CN106814037B

CN106814037B - 一种亚硝酸钠法总胆红素（氧化法）检测试剂盒

Info

Publication number: CN106814037B
Application number: CN201510852256.XA
Authority: CN
Inventors: 甘宜梧; 李静; 李建营; 王绮; 包兴艳
Original assignee: Biobase Biodustry Shandong Co Ltd
Current assignee: Biobase Biodustry Shandong Co Ltd
Priority date: 2015-11-30
Filing date: 2015-11-30
Publication date: 2018-12-11
Anticipated expiration: 2035-11-30
Also published as: CN106814037A

Abstract

本发明试剂盒亚硝酸钠法总胆红素检测试剂盒，该试剂盒与目前市场上流通的氧化法试剂盒相比，其优势在于，本发明试剂盒线性范围较宽，稳定性好，与对照试剂临床相关性好。在一定程度上对氧化法检测总胆红素试剂盒进行了一种补充，也是一种完善。目前市场上流通的重氮法检测试剂盒与钒酸盐法检测试剂盒，都存在不同程度的稳定性问题，本发明试剂盒在其稳定性上具有重大突破，在线性范围范围方面有加宽趋势。

Description

一种亚硝酸钠法总胆红素（氧化法）检测试剂盒

技术领域

本发明涉及临床体外检测试剂技术领域，特别涉及到血清中总胆红素通过亚硝酸钠法（氧化法）进行检测诊断其含量。

背景技术

胆红素包含游离胆红素和直接胆红素两种：直接胆红素又可称为结合胆红素，即血液中游离胆红素运输到肝脏后，迅速被肝细胞摄取，胆红素在肝细胞胞浆中主要与Y蛋白和Z蛋白结合（以Y蛋白为主）。然后在内质网中结合葡萄糖醛酸生成水溶性结合胆红素；游离胆红素亦可以成为未结合胆红素，即没有与葡萄糖醛酸结合，未结合的胆红素主要是血红素在单核吞噬系统细胞微粒体血红素加氧酶的作用催化下，形成线性四吡咯的水溶性胆绿素，胆绿素进一步在细胞液中活性较强的胆绿素还原酶作用催化下，还原成胆红素。

目前对于直接胆红素的检测诊断方法有很多种，重氮法、高效液相色谱法（HPLC）、氧化酶法、钒酸盐法等。重氮法是历史最久，目前为止应用较广的方法，但是该方法测定直接胆红素时受到多种因素影响，结果差异性较大；高效液相色谱法（HPLC）对仪器和设备要求较高，因此不能作为常规方法使用；氧化酶法灵敏度高，抗干扰能力不是很强，主要是由于酶对温度要求极高，活性只能在一定温度范围内才能发挥最佳作用，而且该种方法试剂价格极高难于推广；钒酸盐法是上世纪90年代由日本学者提出的一种新型的氧化方法，但是该方法对仪器损伤较大，钒酸盐的氧化性高于高锰酸钾，也不利于保存

鉴于以上因素，发明了一种新型的亚硝酸钠法（氧化法）检测试剂盒。该方法是在十几中氧化剂中筛选出的一种高效的氧化剂。亚硝酸钠法原理在于在适合的缓冲液中加入特定的加速剂，使得血清中胆红素被反应介质中新生成的亚硝酸氧化成淡绿色化合物，进而引起吸光度发生变化。通过计算得出总胆红素在血清中的含量。

发明内容

本发明目的在于提供一种亚硝酸钠法氧化检测试剂盒，其特点在于本发明试剂盒，检测线性范围较宽，稳定性强，重复性好等。

基本原理

胆红素经柠檬酸缓冲液孵育后，被反应介质中生成的亚硝酸氧化为淡绿色的的化合物，在450nm波长下，通过吸光度变化来检测溶液的颜色变化，进而确定血清中胆红素的含量，血清中胆红素含量与吸光度变化成一定比例关系，反应液中颜色和胆红素含量成线性关系：

