CN1967252B - 直接胆红素测定试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种直接胆红素测定试剂盒，该试剂盒是由试剂1和试剂2组成的液体型双试剂，其中试剂1为：酒石酸-氢氧化钠缓冲液(PH 2.6～3.4)7.5～37.5g/L，乙二胺四乙酸二钠0.2～1g/L，硫脲0.1～1.4g/L，盐酸羟胺0.2～1.2g/L，曲通100 1.5～7.5ml/L；试剂2为：磷酸氢二钠1～5.5g/L，磷酸二氢钾0.25～1.5g/L，亚硝酸钠0.1 5～0.7g/L，乙二胺四乙酸二钠2～13g/L，氯化钠4～22.5g/L，硫柳汞0.04～0.3g/L。本发明试剂盒具有线性测试范围宽，精确度和准确度高，抗干扰性佳，灵敏度高的优点，有较大的临床实用价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物制剂技术领域，具体涉及一种直接胆红素测定试剂盒。
背景技术
胆红素的测定，传统采用的是重氮试剂法，该法历史悠久，测值较准，其主要缺点即试剂稳定性差、反应特异性差等，虽经过了无数的改良，至今仍无满意结果。酶法测定直接胆红素具有特异的特点，但其试剂盒由于酶热稳定性差、保存时间短、价格过高不利于推广应用。
目前，化学氧化法测直接胆红素试剂盒已在市场上占领了很大份额，主要包括钒酸氧化剂试剂盒和亚硝酸钠氧化剂试剂盒。钒酸氧化剂试剂盒测低值样本时，副反应较明显而影响结果；在自动生化仪上测定时可严重干扰其它项目测定；有一定毒性，尤其是废弃物可能被还原成剧毒的偏钒酸盐。亚硝酸盐作为一种温和的氧化剂，较钒酸盐等更能减少因氧化性产生的干扰和副反应，且有较好的环境安全性。但现有亚硝酸钠氧化剂试剂盒仍存在对于低值样本的准确度差，抗干扰性弱，灵敏度不高等局限性，影响了其推广应用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有亚硝酸钠氧化剂试剂盒的不足，提供一种对于低值样本的测量准确度好，具有较宽线性测试范围，精确度高，抗干扰性佳，灵敏度高的直接胆红素测定试剂盒。
本发明的直接胆红素测定试剂盒，是由试剂1和试剂2组成的液体型双试剂，其中试剂1为：
试剂2为：
本发明的直接胆红素测定试剂盒的优选为
试剂1为：
试剂2为：
本发明的直接胆红素测定试剂盒的最优选为
试剂1为：
试剂2为：
本发明的直接胆红素测定试剂盒试剂1和试剂2中的原料选择依据是：
酒石酸-氢氧化钠缓冲液形成适当pH的缓冲液。酸性过大易促使胆红素发生自氧化，所以不能使反应pH太低，但pH太高，亚硝酸盐的氧化性不足，需要更长的反应时间，而反应时间过长又增加了非结合型胆红素的氧化反应，导致测量不准确。因此，本发明控制酒石酸-氢氧化钠缓冲液的pH值在2.6～3.4。
乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)，可络合测试样本中的二价金属离子，减少样本中胆红素的自氧化。
盐酸羟胺，间接胆红素与亚硝酸钠反应的抑制剂，作用强。
硫脲，络合间接胆红素，作为间接胆红素与亚硝酸钠反应的抑制剂。
曲拉通100，表面活性剂，促进样本中各种物质溶解，减少样本脂浊等对测定结果影响，可促进直接胆红素与亚硝酸钠的反应。
亚硝酸钠，具有氧化性，作为氧化剂氧化样本中的直接胆红素成胆绿素。
氯化钠，增强溶液的离子强度，产生原盐效应，加速测定反应速率。
硫柳汞，作为防腐剂，防止由于细菌硝化作用将亚硝酸盐转变为硝酸盐等。
本发明试剂盒试剂1和试剂2的制备采用常规方法混合搅匀即可。
测试样本中加入本试剂盒试剂1，表面活性剂曲拉通100可促进样本中各种物质溶解，盐酸羟胺或硫脲可与间接胆红素络合，抑制其反应，乙二胺四乙酸二钠可络合样本中的二价金属离子；当加入试剂2时，亚硝酸钠在酸性条件下产生氧化性而将胆红素氧化成胆绿素，由此测定亚硝酸钠作用前后吸光度差异，以求得样品中的直接胆红素的浓度。
应用本发明直接胆红素测定试剂盒测定样本中直接胆红素的方法如下：样品(校准管以校准品作样品)加试剂1混匀，30～40℃反应3～5min后读取吸光度A1；加入试剂2，混匀，30～45℃反应5min后读取吸光度A2；根据公式：胆红素的含量＝测定吸光度(A2-A1)*校准液浓度/校准吸光度(A2-A1)得出直接胆红素的含量。其中，样品(校准品)用量8μL，试剂1用量180～320μL，试剂2用量40～120μL。
相对于现有的测定直接胆红素的试剂盒，本发明的试剂盒对于低值样本的测量准确度好，具有线性测试范围宽，精确度高，抗干扰性佳，灵敏度高的优点，适用于全自动生化分析仪，有较大的临床实用价值。
附图说明
图1是本发明直接胆红素测定试剂盒的测定直接胆红素的实时反应曲线图。
