CN105092573A - 一种新型的直接胆红素检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新型的直接胆红素检测试剂盒,是由试剂R1和试剂R2组成的;所述试剂R1是由Tris-HCl酒石酸氢氧化钠缓冲液、丙三醇、二硫苏糖醇、硝酸银、甲基异丁酮、曲拉通X-100、Na2-EDTA和盐酸羟胺组成的;所述试剂R2是由磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、过硫酸钠、Na2-EDTA和NaCl组成的。本发明中的各组分,配比科学,对0-400μmol/L范围内样本的测量准确度较好,精密度高,重复性好,抗干扰能力强,试剂稳定性较好,适用于全自动生化分析仪,临床使用价值大。
Description
技术领域
本发明涉及临床体外检测试剂技术领域,特别涉及一种新型的直接胆红素检测试剂盒。
背景技术
胆红素包含游离胆红素和直接胆红素两种:直接胆红素又可称为结合胆红素,即血液中游离胆红素运输到肝脏后,迅速被肝细胞摄取,胆红素在肝细胞胞浆中主要与Y蛋白和Z蛋白结合(以Y蛋白为主)。然后在内质网中结合葡萄糖醛酸生成水溶性结合胆红素;游离胆红素亦可以成为未结合胆红素,即没有与葡萄糖醛酸结合,未结合的胆红素主要是血红素在单核吞噬系统细胞微粒体血红素加氧酶的作用催化下,形成线性四吡咯的水溶性胆绿素,胆绿素进一步在细胞液中活性较强的胆绿素还原酶作用催化下,还原成胆红素。
目前对于直接胆红素的检测诊断方法有很多种,重氮法、高效液相色谱法(HPLC)、氧化酶法等。重氮法是历史最久,目前为止应用较广的方法,但是该方法测定直接胆红素时受到多种因素影响,结果差异性较大;高效液相色谱法(HPLC)对仪器和设备要求较高,因此不能作为常规方法使用;氧化酶法灵敏度高,抗干扰能力不是很强,主要是由于酶对温度要求极高,活性只能在一定温度范围内才能发挥最佳作用,而且该种方法试剂价格极高难于推广。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服现有技术的不足之处,提供了一种准确度好,精密度高,重复性好,抗干扰能力强,试剂稳定性好的新型的直接胆红素检测试剂盒。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的:
一种新型的直接胆红素检测试剂盒,是由试剂R1和试剂R2组成的;
所述试剂R1是由以下含量的物质组成的:
Tris-HCl酒石酸氢氧化钠缓冲液0.05-0.15mol/L
丙三醇0.005-0.015mol/L
二硫苏糖醇0.005-0.015mol/L
硝酸银0.002-0.008mol/L
甲基异丁酮0.2-0.8%
曲拉通X-1000.05-0.15%
Na2-EDTA0.01-0.1g/L
盐酸羟胺0.1-0.8g/L;
所述试剂R2是由以下含量的物质组成的:
磷酸氢二钠1.0-2.0g/L
磷酸二氢钠1.5-3.0g/L
过硫酸钠0.060-0.085mol/L
Na2-EDTA0.3-0.7g/L
NaCl0.05-0.15%。
作为本发明的一个优选,所述试剂R1是由以下含量的物质组成的:
Tris-HCl酒石酸氢氧化钠缓冲液0.1mol/L
丙三醇0.01mol/L
二硫苏糖醇0.01mol/L
硝酸银0.005mol/L
甲基异丁酮0.5%
曲拉通X-1000.1%
Na2-EDTA0.05g/L
盐酸羟胺0.4g/L;
所述试剂R2是由以下含量的物质组成的:
磷酸氢二钠1.5g/L
磷酸二氢钠2.5g/L
过硫酸钠0.074mol/L
Na2-EDTA0.5g/L
NaCl0.1%。
所述的,试剂R1和试剂R2的体积比为4:1。
