JPH03502281A - 溶液状態のビリルビンの測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 溶液状態のビリルビンの測定方法 本発明は水溶液、概して生物学的流体中のビリルビンの測定法に関する。

臨床および医療のためのビリルビンの測定（検出、濃度測定等）に関する多くの 文献がすでに存在している。たとえば、特許文献ＤＥ−Ｃ−２，２４０，４７１ ，ＤＥ−＾−２．ＯＯフ、０１３．　ＤＥ−＾−２．３６４．８４４およびＤＥ −＾−２，０１３，５５８に述べられているようにベンゼンジアゾニウムハライ ドのようなジアゾニウム塩を使用することができる。

しかし、該試薬は通常の温度および湿度の条件下では、安定性に欠け、貯蔵中に こわれることがある。

他のビリルビン測定法には酵素の触媒作用によるビリベルジンへの空気酸化法が ある。このような技術は次の文献に報告されている：Ｒ，ＢＲＯＤＥＲＳＥＮ等 のＥｕｒｏｐｅａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｓ＋１ｓｔｒｙ追（ １９６９年＞４６８；日本特許公告１１．１９４（１９８３年）；日本特許出願 １４１．７８３（１９８３年）、１７９９（１９８４年）、Ｂ、Ｔ、ＤＯＵＭ＾ Ｓ等、Ｃｌ１ｎ、Ｃｈｅｍ、３３（１９８７年）、１３４９−１３５３．Ｃ，Ｊ 、Ｐ、ＭＵＬＬＯＮ等、同書、１８２２−１８２５゜ビリルビンは、ヘモグロビ ンのヘム基が酵素の作用によってビリルビンに酸化される細胞外のヘムの異化作 用の生成物として血漿中に存在する無極性の黄色色素である。ビリルビンの水へ の溶解度は血漿中のアルブミンとの強固な結合および肝臓中のジグルクロニドと の抱合によって付与される。血漿中の異常なレベルのビリルビンの存在は肝臓疾 患の徴候である。正常のレベルは略々６−１８μ論ｏｆ／　Ｌ　（３５１０ｍｙ ／　Ｌ　）でほとんどすべて非抱合状態にある。該色素は無水条件下の暗所では 比較的安定である。しかし、溶液状態、特に明るいときには、該色素は経時的に 酸化してビリベルジンとなるので、直接黄色の帯域（たとえば、４６０　ｎｍ） の光学的濃度の絶対値を測定して、その濃度を測定することができない、さらに 、血清試料を処理する場合には、同一または隣接範囲において、不定的な強度で 吸収する他の化合物の存在によって、直接測定はさらにめんどうになる。したが って、溶液中のビリルビンを光学的に測定するには、吸収の変化率、すなわち、 既知の一定条件下で血清試料（または他の水溶液）中の当初のとリルビン濃度に よるビリルビンの黄色が経時的に変化する速度によらなければならない。

しかし、ビリルビン（Ｂ　Ｒ）のビリベルジン（ＢＶ）への空気酸化はある種の 真菌類および植物から得られる酵素ビリルビンオキシダーゼ（Ｂ　ＯＸ）の存在 によって触媒作用を示される。ビリルビンオキシダーゼ（Ｅｎｚｙｍｅ　　Ｃｏ ｍ鴎１ｓｓｉｏｎ　　Ｎｏ、　ＥＣＩ。

３．３．５）は最近血漿中のビリルビンの定量分析に用いられるようになった銅 含有酵素である（ＱＢ−Ａ−２，１４６，９９７）、該酵素は多種票の植物から 抽出することができ、抽出方法によって明かに多くの種類が存在する。ビリベル ジンへのビリルビンの接触酸化によってできる生成物（Ｈ２０□またはＨ２Ｏ） は使用するＢＯＸのタイプにより異なる０本明細書に述べた実験では、必ずしも すべての種類のＢＯＸを使用したわけではない、好ましいＢＯＸの種類はｆｕｎ ｇｕｓ　　Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｓ＋から得られた。従来技術において、酵素が 存在すると、ＢＲ溶液の４６ｏｎ−における吸収の急速の減少によって、ＢＯＸ の作用が証明されている。