亚硝酸

直接胆红素淡绿色化合物

柠檬酸缓冲液

应用本发明改良的亚硝酸钠（氧化法）法检测诊断试剂盒测定血清中胆红素含量方法如下：检测波长为450nm，样本量:试剂R1:试剂R2=9:240:60。

本发明是一种改良的亚硝酸钠法（氧化法）体外检测诊断试剂盒，是由试剂R1和R2组成的双试剂液体型检测诊断试剂盒，其中试剂R1组成为：

柠檬酸缓冲液 0.1-0.2 mol/L (pH2.8-3.1)

十六烷基三甲基溴化铵 1-5 mmol/L

EDTA 1-10 mmol/L

Triton X-100 0.25-1ml/L

叠氮钠 0.01-0.1g/L

羟基乙叉二磷酸 5-10 mmol/L

氯化钠 0.9g/L

丙三醇 10-20%

试剂R2组成为：

亚硝酸钠 4-10 mmol/L

磷酸缓冲液 10 mmol/L（pH7.0-7.5）

EDTA-Na₂ 0.5g/L

碳酸钠 0.1-0.5g/L

Triton X-100 0.25-1ml/L

叠氮钠 0.01-0.1g/L

羟基乙叉二磷酸 5-10 mmol/L

氯化钠 0.9g/L

甘露醇 0.1-2g/L

本发明改良的亚硝酸法（氧化法）体外检测诊断试剂盒，试剂R1和试剂R2的选择依据是：

0.1-0.2 mol/L (pH2.8-3.1)柠檬酸缓冲液形成一个具有一定缓冲能力的内部环境，正是由于这个缓冲液的缓冲能力，致使试剂R2的加入对内部的的pH值产生较弱的影响，保证检测结果的准确性，如果pH值低于2.5，胆红素中的直接胆红素在孵育时即能发生反应，影响结果判断，如果pH值高于3.5之上，不利于氧化反应的进行。因此本发明控制反应pH值在2.8-3.2左右。

十六烷基三甲基溴化铵是一种阳离子去污剂，起到去除干扰的作用，保证检测结果的准确性。

EDTA及其钠盐是一种螯合剂，它可以与样本中二价金属离子结合形成络合物，降低样本中的胆红素被氧化的机率。

Triton X-100表面活性剂，不但促进样本中各物质的溶解，增大溶解性，减少样本脂溶性物质对测定结果产生影响，而且能够促进胆红素与亚硝酸钠反应。

氯化钠，增强溶液的离子强度，产生原盐效应，加快反应速率。

羟基乙叉二磷酸作为一种水质稳定剂，增强溶液储存时的稳定性。

叠氮钠作为防腐剂，防止试剂在储存过称重腐败变质，影响检测效果。

磷酸盐缓冲对，保证反应pH值不会受到较大波动，稳定试剂R2中的氧化剂的稳定性。

碳酸钠作为水溶性的碳酸盐，适当的增加了溶液中CO₃ ^2-和HCO₃ ^1-的浓度，从而抑制空气中CO₂对溶液pH值产生波动，提高检测准确性。

甘露醇和丙三醇作为保护剂和稳定剂，在很大程度上保证了试剂不受低温与高温破坏。

本发明可以应用到迪瑞、迈瑞、日立、东芝等系列的全自动化分析仪中进行自动化检测。

应用本发明进行体外样本诊断检测时，设定波长为450nm，将吸取的样本与反应杯中，然后加上试剂R1进行孵育。试剂R1中的表面活性剂Triton X-100促进物质溶解，EDTA螯合样本中的二价金属离子，十六万级溴化铵去除杂质离子保证后续反应正常进行，柠檬酸缓冲液提供具有稳定pH值的反应环境。加入试剂R2时，亚硝酸钠首先反应生产亚硝酸，亚硝酸进而将样本中的胆红素氧化为淡绿色的化合物，继而引起450nm波长下的吸光度变化。通过计算吸光度变化求出样本中胆红素的含量。