所述的,Tris-HCl酒石酸氢氧化钠缓冲液的pH为5.0-6.0。
本发明的基本原理:直接胆红素经Tris-HCl酒石酸氢氧化钠缓冲液孵育后,被过硫酸钠氧化为胆绿素,通过检测溶液的颜色变化,进而确定直接胆红素的含量。反应液中颜色和直接胆红素含量成线性关系。
本发明:样本样品(以朗道质控品作为样本样品,校准品作为校准液),样本中加入R1试剂孵育5min,充分混匀然后读取此时的吸光度A1,加入试剂R2,37℃反应5min然后读取此时的吸光度R2,计算ΔA,根据公式:
直接胆红素的含量=吸光度(A2-A1)*标准液浓度
其中样本用量9μL,试剂R1为240μL,试剂R2为60μL。
本发明一种新型的直接胆红素检测试剂盒,试剂R1和试剂R2的选择依据为:
Tris-HCl酒石酸氢氧化钠缓冲液缓冲液形成较为合适的pH环境,若pH过低,容易导致胆红素发生自氧化,进而导致检测结果不准确;若pH过高,由于过硫酸钠氧化性较强,能够氧化游离胆红素造成干扰,影响最终检测结果,因此本发明Tris-HCl酒石酸氢氧化钠缓冲液的pH值为5.0-6.0。
丙三醇,稳定剂,用来稳定反应体系,保证反应顺利进行。
二硫苏糖醇,大分子物质,螯合作用,螯合一些杂质离子,去除干扰。
硝酸银,催化作用,银离子可以有效的催化过硫酸钠发挥其氧化作用,氧化待测样本中的直接胆红素。
甲基异丁酮,能够抑制游离胆红素与过硫酸钠反应,降低干扰性。
曲拉通X-100,表面活性剂,不但促进样本中各物质的溶解,增大溶解性,减少样本脂溶性物质对测定结果产生影响,而且能够促进直接胆红素与过硫酸钠反应。
Na2-EDTA可以与样本中二价金属离子结合形成络合物,降低样本中的胆红素被氧化的机率。
盐酸羟胺,抑制剂能够有效结合游离胆红素,抑制其与氧化剂发生反应。
磷酸氢二钠和磷酸二氢钠形成磷酸盐缓冲对,保证反应pH值不会受到较大波动,稳定反应方向。
过硫酸钠,氧化剂,能够与直接胆红素发生氧化反应,氧化直接胆红素。
氯化钠,增强溶液的离子强度,产生原盐效应,加快反应速率。
本发明的有益效果:
1.本发明的一种新型的直接胆红素检测试剂盒,使用过硫酸钠作为氧化剂,过硫酸钠能够将直接胆红素氧化为胆绿素,通过吸光光度值变化进而检测直接胆红素的含量。反应期间,过硫酸钠不会氧化游离胆红素,所以游离胆红素含量的多少不会影响到直接胆红素的检测。
2.本发明中的各组分,配比科学,对0-400μmol/L范围内样本的测量准确度较好,精密度高,重复性好,抗干扰能力强,试剂稳定性较好。
3.本发明适用于全自动生化分析仪,临床使用价值大。
附图说明
图1是线性实验中本发明实施例1试剂盒的检测朗道高值质控品的实时反应曲线;
图2是线性实验中对比例试剂盒的检测朗道高值质控品实时反应曲线;
图3是本发明实施例2试剂盒的线性范围图;
图4是对比例试剂盒的线性范围图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明进行说明。
应用本发明试剂盒进行样本检测时,在样本中先加入试剂R1,试剂R1中的表面活性剂曲拉通X-100促进物质溶解,盐酸羟胺够与样本中游离的胆红素结合,进而抑制游离胆红素与过硫酸钠发生反应生成胆绿素,造成干扰;Na2-EDTA结合样本中二价金属离子形成络合物;加入试剂R2时,过硫酸钠将直接胆红素氧化成胆绿素,由此自动检测试剂R2加入前后的吸光度变化,进而求得样本中直接胆红素的浓度。
实施例1
一种新型的直接胆红素检测试剂盒,是由试剂R1和试剂R2按照4:1的体积比组成的;
所述试剂R1是由以下含量的物质组成的:
Tris-HCl酒石酸氢氧化钠缓冲液(pH5.0-6.0)0.05mol/L
丙三醇0.015mol/L
二硫苏糖醇0.005mol/L
硝酸银0.008mol/L
甲基异丁酮0.2%