このことがビリルビン分析測定試験法の基礎を成すものである（特に、本明細書 に引用したＧＢ−Ａ−２，１４６，９９７および関連参考資料参照）、シかしな がら、この試験法には、特に供試溶液が４６０ｎ−範囲に固有の吸収を有するか 、または透明性を欠く場合に、感度および適用可能性の点で制約がある。したが って、さらに有用で感度の高い方法が絶えず探索されつつある。

さらに、前述のように、４６０ｎｍの試験は吸収値の減少割合を測定することに よるもので、この方法には、測定を行い、記録する以前に試料が劣化（すなわち 、早期酸化）しないように特別の注意をはらうことが必要である。これはめんど うなことであり、少なくとも、退色を防ぐための特別な注意をはられずに試料を 処理することができる妥当な予備的期間の間は、ビリルビン試料が酸化および変 色に対する反応を示さないままである試験条件を見出すことができれば一層好ま しいことであろう。

本発明者等の研究により、前記の欠陥を取り除き、さらに後記する多くの利点を 有する全く新規な方法の基礎をなす、後に開示する発見が導びかれな。

この新規分析方法を請求項１または請求項２にまとめである。

より具体的には、驚くべきことに、ＢＯＸの触媒作用によるＢＲからＢＶへの反 応において、選択された還元剤（Ｒ）の存在が、ビリベルジンからビリルビンへ の逆転を伴う迅速な逆反応を誘起させることがわかった。したがって、本発明の 方法は輪状反応の生成によるもので、左に強くシフトする単純な平衡のみによる ものではない、これは次式のように表わすことができる。

Ｒ この図式において「生成物」とは酸素の還元生成物を意味し、ＲＯとはＲの酸化 生成物を意味する。

この図式は、実質的に一定の４６０ｎｍの吸収に加えて、（ａ）　　反応中に酸 素が実際に消費される（ｂ）　　結果として生じるＲの消費、すなわちＲが消費 されるとビリルビンはビリベルジンに転化する という観察結果によって支持される。

したがって、一定量の大過剰の還元剤を用いる場合、還元剤が消費される割合は ビリルビンの量（それゆえ、またビリベルジンの量）に比例する。それゆえ、Ｒ の消費割合の測定は水溶液および生理学的流体中のビリルビンを測定する有用な 測定法となる。

これを行う１つの方法は、Ｒの酸化状態（ＲＯ）において、測定可能な信号とな るＲを選択することである。

この成功例は標準レドックス電位が鉄（ＩＴ）イオン／鉄（Ｉ）イオン対の標準 レドックス電位と水素イオン／水素対の標準レドックス電位とのほぼ中間、すな わちｐＨ７においてほぼ０．４２Ｖおよび−０，６０Ｖの間にある系または化合 物の場合に可能性がある（Ｈ，Ｒ，ＭａｈｌｅｒおよびＥ　、　Ｈ、Ｃｏｒｄｅ ｓ共著Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉａａｎｄ　　　Ｔｈｅｒ＋＊ｏｄｙｎａｍｉｃｓ　　 　ｉｎ　　　Ｂｉｏｃｈｅｓｉｃａｌ　　　Ｔｒａｎｓｆｏｒｅ＋ａｔｉｏｎｓ Ｂ　ｉｏｌｏｇｉｃａｌ　　Ｃｈｅ＋＊１ｓｔｒｙ、Ｈａｒｐｅｒ　　Ｉ　ｎｔ ｅｒｎａｔ、　Ｅｄ、　１９６９゜ＮｅＷ−ＹｏｒＫ、Ｌｏｎｄｏｎ参照）、＃ １化すると色信号を与えることができる鎖糸の中には、下記のものを例示するこ とができる。