本发明是一种改良的亚硝酸钠法（氧化法）体外诊断检测试剂盒，测定方法如下所述：样本样品（或者是朗道质控品1005UN），朗道复合校准品938UN作为校准品，样本中加入R1试剂孵育5min，充分混匀然后读取此时的吸光度A1，加入试剂R2，37℃反应5min然后读取此时的吸光度R2，计算ΔA，根据公式：

直接胆红素的含量=吸光度（A2-A1）*标准液浓度

其中样本用量9μL，试剂R1为240-270μL，试剂R2为40-60μL。

和市场上目前流通的直接胆红素检测试剂盒相比，本发明的试剂盒，对于0-700μM范围内样本的测量准确度较好，精密度高，重复性好，抗干扰能力强，试剂稳定性较好，适用于全自动生化分析仪，临床使用价值较大。

附图说明

图1本发明试剂盒与对比试剂盒相关性。

具体实施方式

以下结合表，实施例对本发明进行说明

实施例1

本发明在具体实施中，所述的试剂R1为：

柠檬酸缓冲液 0.1mol/L（pH2.8）

Triton X-100 0.3ml/L

EDTA 1mmol/L

十六烷基三甲基溴化铵 3mmol/L

羟基乙叉二膦酸 10mmol/L

氯化钠 9g/L

叠氮钠 0.05g/L

丙三醇 10%

试剂R2为：

亚硝酸钠 4 mmol/L

磷酸缓冲液 10 mmol/L（pH7.0-7.5）

EDTA-Na₂ 0.5g/L

碳酸钠 0.5g/L

Triton X-100 1ml/L

叠氮钠 0.05g/L

羟基乙叉二磷酸 10 mmol/L

氯化钠 0.9g/L

甘露醇 2g/L

实施例2

试剂R1为：

柠檬酸缓冲液 0.2mol/L（pH2.8）

Triton X-100 0.5ml/L

EDTA 1mmol/L

十六烷基三甲基溴化铵 5mmol/L

羟基乙叉二膦酸 10mmol/L

氯化钠 9g/L

叠氮钠 0.05g/L

丙三醇 10%

试剂R2为：

亚硝酸钠7 mmol/L

磷酸缓冲液 10 mmol/L（pH7.2）

EDTA-Na₂ 0.5g/L

碳酸钠 0.5g/L

Triton X-100 1ml/L

叠氮钠 0.05g/L

羟基乙叉二磷酸 10 mmol/L

氯化钠 0.9g/L

甘露醇 1.5g/L

实施例3

试剂R1为：

柠檬酸缓冲液 0.2mol/L（pH3.0）

Triton X-100 0.4ml/L

EDTA 1mmol/L

羟基乙叉二膦酸 10mmol/L

氯化钠 9g/L

叠氮钠 0.05g/L

丙三醇 15%

试剂R2为：

亚硝酸钠 10mmol/L

磷酸缓冲液 10 mmol/L（pH7.0）

EDTA-Na₂ 0.5g/L

碳酸钠 0.5g/L

Triton X-100 1ml/L

叠氮钠 0.05g/L

羟基乙叉二磷酸 10 mmol/L

氯化钠 0.9g/L

甘露醇 1.0g/L

本发明试剂盒性能检测试验：

重复性实验

用本发明试剂盒与市场上流通的氧化法检测试剂盒进行对比，以朗道938UN为校准品进行校准，朗道1005UN质控品作为样本进行重复性检测，使用仪器为全自动生化分析仪BS-800。本发明试剂盒采用实施例1配方进行配制。结果如表1所示：

表1为本发明试剂盒与对比试剂盒重复性比较

从表1以看出，本发明试剂盒的准确度较高

线性范围实验

从苏州亚科公司购买胆红素纯品，用三氯甲烷溶解胆红素纯品配制成800μmol/L的胆红素纯品，用三氯甲烷等倍稀释成0、100、200、400、800μmol/L的胆红素样本，分别用本发明试剂盒和市场上流通的某一国内试剂盒进行对比，本发明试剂盒采用实施例2配方进行配置，使用仪器为全自动生化分析仪BS-800。结果如表2所示：

