量％
ＷＳＴ−８ ２ｍＭ
（反応試薬液組成Ｂ）
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０） ５０ｍＭ
ＰＱＱ−ＧＤＨ ５０Ｕ／ｍｌ
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ０．５重量％
（実施例１０）
下記組成の反応試薬液を調製し、多孔質膜（商品名ザビーナ：ユニチカ社製、布製）に含浸させて、乾燥させた。乾燥後、この多孔質膜を約７×５ｍｍ角に成形し、両面テープにて支持体（透明ＰＥＴ）に貼り付け、試験片とした。この試験片を反射率測定器（アークレイ社製造アミチェックメーター改造品）にセットし、下記方法で調製した種々の濃度のグルコース標準血清（０ｍｇ／ｄｌ、２００ｍｇ／ｄｌ、４００ｍｇ／ｄｌ、６００ｍｇ／ｄｌ）を３μｌ点着した。点着後４０秒間、室温下で、前記反射率測定器により波長６６０ｎｍでの反射率を測定し、Ｋ／Ｓを求めた。Ｋ／Ｓとは、光の吸収・散乱による光の減衰比率であり、下記数式により表される。下記数式において、Ｋは光の吸収係数を、Ｓは光の散乱係数を、Ｒλは分光計で測定した可視光の反射率を示す。
Ｋ／Ｓ＝（１−Ｒλ）2／２Ｒλ
得られたＫ／Ｓの時間変化を図１２のグラフに示す。
下記組成の反応試薬液を調製し、多孔質膜（商品名ザビーナ：ユニチカ社製、布製）に含浸させて、乾燥させた。乾燥後、この多孔質膜を約７×５ｍｍ角に成形し、両面テープにて支持体（透明ＰＥＴ）に貼り付け、試験片とした。この試験片を反射率測定器（アークレイ社製造アミチェックメーター改造品）にセットし、下記方法で調製した種々の濃度のグルコース標準血清（０ｍｇ／ｄｌ、２００ｍｇ／ｄｌ、４００ｍｇ／ｄｌ、６００ｍｇ／ｄｌ）を３μｌ点着した。点着後４０秒間、室温下で、前記反射率測定器により波長６６０ｎｍでの反射率を測定し、Ｋ／Ｓを求めた。Ｋ／Ｓとは、光の吸収・散乱による光の減衰比率であり、下記数式により表される。下記数式において、Ｋは光の吸収係数を、Ｓは光の散乱係数を、Ｒλは分光計で測定した可視光の反射率を示す。
Ｋ／Ｓ＝（１−Ｒλ）2／２Ｒλ
得られたＫ／Ｓの時間変化を図１２のグラフに示す。
（反応試薬液組成)
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０） ５０ｍＭ
ＰＱＱ−ＧＤＨ １０００Ｕ／ｍｌ
Ｂ１０４７ ３０ｍＭ
ＭＥＧＡ−８ １重量％
アクリルアミド（ポリマー）（ナカライテスク社製） ０．５重量％
ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ社製） １重量％
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０） ５０ｍＭ
ＰＱＱ−ＧＤＨ １０００Ｕ／ｍｌ
Ｂ１０４７ ３０ｍＭ
ＭＥＧＡ−８ １重量％
アクリルアミド（ポリマー）（ナカライテスク社製） ０．５重量％
ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ社製） １重量％
（グルコース標準血清の調製方法）
全血を３７℃でインキュベートして、血中のグルコース濃度を０ｍｇ／ｄｌとした。それを遠心分離（３０００ｒｐｍ×１０分間）して、その上清（血漿）を得た。グルコース濃度が２００、４００、６００ｍｇ／ｄｌになるように、得られた血漿にグルコース（ナカライテスク社製）を添加した。
全血を３７℃でインキュベートして、血中のグルコース濃度を０ｍｇ／ｄｌとした。それを遠心分離（３０００ｒｐｍ×１０分間）して、その上清（血漿）を得た。グルコース濃度が２００、４００、６００ｍｇ／ｄｌになるように、得られた血漿にグルコース（ナカライテスク社製）を添加した。
（比較例１）
下記組成の反応試薬液をそれぞれ調製した。光路長１０ｍｍのマイクロセル（材質・ポリメタクリレート）に、下記組成Ａ１の試薬液および精製水をそれぞれ２５０μｌずつ、ついで下記組成Ｂの試薬を５００μｌ入れ、さらに、３０ｍＭグルコース水溶液を１０μｌ添加して、室温下で撹拌した。添加１分後に、分光光度計（日本分光社製Ｖ−５５０型）にて波長４００ｎｍ〜９００ｎｍの吸収スペクトルを測定した。この結果を図１１のグラフに、「メディエータなし」として示す。
下記組成の反応試薬液をそれぞれ調製した。光路長１０ｍｍのマイクロセル（材質・ポリメタクリレート）に、下記組成Ａ１の試薬液および精製水をそれぞれ２５０μｌずつ、ついで下記組成Ｂの試薬を５００μｌ入れ、さらに、３０ｍＭグルコース水溶液を１０μｌ添加して、室温下で撹拌した。添加１分後に、分光光度計（日本分光社製Ｖ−５５０型）にて波長４００ｎｍ〜９００ｎｍの吸収スペクトルを測定した。この結果を図１１のグラフに、「メディエータなし」として示す。