即ちチトクロムａおよびＣ、コピキノン、黄色酵素ＦＭＮ、リボフラビン、ＮＡ Ｄ”　／ＮＡＤＨ，フェレドキシンである。好適な化合物は酸化すると、フェノ ールと結合して、着色複合体となることができる４−アミノアンチピリン（４− ＡＡＰ）である。

このような測定法は実際に、たとえば過酸化水素を生成するオキシダーゼ（たと えばグルコースオキシダーゼ）を含む系の場合に一般的であり、ペルオキシダー ゼの触媒作用によるフェノール類の酸化の場合には過酸化水素を測定する０本発 明の系においては、ビリベルジンへの空気酸化においてＨ２０□を生成せずに作 用するものを含めた多種層のビリルビンオキシダーゼが適切であることを認識す ることが重要である。

別の方法によれば、驚くべきことに、４ＡＡＰの存在下でハロゲン化フェノール 頚またはアニリン類を使用すると供試ビリルビンの量に比例してハロゲン化物が 遊離することが見出された。適当なハロゲン化化合物（ＲＨａｌ）には４−フル オロフェノール、４−フルオロアニリン、テトラフルオロフェノールおよびペン タフルオロフェノール（ＲＦ化合物と定義する）がある。

したがって、基本反応の図式は次の通りである。

ＢＯＸ（４ＡＡＰ） ＢＶ十ＲＦ　　　　　　　　　　　　ＢＲ＋Ｆ’−Ｆ−の遊離はＢＯＸの触媒作 用によるもので、極めて迅速であり、したがってＦ−の遊離速度は、それ自体ビ リルビンの初期濃度に依存する４−ＡＡＰの酸化によって支配される。

Ｆ−は通常の方法で測定することができ、１つの適当な方法はＦ−イオン選択電 極を使用することである。

酵素の触媒作用による生化学反応におけるＦ−イオン選択電極の使用はすでに報 告されており、たとえばＵＳ−Ａ−４，３５３，９８３，４，６０７，０１０参 照のこと。

本発明においては、種々の種属の真菌顕、たとえばＳｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ 、Ｔｒａｃｈｙｄｅｒｍａ、Ｍｙｒｏｔｈｅｒｃｉｕ−から抽出したものを含む 数種類のビリルビンオキシダーゼ（ＢＯＸ）が適当である（たとえば、ＫＯ３Ａ ＫＡ等のＣｌ１ｎ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１６゜１９８３年１０月参照）０本発 明においてはＭｙｒｏｔｈｅｒｃｉｕｍＶｅｒｕｃａｒｉａから得られるＢＯＸ が好ましい、ＢＯＸの起源によって、ＢＲの酸化は副生物として過酸化水素また は水の生成を伴うことがあるが、本発明の方法はＨ２Ｏ２生成の有無に関係な〈 実施可能である。さらに、有機フルオロ化合物からのＦ−イオンの遊離がペルオ キシダーゼの触媒作用による先行研究とは異なり、本発明の方法におけるペルオ キシダーゼの添加は認識可能な影響を及ぼさない。

実際的観点からは、本発明の方法は、適当な緩衝液中で血清試料からのＦ−の遊 離を測定することによって行われる。

要約すると、未知試料の反応ＩＦ−イオンの遊離割合を測定するためには標準曲 線を参照するのが好ましい、標準曲線は、一定濃度のビリルビンを含む一連の試 料を測定することによって得ることができる。各試料ごとにＦ−イオンの遊離速 度を記録し、系を安定させ、速度曲線が直線になる時点に（いうまでもなく各試 料について同一）反応曲線の勾配を測る。フルオロ化合物および４ＡＡＰの濃度 が過剰でありさえすれば、反応曲線は直線である（零次反応）ことが認められる ０次に、標準参照曲線を得るように、ビリルビンの濃度に対して勾配を図に示す 。