曲拉通X-1000.15%
Na2-EDTA0.01g/L
盐酸羟胺0.8g/L;
所述试剂R2是由以下含量的物质组成的:
磷酸氢二钠1.0g/L
磷酸二氢钠3.0g/L
过硫酸钠0.060mol/L
Na2-EDTA0.7g/L
NaCl0.05%。
实施例2
一种新型的直接胆红素检测试剂盒,是由试剂R1和试剂R2按照4:1的体积比组成的;
所述试剂R1是由以下含量的物质组成的:
Tris-HCl酒石酸氢氧化钠缓冲液(pH5.0-6.0)0.1mol/L
丙三醇0.01mol/L
二硫苏糖醇0.01mol/L
硝酸银0.005mol/L
甲基异丁酮0.5%
曲拉通X-1000.1%
Na2-EDTA0.05g/L
盐酸羟胺0.4g/L;
所述试剂R2是由以下含量的物质组成的:
磷酸氢二钠1.5g/L
磷酸二氢钠2.5g/L
过硫酸钠0.074mol/L
Na2-EDTA0.5g/L
NaCl0.1%。
实施例3
一种新型的直接胆红素检测试剂盒,是由试剂R1和试剂R2按照4:1的体积比组成的;
所述试剂R1是由以下含量的物质组成的:
Tris-HCl酒石酸氢氧化钠缓冲液(pH5.0-6.0)0.15mol/L
丙三醇0.005mol/L
二硫苏糖醇0.015mol/L
硝酸银0.002mol/L
甲基异丁酮0.8%
曲拉通X-1000.05%
Na2-EDTA0.1g/L
盐酸羟胺0.1g/L;
所述试剂R2是由以下含量的物质组成的:
磷酸氢二钠2.0g/L
磷酸二氢钠1.5g/L
过硫酸钠0.085mol/L
Na2-EDTA0.3g/L
NaCl0.15%。
本发明:在自动操作仪器迈瑞800上进行;样本样品(以朗道质控品作为样本样品,校准品作为校准液),样本中加入R1试剂孵育5min,充分混匀然后读取此时的吸光度A1,加入试剂R2,37℃反应5min然后读取此时的吸光度R2,计算ΔA,根据公式:
直接胆红素的含量=吸光度(A2-A1)*标准液浓度
其中样本用量9μL,试剂R1为240μL,试剂R2为60μL。
线性范围实验
配置0、50、100、150、250、300、450μmol/L的直接胆红素样本,以本发明试剂盒为实验例,以市场上流通的某一国内试剂盒作为对比例,进行线性范围实验。操作方法:在自动操作仪器迈瑞800上进行;样本样品(以朗道质控品作为样本样品,校准品作为校准液),样本中加入R1试剂孵育5min,充分混匀然后读取此时的吸光度A1,加入试剂R2,37℃反应5min然后读取此时的吸光度R2,计算ΔA,根据公式:
直接胆红素的含量=吸光度(A2-A1)*标准液浓度
其中样本用量9μL,试剂R1为240μL,试剂R2为60μL。本发明检测朗道高值质控品的实时反应曲线如图1和图2所示,实验结果如表1、图3和图4所示。
表1线性范围实验结果
理论值(μmol/L) | 0 | 50 | 150 | 250 | 300 | 450 |
实验例(μmol/L) | 0.09 | 50.4 | 153.2 | 248.8 | 295.6 | 430.2 |
对比例(μmol/L) | 0.1 | 50.7 | 157.6 | 243.2 | 280 | 291.6 |
由表1可知,本发明试剂盒线性范围比对比试剂盒高出147.53%。结合图1-4得知当样本中直接胆红素的量高于300μmol/L之后,对比试剂盒不能有效的检测其浓度,线性范围较小,而本发明试剂盒有着较大的线性范围测试空间。
准确度检测
采用朗道复合纸空品(680UE)进行准确度检测,以本发明试剂盒为实验例,以市场上流通的某一国内试剂盒作为对比例,测定方法和线性实验检测方法相同,检测结果如表2所示。
表2准确度检测结果
由表2可以看出,本发明试剂盒的准确度明显高于对比例的试剂盒。