つぎに、別の光路長１０ｍｍのマイクロセル（材質・ポリメタクリレート）に、下記組成Ａ１の試薬液を２５０μｌ、さらにメディエータとして下記組成Ａ２の試薬液を２５０μｌ加え、ついで下記組成Ｂの試薬液を５００μｌ加えた後、３０ｍＭグルコース水溶液を１０μｌ添加して、室温下で撹拌した。添加１分後に、分光光度計（日本分光社製Ｖ−５５０型）にて波長４００ｎｍ〜９００ｎｍの吸収スペクトルを測定した。この結果を図１１のグラフに、「メディエータあり」として示す。
図示したように、メディエータなしでは、発色は見られなかったが、メディエータありでは、酵素反応によりＴＢが還元され、５３５ｎｍ付近に発色が確認された。
（反応試薬液組成Ａ１）
ＴＢ ４ｍＭ
（反応試薬液組成Ａ２）
［Ｒｕ（ＮＨ3）6］Ｃｌ3（Ａｌｄｒｉｃｈ社製） ２ｍＭ
（反応試薬液組成Ｂ）
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０） ５０ｍＭ
ＰＱＱ−ＧＤＨ ５０Ｕ／ｍｌ
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ０．５重量％
ＴＢ ４ｍＭ
（反応試薬液組成Ａ２）
［Ｒｕ（ＮＨ3）6］Ｃｌ3（Ａｌｄｒｉｃｈ社製） ２ｍＭ
（反応試薬液組成Ｂ）
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０） ５０ｍＭ
ＰＱＱ−ＧＤＨ ５０Ｕ／ｍｌ
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ０．５重量％
（比較例２）
下記組成の反応試薬液をそれぞれ調製した。光路長１０ｍｍのマイクロセル（材質・ポリメタクリレート）に、下記組成Ａ１の試薬液および精製水をそれぞれ２５０μｌずつ、ついで下記組成Ｂの試薬液を５００μｌ入れ、さらに、３０ｍＭグルコース水溶液を１０μｌ添加して、室温下で撹拌した。添加１分後に、分光光度計（日本分光社製Ｖ−５５０型）にて波長４００ｎｍ〜９００ｎｍの吸収スペクトルを測定した。この結果を図１２のグラフに、「メディエータなし」として示す。
下記組成の反応試薬液をそれぞれ調製した。光路長１０ｍｍのマイクロセル（材質・ポリメタクリレート）に、下記組成Ａ１の試薬液および精製水をそれぞれ２５０μｌずつ、ついで下記組成Ｂの試薬液を５００μｌ入れ、さらに、３０ｍＭグルコース水溶液を１０μｌ添加して、室温下で撹拌した。添加１分後に、分光光度計（日本分光社製Ｖ−５５０型）にて波長４００ｎｍ〜９００ｎｍの吸収スペクトルを測定した。この結果を図１２のグラフに、「メディエータなし」として示す。
つぎに、別の光路長１０ｍｍのマイクロセル（材質・ポリメタクリレート）に、下記組成Ａ１の試薬液を２５０μｌ、さらにメディエータとして下記組成Ａ２の試薬液を２５０μｌ加え、ついで下記組成Ｂの試薬液を５００μｌ加えた後、３０ｍＭグルコース水溶液を１０μｌ添加して、室温下で撹拌した。添加１分後に分光光度計（日本分光社製Ｖ−５５０型）にて波長４００ｎｍ〜９００ｎｍの吸収スペクトルを測定した。この結果を図１２のグラフに、「メディエータあり」として示す。
図示したように、メディエータなしでは発色は見られなかったが、メディエータありでは、酵素反応によりＴ０１７４が還元され、５１５ｎｍ付近に発色が確認された。
（反応試薬液組成Ａ１）
Ｔ０１７４ ４ｍＭ
（反応試薬液組成Ａ２）
［Ｒｕ（ＮＨ3）6］Ｃｌ3（Ａｌｄｒｉｃｈ社製） ２ｍＭ
（反応試薬液組成Ｂ）
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０） ５０ｍＭ
ＰＱＱ−ＧＤＨ ５０Ｕ／ｍｌ
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ０．５重量％
Ｔ０１７４ ４ｍＭ
（反応試薬液組成Ａ２）
［Ｒｕ（ＮＨ3）6］Ｃｌ3（Ａｌｄｒｉｃｈ社製） ２ｍＭ
（反応試薬液組成Ｂ）
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０） ５０ｍＭ
ＰＱＱ−ＧＤＨ ５０Ｕ／ｍｌ
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ０．５重量％
以上のように、本発明の比色分析方法は、分析値に信頼性があって、反応系が単純化されていることから、例えば、生化学、臨床分析等のあらゆる分野において、グルコース、コレステロール等の分析に有用である。
Claims (9)