速度曲線を調製するのに用いる測定した電気計測上のパラメーターはフッ化物電 極とともに用いられる電気計測システムの電圧の読み（ｍＶ）、または好適には 本発明の場合に下記の形式を有するネルンストの式： ％式％［］ ［式中、Ｅは測定された電圧でＥｏは該システムに関係し、活量係数および液絡 部の電位を含む実験的に求められる定数である。Ｓは、ｍｍｏｌ／Ｌ単位で表わ したＦ−イオン濃度の１０単位の変動に対してトリスＩｌ！液では約５７端Ｖ（ カコジル酸塩緩衝液（ｐＨ７，０）の場合には、この値はもっと大きい）に等し い定数の「ネルンスト勾配」である、コによって計算することができる対応する ［Ｆ−］の値であることができる。上記関係式から計算し、ｍｇ／Ｌ、で表した ［Ｆ−］の値をｒ図」に用いる場合には、得られる曲線は完全な直線に近似し、 その勾配を容易に確定することができる。

以下の実施例は本発明を具体的に説明するものであり、添付図面を参照すれば本 発明はもつとよく理解されよう。

第１図は、標準水溶液中のビリルビンの濃度に対するＦ″″の遊離速度の勾配を 示す計算図である。

夫１１Ｌ ビリルビン分析用校正曲線の作成。

下記の試薬溶液をトリス緩衝液（２００ｍｍｏｌ／　Ｌ　）（ｐＨ７）、５　μ ａｏｌ／　Ｌ　　ＮａＦ中で調製した。

ａ）とｌルピン　　　：　１００輪鋤０Ｉ／Ｌ炭酸ナトリウム溶液１０ｍＬ中に ２．５ｇルを含む原液を調製した。原液を蒸留水で希釈して、次の標準液（ｍｇ ／Ｌで表わす）を調製した：１０．２０゜４０．５０，１００゜ ｂ）　ビリルビンシダーゼＢＯＸ　　　：　　ＩＯＵ／輪りを含む２．５ｍＬ溶 液を凍結乾燥した市販の緩衝剤で調製した。２つの市販源のＢＯＸを使用した： （ｉ　）　Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕ＋ｓ　Ｖｅｒｕｃａｒｉａ起源のもの（Ｃａｌ ｂｉｏｃｈｅｍ　　≠２０１１０５）および（ｉｉ）Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ　 　Ｖｅｒｕｃａｒｊａ起源のもの（Ｓｉｇｍａ＃ＢＯ３９０）。

Ｃａ１ｂｉｏｃｈｅ輸試薬が好適であった。

９　０ｒｉｏｎ　　ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎフッ化物電極（９６−０９＞を使用 した。電極は差動増幅器に接続した。増幅器の出力をＫｅｉｔｈｌｅｙｌ　９７ マルチメーターに接続し１、ＩＥＥＥ４８８母線を経てＡｐｐｌｅ［＋コンピュ ーターとインターフェースさせてデータを得る。

火１１エ　実験は５ｃｏｔｌａｎｄのＦ　ｌｏｗ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ 　　Ｌ　ｔｄ、か３．５麟りである。

Ｌｉｎｂｒｏ培養板のくぼみの中に次の試薬溶液を加えたニドリス緩衝液（５０ ０μＬ）、アミノアンチピリン溶液（１０μＬ）、フルオロフェノール溶液（５ ０μＬ）、蒸留水（３７０μＬ）、フッ化物電極を溶液の中まで下げて、電極電 位を安定させた（３−５分間）、これに続いて、５０μＬのＢＯＸ溶液を加えて 、ふたたび電極を安定化させた（３−５分間）、最後にビリルビン作用標準溶液 （２０μＬ）を加えて反応を開始させた。Ｆ−遊離を５分間モニターした０次に 、常法によってＦ−の遊離速度をμｍｏｌ／　Ｌ　、　ｓｉｎ単位で計算し、得 られた値を対応するＢＲ濃度に対してプロットした。　　゛ １０．２０．５０および１００Ｂ／Ｌを含むビリルビンの標準液のみならずブラ ンク（ビリルビンゼロ）の標準液について測定した速度（μｍｏｌ／　Ｌ−ｗｉ ｎ＞勾配を第１図に図示する。