上述实验主要是针对测定朗道高值和低值质控品,除此之外,我们对大量临床样本进行测试。由于J-G重氮试剂法测的结果较为准确,我们以J-G重氮试剂法测得的结果作为一个参考标准进行对比。以J-G重氮试剂法作为参考标准,对提供的样本进行测定,小于17.1μmol/L认为低值,样本总数N=20
表3本发明试剂盒与对比试剂盒检测准确度对比结果
J-G重氮试剂法测定值(μmol/L) | 12.4 | 14.7 | 10.1 | 7.9 | 8.2 | 10.4 | 8.7 | 5.9 | 4.2 | 11.1 |
实验例测定值(μmol/L) | 12.3 | 14.8 | 10.0 | 8.1 | 8.3 | 10.6 | 8.9 | 5.8 | 4.2 | 11.0 |
对比例测定值(μmol/L) | 12.8 | 15.1 | 10.2 | 8.4 | 9.5 | 11.0 | 9.2 | 6.1 | 3.5 | 10.4 |
J-G重氮试剂法测定值(μmol/L) | 9.2 | 10.6 | 8.9 | 7.8 | 6.4 | 12.2 | 14.2 | 13.4 | 10.2 | 9.3 |
实验例测定值(μmol/L) | 9.1 | 10.4 | 9.1 | 78 | 6.6 | 12.2 | 13.9 | 13.7 | 9.5 | 9.2 |
对比例测定值(μmol/L) | 8.5 | 11.4 | 9.7 | 7.0 | 6.5 | 11.9 | 13.6 | 12.9 | 10.8 | 9.0 |
从表3可以看出,本发明试剂盒的准确度更高
抗干扰实验
以朗道校准品进行定标,以朗道复合质控品(680UE)33.9μmol/L加入不同干扰物质作为样本进行检测,以本发明试剂盒为实验例,以市场上流通的某一国内试剂盒作为对比例,测定方法和线性实验检测方法相同,检测结果如表4所示。
表4抗干扰实验检测结果
由表4可以看出,本发明试剂盒的重复性优于对比试剂盒。
Claims (4)
1.一种新型的直接胆红素检测试剂盒,其特征在于,所述直接胆红素检测试剂盒是由试剂R1和试剂R2组成的;
所述试剂R1是由以下含量的物质组成的:
Tris-HCl酒石酸氢氧化钠缓冲液0.05-0.15mol/L
丙三醇0.005-0.015mol/L
二硫苏糖醇0.005-0.015mol/L
硝酸银0.002-0.008mol/L
甲基异丁酮0.2-0.8%
曲拉通X-1000.05-0.15%
Na2-EDTA0.01-0.1g/L
盐酸羟胺0.1-0.8g/L;
所述试剂R2是由以下含量的物质组成的:
磷酸氢二钠1.0-2.0g/L
磷酸二氢钠1.5-3.0g/L
过硫酸钠0.060-0.085mol/L
Na2-EDTA0.3-0.7g/L
NaCl0.05-0.15%。
2.根据权利要求1所述的直接胆红素检测试剂盒,其特征在于,所述试剂R1是由以下含量的物质组成的:
Tris-HCl酒石酸氢氧化钠缓冲液0.1mol/L
丙三醇0.01mol/L
二硫苏糖醇0.01mol/L
硝酸银0.005mol/L
甲基异丁酮0.5%
曲拉通X-1000.1%
Na2-EDTA0.05g/L
盐酸羟胺0.4g/L;
所述试剂R2是由以下含量的物质组成的:
磷酸氢二钠1.5g/L
磷酸二氢钠2.5g/L
过硫酸钠0.074mol/L
Na2-EDTA0.5g/L
NaCl0.1%。
3.根据权利要求1或2所述的直接胆红素检测试剂盒,其特征在于,所述试剂R1和试剂R2的体积比为4:1。
4.根据权利要求1或2所述的直接胆红素检测试剂盒,其特征在于,所述Tris-HCl酒石酸氢氧化钠缓冲液的pH为5.0-6.0。
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