- 酸化還元酵素により、分析対象物を酸化させ、その際に、還元性発色剤を還元させて発色させ、その発色の程度を分析することにより前記分析対象物の定性若しくは定量分析を行う比色分析方法であって、前記発色剤が、メディエータ機能を有するテトラゾリウム塩である方法。
- 前記テトラゾリウム塩が、ニトロフェニル基、チアゾリル基およびベンゾチアゾリル基からなる群から選択される少なくとも一つの基を有する請求項１記載の方法。
- 前記テトラゾリウム塩が、3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide(MTT)、2-(4-Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-phenyl-2H-tetrazolium chloride(INT)、3,3'-[3,3'-Dimethoxy-(1,1'-biphenyl)-4,4'-diyl]-bis[2-(4-nitrophenyl)-5-phenyl-2H-tetrazolium chloride](Nitro-TB)、2-(4-Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium, monosodium salt(WST-1)、2-(4-Iodophenyl)-3-(2,4-dinitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium, monosodium salt(WST-3)、2-benzothiazolyl-3-(4-carboxy-2-methoxyphenyl)-5-[4-(2-sulfoethylcarbamoyl)phenyl]-2H-tetrazolium(WST-4)、2,2'-dibenzothiazolyl-5,5'-bis[4-di(2-sulfophenyl)carbamoylphenyl]-3,3'-(3,3'-dimethoxy-4,4'-biphenylene)ditetrazolium disodium salt(WST-5)、2-(2-Methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium, monosodium salt(WST-8)、2,3-Bis(4-nitrophenyl)-5-phenyltetrazolium Chloride、2-(2-Benzothiazolyl)-3,5-dophenyltetrazolium Bromide、2-(2-Benzothiazolyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-phenyltetrazolium Bromide、2,3-Di(4-nitrophenyl)tetrazolium Perchlorate、3-(3-Nitrophenyl)-5-methyl-2-phenyltetrazolium Chloride、3-(4-Nitrophenyl)-5-methyl-2-phenyltetrazolium Chlorideからなる群から選択される少なくとも一つである請求項１または２記載の方法。
- 前記分析対象物が、グルコース、コレステロール、尿酸、乳酸からなる群から選択される少なくとも一つの物質であり、前記酸化還元酵素が、前記各分析対象物に対応する酸化還元酵素である請求項１から３のいずれかに記載の方法。
- 請求項１に記載の比色分析方法に使用する試薬であって、メディエータ機能を有するテトラゾリウム塩を含む試薬。
- 前記テトラゾリウム塩が、ニトロフェニル基、チアゾリル基およびベンゾチアゾリル基からなる群から選択される少なくとも一つの基を有する請求項５記載の試薬。
- 前記テトラゾリウム塩が、3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide(MTT)、2-(4-Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-phenyl-2H-tetrazolium chloride(INT)、3,3'-[3,3'-Dimethoxy-(1,1'-biphenyl)-4,4'-diyl]-bis[2-(4-nitrophenyl)-5-phenyl-2H-tetrazolium chloride](Nitro-TB)、2-(4-Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium, monosodium