本試験において、約２０分以上の速度変化がなかったことに注目しなければなら ない、フルオロ化合物および４ＡＡＰのモル濃度はビリルビン１０す／Ｌ標準液 よりも約１７００倍大きく、かつ測定データから反応速度は約０．５ないし４μ ｌ１ｏｌ／ｓｉｎであるので、試薬の供給量が実質的に消費しつくされた直後に ビリルビンがほぼビリベルジンに転化するという新規な証拠がある。この驚くべ き情報は、律速段階が４−ＡＡＰの存在下における還元剤の消費に伴うビリベル ジンからビリルビンへの逆転であることを実証する。証拠は、また、分光測光的 に、４６０ｎｍにおけるビリルビンの吸収が、本明細書に開示するような種類の 還元剤の存在下でＢＯＸの触媒作用による酸化においては実質的に変化しないこ とを示すことによっても得られた。たとえば、ＢＯＸの存在下でビリルビン５０ ｍｇ／Ｌ溶液を用いると、最初の１０分間に約１５％の吸収の変化が認められた 。さらに４ＡＡＰを存在させると、同一時間内の変化は２％未満であった。

ペンタフルオロフェノールの代りに電子供与置換基を有する他の芳香族フッ素含 有化合物を使用することができることも指摘しておかなければなら′ない、これ らの化合物の中に、下記のものを例示することができる。すなわち、４−フルオ ロフェノール（ＦＰ）、４−フルオロアニリン（Ｆ　Ａ）、およびテトラフルオ ロフェノール（ＴＦＰ）も同様に上記試験に使用することができる。

Ｘ１匠２ 比較条件下で実施例１の方法を繰返し、遊離Ｆ−イオンをμ５Ｉｏｌ／Ｌ／ｓｉ ｎ単位で表わした下記試験結果を得た（２回の試験結果の平均値）。

０　　　　　　　　　０．１７６（ノイズ）１．０　　　　　　　　０．１７９ ５．０　　　　　　　　０．２９２ １０．０　　　　　　　　０．４４２ ２０．０　　　　　　　　０．７３８ ４Ｇ、０　　　　　　　　１．２９２ 上記の表を同様に分析した正常な血清（ＮＳ）および病的な血清（ＰＳ）の測定 の比較データとして使用した。試験結果のＮ５１４ｍｇ／ＬおよびｐＳ３２＋ｓ ｌＦ／Ｌは常法により得た値と相間々係にあった。

夫族匠ｌ 前記実施例の試験結果から、ビリルビンが全くないとき（ブランク）でさえも、 電位差計の非ゼロの読みの得られることがわかる。この状慧は極めて低濃度のビ リルビンの場合にのみ重要になることができるけれども、反応媒質およびｐＨの 変更を含むこのずれを低減させる手段を検討した。

たとえば、トリス緩衝液（トリス−トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン） （ｐＨ７）に加えてカコジル酸塩（ジメチルアルシン酸ナトリウム）Ｍ衝液（ｐ Ｈ７および５．５）のみならず＃酸塩緩衝液（ｐＨ５，５）も検討した。

三種類の緩衝液はすべて０．ＩＭであって、０．１ＭＮａＯＨまたは０、ＩＮの 酸（トリスおよびカコジル酸塩の場合にはＨＣｌを、酢酸塩の場合には酢酸を使 用した）で所望の９Ｈに調整した。試験は前記実施例と同様に、ビリルビンのゼ ロ濃度（ブランク）および２０ｍｙ／Ｌ濃度を用いて行った。

