CN102226769A - 亚硝酸钠氧化法测定直接胆红素的试剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及亚硝酸钠氧化法测定直接胆红素的试剂，可有效解决线性范围宽、抗干扰性强、反应曲线规范、能迅速达到终点且测定的准确度和精密度高且能实际应用无污染环境的问题，方法是，试剂1是，将邻苯二甲酸钾钠10.2～30.6g、氢氧化钠1.8～2.6g、聚乙二醇辛基苯基醚0.10～1.0ml和盐酸羟胺0.5～1.5g混合在一起，加水至1000ml溶解拌匀，pH值为4.5～5.5；试剂2是，由亚硝酸钠0.32～0.96g、氢氧化钠0.05～0.15g、碳酸钠0.10～0.30g混合在一起，加水至1000ml溶解拌匀，pH值为11～13，本发明组方科学，易生产，性能稳定，成本低，无环境污染。

Description

亚硝酸钠氧化法测定直接胆红素的试剂

一、技术领域

本发明涉及一种测定血清、血浆或尿液中直接胆红素的试剂，特别是一种亚硝酸钠氧化法测定直接胆红素的试剂。

二、背景技术

胆红素是临床上判定黄疸的重要依据，也是肝功能的重要指标。胆红素是人体内结合(直接)胆红素与非结合(间接)胆红素的总和。胆红素总量增高、间接胆红素增高表明：溶血性贫血，血型不合输血，恶性疾病，新生儿黄疸等。胆红素总量增高、直接与间接胆红素均增高表明：急性黄疸型肝炎，慢性活动性肝炎，胆硬变，中毒性肝炎等。胆红素总量增高、直接胆红素增高表明：肝内及肝外阻塞性黄疸，胰头癌，毛细胆管型肝炎及其他胆汁瘀滞综合征等。因此，对人体的血清、血浆或尿液中直接胆红素的测定，是医学检验最常规的项目之一。

测定直接胆红素的试剂目前主要有以下三种：重氮法测定直接胆红素的试剂、酶法测定直接胆红素的试剂和化学氧化法测定直接胆红素的试剂。

重氮法测定直接胆红素的试剂：历史悠久，测值较准，其主要缺点即试剂稳定性差、反应特异性差等，虽经过了无数次的改良，至今仍无满意结果。

酶法测定直接胆红素的试剂：采用该试剂测定直接胆红素具有简单、特异的特点。但由于酶法测定直接胆红素的试剂酶热稳定性差，保存时间短，价格过高，不利于推广应用。所以，目前虽然已能进入临床应用，但远非完善，还需继续研究。

化学氧化法测定直接胆红素的试剂：从上世纪九十年代起，化学氧化法中的钒酸氧化法测定直接胆红素的试剂开始在国外实际应用，从1998年起钒酸氧化法测定直接胆红素的试剂开始进入我国。与重氮法测定直接胆红素的试剂和酶法测定直接胆红素的试剂相比，钒酸氧化法测定直接胆红素的试剂逐步显示出测定直接胆红素时其操作简单方便、试剂稳定、保存时间长(如双试剂型在室温下可以稳定一年，置于仪器的试剂仓中可以稳定一个月以上)以及价格低廉等优点。但该试剂测低值样本时，副反应较明显而影响结果；在自动生化仪上测定时可严重干扰其它项目测定；有一定毒性，尤其是废弃物可能被还原成剧毒的偏钒酸盐而污染环境。因此，胆红素的测定试剂有待改进和创新。

三、发明内容

针对上述情况，为克服现有技术缺陷，本发明目的在于提供一种亚硝酸钠氧化法测定直接胆红素的试剂，可有效解决线性范围宽、抗干扰性强、反应曲线规范、能迅速达到终点且测定的准确度和精密度高且能实际应用无污染环境的亚硝酸钠氧化法测定直接胆红素的试剂的问题。