图2是对比例试剂盒的测定直接胆红素的实时反应曲线图。
图中横坐标为全自动生化分析仪反应监测的时刻，按10分钟分为35个时段；纵坐标为吸光度A。
具体实施方式
以下结合附图、实施例和对比例对本发明进行进一步的说明。
实施例1
试剂1(R1)
试剂2(R2)
实施例2
试剂1(R1)
试剂2(R2)
实施例3
试剂1(R1)
试剂2(R2)
实施例4
试剂1(R1)
试剂2(R2)
实施例5
试剂1为：
试剂2为：
对比例
由上海容盛生物技术有限公司生产的直接胆红素测定试剂盒(亚硝酸钠氧化法)，产品标准号：YZB/沪1559-40-2006。
本发明直接胆红素测定试剂盒的性能测试如下：
试验1.线性范围实验
配制0，50，100，150，200，250，300，350，400，450μmol/L直接胆红素标准溶液，分别用本发明直接胆红素测定试剂盒和对比例试剂盒来测定其浓度，结果见表1。
本发明直接胆红素测定试剂盒和对比例试剂盒测定样本中直接胆红素的方法如下：样品(校准管以校准品作样品)加试剂1混匀，30～40℃反应3～5min后读取吸光度A1；加入试剂2，混匀，30～45℃反应5min后读取吸光度A2；根据公式：胆红素的含量＝测定吸光度(A2-A1)×校准液浓度/校准吸光度(A2-A1)得出直接胆红素的含量。其中，样品(校准品)用量8μL，试剂1用量180～320μL，试剂2用量40～120μL。
表1本发明直接胆红素测定试剂盒和对比例试剂盒测定线性范围对比
本发明直接胆红素测定试剂盒的线性范围较对比例试剂盒的高156％。在直接胆红素浓度大于250μmol/L时，对比例试剂盒不能检出，线性范围过小，这是由于试剂结构性成分决定的。可见，本发明直接胆红素测定试剂盒具有较大的线性测试范围。
试验2：灵敏度实验
通过试剂盒与待测胆红素样本的实时反应曲线来评价本发明直接胆红素测定试剂盒的灵敏度，并与对比例进行比较说明，见附图1，2。测定样本中直接胆红素的方法同试验1。
可见，本发明试剂盒的实时反应曲线规范，样本经与试剂2氧化后产生的吸光度下降明显，且经监测时刻10min后吸光度基本稳定；而对比例试剂盒经与样本反应后产生的吸光度下降较弱，且经监测时刻10min后吸光度仍存在下降趋势。
因此得出本发明直接胆红素测定试剂盒具有较高的灵敏度。
试验3：准确度实验
以罗氏校正品定标，测定罗氏高值和低值质控品。连续用本发明直接胆红素测定试剂盒和对比例试剂盒进行准确度比较，结果见表2。测定样本中直接胆红素的方法同试验1。
表2本发明直接胆红素测定试剂盒和对比例试剂盒测定准确度对比1
由表2可看出，本发明试剂盒的准确度较高。
除了对测定罗氏高值和低值质控品外，还对临床大量样本进行测试。由于J-G重氮试剂法测值较准，我们采用其测值作为标准对比。用J-G重氮试剂法严格操作，对提供的样本进行测定，小于15μmol/L为低值，N＝20。
表3本发明直接胆红素测定试剂盒和对比例试剂盒测定准确度对比2
由表3可看出，本发明试剂盒的准确度较高。
试验4：精确度实验
精确度，也即重现性，以罗氏校正品定标，测定罗氏高值和低值质控品，连续用本发明直接胆红素测定试剂盒测定20次，测量其精确度。和对比例试剂盒进行准确度比较，结果见表4。测定样本中直接胆红素的方法同试验1。
表4本发明直接胆红素测定试剂盒和对比例试剂盒测定精确度对比
| 实测均值(n＝20) | 本发明试剂盒 | 对比例试剂盒 |
| 罗氏高值(38.3μmol/L) | 38.5μmol/L | 39.2μmol/L |
| CV％ | 1.3％ | 1.6％ |
| 罗氏低值(13.7μmol/L) | 13.9μmol/L | 14.6μmol/L |
| CV％ | 2.1％ | 3.8％ |
从表4可以看出，二试剂盒对罗氏高值质控品测值准确度和精密度均较高，但对于测定低值质控品本发明试剂盒的精密度更高。
试验5：抗干扰性能实验
在罗氏质控品(38.3μmol/L)中加入表5中四种干扰物，再分别用本发明直接胆红素测定试剂盒和对比例试剂盒进行直接胆红素的浓度测定及比较，结果见表5。测定样本中直接胆红素的方法同试验1。
表5本发明直接胆红素测定试剂盒和对比例试剂盒测定抗干扰性能对比
从表5可以看出本发明试剂盒比实施例试剂盒的抗干扰性能好，尤其是对抗Hb的干扰能力要优。
Claims (3)
1.一种直接胆红素测定试剂盒，其特征在于该试剂盒是由试剂1和试剂2组成的液体型双试剂，其中
试剂1为：
试剂2为：
所述的液体即溶剂为水。
2.根据权利要求1所述的直接胆红素测定试剂盒，其特征在于：
试剂1为：
试剂2为：
3.根据权利要求1所述的直接胆红素测定试剂盒，其特征在于：
试剂1为：
试剂2为：
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