表2本发明与对比试剂盒线性实验结果

理论值（μmol/L）	0	100	200	400	800
						本发明试剂盒（μmol/L）	0.09	100.4	203.2	410.8	760.6
对比试剂盒（μmol/L）	0.1	100.7	199.6	412.2	680.5

从表2中看出，本发明试剂盒线性范围为0-760μmol/L，比对比试剂盒高出11.78%。当样本中直接胆红素的量高于700μmol/L之后，对比试剂盒不能有效的检测其浓度，线性范围较小。由此可以看出本发明试剂盒有着较大的线性范围测试空间。

临床样本检测实验

本发明试剂盒同对比试剂盒对随进N=40个样本进行测试，测试结果以表格的形式在下表进行体现，通过该表格3录的数值，进而计算出，本发明试剂盒与市场流通的试剂盒的相关性。本发明试剂盒采用实施例2配方进行配置，检测结果如表3所示：

表3为本发明试剂盒与对比试剂盒临床检测相关实验结果

结合表3和附图1说明本发明试剂盒和对比试剂盒相关性r=0.995741。

准确度实验

采用朗道复合纸空品（680UE）进行准确度检测，结果如表4所示：从表中可以明显看出，本发明试剂盒的准确度明显高于对比试剂盒。本发明试剂盒采用实施例2配方，对照试剂盒为市场流通氧化法总胆红素检测试剂盒。检测结果如表4所示：

表4本发明试剂盒与对比试剂盒准确度比较

由表4可以看出本发明试剂盒的准确度较对比试剂盒偏高。

稳定性实验

购买市场上流通的总胆红素检测试剂盒与本发明试剂盒进行比较,组要是比较二者在不同温度条件下储存一定时间后是否受到影响。本发明试剂盒采用实施例3的配方进行配制。使用仪器为全自动生化分析仪BS-800，检测结果如表5所示：

表5不同温度条件对本发明试剂盒与对照试剂盒影响

通过表5可以明显的看出，本发明试剂盒和对照试剂盒在低温条件下都可以在保证检测结果准确的前提下储存很长时间，但是在37℃和75℃条件下，本发明试剂盒优于对照试剂盒。高温条件下15天以内本发明试剂盒是不会对检测结果产生偏差和影响的，37℃条件下本发明试剂盒在一个月内是不会对检测结果产生影响；与对照试剂相比优势更加明显。但是不得不说明高温条件对试剂的破坏性较强，应避免试剂长时间暴露于高温条件下。

综上所述本发明试剂盒——改良的亚硝酸钠（氧化法）法体外检测诊断试剂盒在氧化法胆红素检测试剂盒的方法学进一步完善。扩大了其线性范围，试剂长期稳定，成本较低，对仪器不会产生腐蚀影响，操作方便，对环境几乎没有污染，可行性强，经济和社会效益巨大，是测定总胆红素试剂上的一种创新。

Claims

1.亚硝酸钠法总胆红素检测诊断试剂盒：其特征在于，由试剂R1、R2和校准品组成；其中R1由0.1-0.2mol/L的pH为2.8-3.1的柠檬酸缓冲液、1-5mmol/L的十六烷基三甲基溴化铵、1-10mmol/L的EDTA、9g/L的氯化钠、0.25-1ml/L的Triton X-100、0.01-0.1g/L的叠氮钠、5-10mmol/L的羟基乙叉二磷酸和10-20％的丙三醇组成；试剂R2由10mmol/L的pH7.0-7.5的磷酸缓冲液、0.5g/L的EDTA-Na₂、0.1-0.5g/L的碳酸钠、4-10mmol/L的亚硝酸钠、0.9g/L的氯化钠、0.25-1ml/L的Triton X-100、0.01-0.1g/L的叠氮钠、5-10mmol/L的羟基乙叉二磷酸和0.1-2g/L的甘露醇组成；所述试剂中试剂R1和试剂R2的比例为R1:R2＝240:60。