本发明的解决技术方案是，该亚硝酸钠氧化法测定直接胆红素的试剂是由试剂1和试剂2组成，其中试剂1是，每1000ml的试剂1，由邻苯二甲酸钾钠10.2～30.6g、氢氧化钠1.8～2.6g、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)0.10～1.0ml、盐酸羟胺0.5～1.5g和余量为水组成，其中，先将邻苯二甲酸钾钠、氢氧化钠、聚乙二醇辛基苯基醚和盐酸羟胺混合在一起，加水至1000ml溶解拌匀，PH值为4.5～5.5；试剂2是，每1000ml的试剂2，由亚硝酸钠0.32～0.96g、氢氧化钠0.05～0.15g、碳酸钠0.10～0.30g和余量为水组成，其中，先将亚硝酸钠、氢氧化钠和碳酸钠混合在一起，加水至1000ml溶解拌匀，PH值为11～13。

在以上组分中，邻苯二甲酸钾钠与氢氧化钠在PH为4.5～5.5形成稳定的缓冲液，利于试剂中各种成分的分散稳定性。Triton X-100表面活性剂，是非水溶性间接胆红素的增溶剂，是反应的促进剂、润滑剂，它提高检测的灵敏度，促进样本中各种物质溶解，减少样本脂浊等对测定的影响。盐酸羟胺为抑制剂，可抑制间接胆红素被氧化，亚硝酸钠主要起氧化性的作用。

用本发明的亚硝酸钠氧化法测定直接胆红素的试剂盒基于下列原理测定直接胆红素：直接胆红素被亚硝酸钠氧化成胆绿素，而间接胆红素在抑制剂作用下不被氧化，直接胆红素(DBil)的减少引起在波长450nm处吸光度的下降，吸光度的减少和血清中的胆红素成正比，测定450nm下的吸光度的减少来计算血清中直接胆红素的含量。

本发明组方科学，新颖独特，易生产，性能稳定，保存期长，成本低，无环境污染，是测定胆红素试剂上的创新。

四、具体实施方式

以下结合具体情况和实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。

实施例1

本发明在具体实施中，由试剂1和试剂2组成，其中试剂1是，由邻苯二甲酸钾钠20.4g、氢氧化钠2.2g、聚乙二醇辛基苯基醚0.25ml、盐酸羟胺1.0g，加蒸馏水至1000ml混匀组成，PH值为5.0；试剂2是，由亚硝酸钠0.51g、氢氧化钠0.1g、碳酸钠0.2g，加蒸馏水至1000ml混匀组成，PH值为12。

用本实施例的亚硝酸钠氧化法测定直接胆红素的试剂基于下列原理测定直接胆红素：直接胆红素被亚硝酸钠氧化成胆绿素，而间接胆红素在抑制剂作用下不被氧化，DBil的减少引起在波长450nm处吸光度的下降，吸光度的减少和血清中的胆红素成正比，测定450nm下的吸光度的减少来计算血清中直接胆红素的含量。

温度37℃；比色杯光径1.0cm  波长450nm

样品和标准品各10μl；所说的样品为被测品，即血清、血浆或尿液，所说的标准品为具有溯源性的定值血清，以下同；

试剂1(简称R₁，以下同) 240μl；试剂2(简称R₂，以下同) 60μl

样品加R₁混匀，37℃孵育5min后读取吸光度A₁；加入R₂混匀，37℃孵育5min后读取吸光度A₂，前后吸光度差：ΔA＝A₂-A₁。

计算

所说的ΔA_样品为样品加入试剂1与加入试剂2后两次吸光度的差；ΔA_标准为标准品加入试剂1与加入试剂2后两次吸光度的差(以下同)。

实施例2

本发明还可是由试剂1和试剂2组成，其中试剂1是，由邻苯二甲酸钾钠10.2g、氢氧化钠1.8g、聚乙二醇辛基苯基醚0.10ml、盐酸羟胺0.5g，加蒸馏水至1000ml混匀组成，PH值为4.5；试剂2是，由亚硝酸钠0.32g、氢氧化钠0.05g、碳酸钠0.10g，加蒸馏水至1000ml混匀组成，PH值为11。

本实施例2的试剂测定直接胆红素的方法同实施例1，不再重述。

实施例3

本发明由试剂1和试剂2组成，其中试剂1是，由邻苯二甲酸钾钠30.6g、氢氧化钠2.6g、聚乙二醇辛基苯基醚1.0ml、盐酸羟胺1.5g，加蒸馏水至1000ml混匀组成，PH值为5.5；试剂2是，由亚硝酸钠0.96g、氢氧化钠0.15g、碳酸钠0.30g，加蒸馏水至1000ml混匀组成，PH值为13。