ブランク（すなわちビリルビンの濃度がゼロ）の場合の試験結果を下記の表に示 すが、便宜上対応する２０１１１Ｆ／Ｌ濃度の試料の場合に記録された値のパー セントで表わす。

２つのグループの試験結果を示すが、１つは還元剤として４−フルオロフェノー ル（４−ＦＰ）を用いた場合であり、もう一方は４−フルオロアニリン＜４−Ｆ Ａ）を用いた場合である。

級１１■ｉ±Ｌ−一　　区鳳１１■５ニドリス（７）　　　　　　　９３　　３ ３カコジル酸塩（７）　　　１６　　３３ＩＩ　　　（５，５）　　　　９　　 ２０酢酸塩（５，５）　　　　　２５　　５０上記のデータから、カコジル酸塩 （ｐＨ５，５）の場合に最小のノイズに遭遇することがわかる。また、４−ＦＰ は４−ＦＡよりも応答がまさっている。

Ｋ夏匠先 本発明の方法におけるユニのフルオロ化合物の能力を試験する実験をも行った。

供試化合物は４−フルオロフェノール（４−ＦＰ）、４−フルオロアニリン（４ −ＦＡ）およびペンタフルオロフェノール（ＰＰＰ）であった。前記実施例のよ うに、低濃度のビリルビン（すなわちこの場合には５ｍｆＩ／Ｌ）と比較したビ リルビンゼロ濃度について試験を行った。緩衝液はカコジル酸塩（ｐＨ５，５お よび７）であった、下記に示す試験結果は、ビリルビン濃度が５　＋ｏｙ／　Ｌ の試験値に対するパーセントとして表わした濃度ゼロのビリルビンの試験結果に 関するものである。

４−ＦＰ　　　　　　２０　　　　２８４−ＦＡ　　　　　　　６．２５　　２ ０Ｐ　Ｆ　Ｐ　　　　　　　１５　　　　６実施例３および４に開示された実験 を４−ＡＡＰ（４−アミノアンチピリン）無しに行った場合には、とリルビンの 量に関係なくバックグラウンドのノイズのみが記録されたことを指摘しておかな ければならない。

本発明の方法が、ユニの種類のＢＯＸの存在下でビリルビンの酸化中に生成する ことがある過酸化水素による酸化に基づくＦ−の遊離によるものではないことは 既に述べた。前述のように、このことはＨ２Ｏ２を生成しない数種類ものビリル ビンオキシダーゼを用いることによって立証された。Ｈ２０□による有機フルオ ロ化合物のフッ素−炭素結合開裂の触媒としてはたらくことが（本出願に引用さ れた先行研究等により）公知である触媒量のワサビダイコンペルオキシダーゼＰ ＯＤの存在するとき（または無いとき）に作用させることによって、さらに試験 を行った。

前記実施例の場合のように、ＰＯＤの存在するとき（５Ｕ／ｍｏｌ）または無い ときにカコジル酸塩緩衝液（ｐＨ７＞中でビリルビンの濃度がゼロおよび５Ｂ／ Ｌで試験を行った。