salt(WST-1)、2-(4-Iodophenyl)-3-(2,4-dinitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium, monosodium salt(WST-3)、2-benzothiazolyl-3-(4-carboxy-2-methoxyphenyl)-5-[4-(2-sulfoethylcarbamoyl)phenyl]-2H-tetrazolium(WST-4)、2,2'-dibenzothiazolyl-5,5'-bis[4-di(2-sulfophenyl)carbamoylphenyl]-3,3'-(3,3'-dimethoxy-4,4'-biphenylene)ditetrazolium disodium salt(WST-5)、2-(2-Methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium, monosodium salt(WST-8)、2,3-Bis(4-nitrophenyl)-5-phenyltetrazolium Chloride、2-(2-Benzothiazolyl)-3,5-dophenyltetrazolium Bromide、2-(2-Benzothiazolyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-phenyltetrazolium Bromide、2,3-Di(4-nitrophenyl)tetrazolium Perchlorate、3-(3-Nitrophenyl)-5-methyl-2-phenyltetrazolium Chloride、3-(4-Nitrophenyl)-5-methyl-2-phenyltetrazolium Chlorideからなる群から選択される少なくとも一つである請求項５または６記載の試薬。
- 請求項５から７のいずれかに記載の試薬を含む試験片。
- さらに、無機ゲルを含む請求項８記載の試験片。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2003309950A JP2005077314A (ja) | 2003-09-02 | 2003-09-02 | 比色分析方法およびそれに用いる試薬 |
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| JP2003309950A JP2005077314A (ja) | 2003-09-02 | 2003-09-02 | 比色分析方法およびそれに用いる試薬 |
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|---|---|
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| JP2003309950A Withdrawn JP2005077314A (ja) | 2003-09-02 | 2003-09-02 | 比色分析方法およびそれに用いる試薬 |
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|---|---|
| JP (1) | JP2005077314A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008129001A (ja) * | 2006-11-24 | 2008-06-05 | Health & Life Co Ltd | 非酵素式尿酸試薬を用いたバイオセンサ、バイオセンサ試験片およびその製造方法 |
-
2003
- 2003-09-02 JP JP2003309950A patent/JP2005077314A/ja not_active Withdrawn
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008129001A (ja) * | 2006-11-24 | 2008-06-05 | Health & Life Co Ltd | 非酵素式尿酸試薬を用いたバイオセンサ、バイオセンサ試験片およびその製造方法 |
| JP4516559B2 (ja) * | 2006-11-24 | 2010-08-04 | 合世生醫科技股▲分▼有限公司 | 非酵素式尿酸試薬を用いたバイオセンサ、バイオセンサ試験片およびその製造方法 |
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