本实施例3的试剂测定直接胆红素的方法同实施例1，不再重述。

本发明试剂进行了性能检测，并与现有的钒酸氧化法测定直接胆红素的试剂进行临床样品对比试验，结果如下：

仪器：HITICH7060全自动生化分析仪

准确度试验

取RANDOX质控品正常值和异常值，用本发明试剂进行测试，每个浓度样品重复测试3次。

精密度试验

取本发明三个批号的试剂，每个批号对RANDOX质控品正常值DBil值17.5μmol/L进行10次重复测定，然后计算测定值的均数X、测定值的标准差S与测定值的变异系数CV值，其公式如下：

$\mathrm{CV}=\frac{S}{\stackrel{\‾}{X}}\×100\%$

其批内精密度变异系数CV为2.58％，批间精密度变异系数CV为3.22％。

线性试验

理论值(μmol/L)	0	25	50	100	200	400
							本试剂测定值(μmol/L)	0.0	25.1	49.3	98.9	195.3	394.2
现有试剂测定值(μmol/L)	0.5	26.3	54.6	112.0	185.0	326.0

临床对比试验

同时用本发明试剂与现有的钒酸氧化法测定直接胆红素的试剂检测临床病人血清标本100例，数据和统计结果如下：

两种试剂所测两组结果的相关性(r)＝0.9978。

综上所述，本发明亚硝酸钠氧化法测定直接胆红素的试剂与现有技术(化学氧化法)的矾酸盐氧化法测定直接胆红素的试剂相比，本发明的试剂既保留了现有试剂的优点：操作简便，试剂稳定，保存期长，又降低了成本，成本降低50％以上，且对环境无污染，具有良好的环保安全性能，是测定直接胆红素试剂上的创新。

Claims (4)

1.一种亚硝酸钠氧化法测定直接胆红素的试剂，其特征在于，由试剂1和试剂2组成，其中试剂1是，每1000ml的试剂1，由邻苯二甲酸钾钠10.2～30.6g、氢氧化钠1.8～2.6g、聚乙二醇辛基苯基醚0.10～1.0ml、盐酸羟胺0.5～1.5g和余量为水组成，其中，先将邻苯二甲酸钾钠、氢氧化钠、聚乙二醇辛基苯基醚和盐酸羟胺混合在一起，加水至1000ml溶解拌匀，PH值为4.5～5.5；试剂2是，每1000ml的试剂2，由亚硝酸钠0.32～0.96g、氢氧化钠0.05～0.15g、碳酸钠0.10～0.30g和余量为水组成，其中，先将亚硝酸钠、氢氧化钠和碳酸钠混合在一起，加水至1000ml溶解拌匀，PH值为11～13。

2.根据权利要求1所述的亚硝酸钠氧化法测定直接胆红素的试剂，其特征在于，所说的试剂1是，由邻苯二甲酸钾钠20.4g、氢氧化钠2.2g、聚乙二醇辛基苯基醚0.25ml、盐酸羟胺1.0g，加蒸馏水至1000ml混匀组成，PH值为5.0；试剂2是，由亚硝酸钠0.51g、氢氧化钠0.1g、碳酸钠0.2g，加蒸馏水至1000ml混匀组成，PH值为12。

3.根据权利要求1所述的亚硝酸钠氧化法测定直接胆红素的试剂，其特征在于，所说的试剂1是，由邻苯二甲酸钾钠10.2g、氢氧化钠1.8g、聚乙二醇辛基苯基醚0.10ml、盐酸羟胺0.5g，加蒸馏水至1000ml混匀组成，PH值为4.5；试剂2是，由亚硝酸钠0.32g、氢氧化钠0.05g、碳酸钠0.10g，加蒸馏水至1000ml混匀组成，PH值为11。

4.根据权利要求1所述的亚硝酸钠氧化法测定直接胆红素的试剂，其特征在于，所说的试剂1是，由邻苯二甲酸钾钠30.6g、氢氧化钠2.6g、聚乙二醇辛基苯基醚1.0ml、盐酸羟胺1.5g，加蒸馏水至1000ml混匀组成，PH值为5.5；试剂2是，由亚硝酸钠0.96g、氢氧化钠0.15g、碳酸钠0.30g，加蒸馏水至1000ml混匀组成，PH值为13。