試験結果は、これも濃度ゼロの試験について、濃度５ｍｙ／Ｌの試験に対するパ ーセントで表わしたものであるが、ＰＯＤの存在は重要ではないことを示した。

たとえば、４−ＦＡの場合には試験結果は２３％（ＰＯＤあり）および２４％（ ＰＯＤなし）であった、４−ＦＰの場合には、いずれの試験結果も１３％であっ た。

０　　　２０　　　４θ　　　　Δ０　　　　δ０　　　１００ごワルビン（グ ／ｌン 国際調査報告 −四軸−＾−ａ＋ｍＮ＠、ｐ（７／ｇｇ　８９１００１８５

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. １．水性溶液中のビリルビンの測定方法であって、ａ．ビリルビンオキシダーゼ とビリベルジンを還元して当初のビリルビンに戻すことができる過剰量の還元性 化合物とを存在させてビリルビンをビリベルジンに酸化させ、かつｂ．水性溶液 中に存在するビリルビンの量を求めるために還元性化合物の消費割合を測定する 工程よりなる前記測定方法。
2. ２．水性溶液が生理学的流体である請求項１記載の方法。
3. ３．還元剤が、鉄（ＩＩ）イオン／鉄（ＩＩＩ）イオン対の標準酸化還元電位と 水素イオン／水素対の標準酸化還元電位との中間にある標準酸化還元電位を有す る化合物であり、かつ還元剤は還元剤の消費を示す信号を発することができる請 求項２記載の方法。
4. ４．還元剤が４−アミノ−アンチピリンであり、さらにビリベルジンが選択され たハロゲン化化合物の存在下で還元され、該選択されたハロゲン化化合物は酸化 型の４−アミノ−アンチピリンが存在すると酸化種の４−アミノ−アンチピリン 生成速度によって支配される速度で遊離ハライドイオンを生成することができ、 かつ水溶液中に存在するビリルビンの量を求めるためにハライドイオンを分析す る請求項３記載の方法。
5. ５．水性溶液中の前記ハライドイオンの生成速度をイオン選択電極で測定する請 求項４記載の方法。
6. ６．ハロゲン化化合物がｐ−フルオロフェノール、ｐ−フルオロアニリン、テト ラフルオロフェノール、ペンタフルオロフェノール、および電子供与置換基を有 する芳香族フッ素含有化合物より成る群から選ばれる請求項４記載の方法。
7. ７．ハロタン化化合物がｐ−フルオロフェノール、ｐ−フルオロアニリン、テト ラフルオロフェノール、およびペンタフルオロフェノールより成る群から選ばれ る請求項６記載の方法。
8. ８．水性溶液試料中のビリルビンを測定する方法であって、ａ．ビリルビンオキ シダーゼの存在下にビリルビンを定量的にビリベルジンに酸化させ、 ｂ．還元剤によってビリベルジンを定量的に還元させ、この場合に還元剤はビリ ルビンに対して過剰モル量を使用し、ｃ．水性溶液試料中に存在するビリルビン の量を求めるために還元剤の消費割合を測定する工程よりなる前記測定方法。
9. ９．水溶液が生理学的流体である請求項８記載の方法。
10. １０．還元剤が鉄（ＩＩ）イオン／鉄（ＩＩＩ）イオン対の標準酸化還元電位と 水素イオン／水素対の標準酸化還元電位との中間にある標準酸化還元電位を有す る化合物であり、かつ還元剤が還元剤の消費を示す信号を発することができる請 求項９記載の方法。
11. １１．還元剤が４−アミノ−アンチピリンであり、さらにビリベルジンが選択さ れたハロゲン化化合物の存在下で還元され、該選択されたハロゲン化化合物は酸 化型の４−アミノ−アンチピリンが存在すると酸化種の４−アミノ−アンチピリ ンの生成速度によって支配される速度で遊離ハライドイオンを生成することがで き、かつ水性溶液中に存在するビリルビンの量を求めるためにハライドイオンを 分析する請求項１０記載の方法。
12. １２．水性溶液中の前記ハライドイオンの生成速度をイオン選択電極で測定する 請求項１１記載の方法。
13. １３．ハロゲン化化合物がｐ−フルオロフェノール、ｐ−フルオロアニリン、テ トラフルオロフェノール、ペンタフルオロフェノール、および電子供与置換基を 有する芳香族フッ素含有化合物より成る群から選ばれる請求項１１記載の方法。
14. １４．ハロゲン化化合物がｐ−フルオロフェノール、ｐ−フルオロアニリン、テ トラフルオロフェノール、およびペンタフルオロフェノールより成る群から選ば れる請求項１３記載の方法。