CN110261625A

CN110261625A - 一种胆红素复合检测试剂盒及其使用方法

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Publication number: CN110261625A
Application number: CN201910637159.7A
Authority: CN
Inventors: 李宗祥; 李志平
Original assignee: Sinocare Inc
Current assignee: Sinocare Inc
Priority date: 2019-07-15
Filing date: 2019-07-15
Publication date: 2019-09-20

Abstract

本申请提供一种胆红素复合检测试剂盒，包括试剂R1、试剂R2、以及试剂R3；所述试剂R1包括：第一酸性缓冲体系，对氨基苯磺酸；所述试剂R2包括：亚硝酸钠；所述试剂R3包括：加速剂，所述加速剂用于破坏间接胆红素的氢键。使用过程中，该试剂盒可根据不同的测试需要配制成直接胆红素检测工作液和总胆红素检测工作液，既可以用于直接胆红素、间接胆红素的测定，也可以用于总胆红素的测定。既方便了临床使用，也可为重氮法检测胆红素提供新的资料。

Description

一种胆红素复合检测试剂盒及其使用方法

技术领域

本发明涉及临床体外检测试剂技术领域，特别涉及一种胆红素复合检测试剂盒及其使用方法。

背景技术

胆红素是血红蛋白和血红素蛋白中血红分子的降解代谢产物，主要包含间接胆红素和直接胆红素两种。间接胆红素是指不与葡糖醛酸结合的胆红素。间接胆红素难溶于水，不能通过肾随尿排出。间接胆红素在肝细胞内转化，与葡萄糖醛酸结合形成直接胆红素。直接胆红素溶于水，能通过肾随尿排出体外。由于胆红素对肝功能的测定，尤其是黄疸的鉴别意义重大，所以一直是临床医学古老而又重要的课题，目前更是成为临床生化实验室中常做的项目之一。

目前对于胆红素的检测诊断方法有很多种，主要包括重氮法、高效液相色谱法(HPLC)、氧化酶法、以及钒酸盐法。其中，重氮法是最早使用的一种检测方法，具有成本低、应用广的特点，但传统的重氮法受多种因素的影响，其结果差异性较大；高效液相色谱法(HPLC)对仪器和设备要求较高，因此不宜作为常规方法推广使用；氧化酶法灵敏度高，抗干扰能力不强，主要是由于酶对温度要求极高，活性只能在一定温度范围内才能发挥最佳作用，而且该种方法试剂价格极高难于推广；钒酸盐法是上世纪90年代由日本学者提出的一种新型的氧化方法，但是该方法对仪器损伤较大，钒酸盐的氧化性高于高锰酸钾，也不利于保存。

针对上述问题，虽然市面上出现了很多方便用于胆红素检测的试剂盒，但是这些检测试剂盒多为一对一的单项检测(只检测直接胆红素或只检测总胆红素)，很少有能够同时检测直接胆红素、间接胆红素、以及总胆红素的复合检测试剂盒。相较于一对一的单项检测试剂盒而言，三项联检更能提高诊断的效率以及准确率。

因此如何提供一种胆红素复合检测试剂盒，已经成为本领域亟待解决的技术问题。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种胆红素复合检测试剂盒及其使用方法，进行胆红素测定时，该试剂盒可根据不同的测试需要配制成直接胆红素检测工作液和总胆红素检测工作液，既可以用于直接胆红素、间接胆红素的测定，也可以用于总胆红素的测定。既方便了临床使用，也可为重氮法检测胆红素提供新的资料。

本发明所述的一种胆红素复合检测试剂盒，包括试剂R1、试剂R2、以及试剂R3；

所述试剂R1包括：第一酸性缓冲体系，对氨基苯磺酸；

所述试剂R2包括：亚硝酸钠；

所述试剂R3包括：加速剂，所述加速剂用于破坏间接胆红素的氢键。

其中，第一酸性缓冲体系的作用在于为反应提供酸性环境，保证反应时外环境的稳定，确保检测结果不会受到波动和影响；对氨基苯磺酸，作为反应底物参与反应，为重氮反应提供重氮组分，与重氮化剂反应生成重氮化试剂；亚硝酸钠，作为重氮化剂参与反应，在酸性条件下与对氨基苯磺酸反应生成重氮化试剂；加速剂，可破坏间接胆红素的氢键，使得其参与重氮反应，确保测试值为总胆红素。

使用过程中，将试剂R1与试剂R2混合即可配制出直接胆红素检测工作液；将试剂R1、试剂R2、以及试剂R3三者混合即可配制出总胆红素检测工作液；通过直接胆红素与总胆红素的测定，可以进一步实现间接胆红素的测定。

由于对氨基苯磺酸与亚硝酸钠的浓度会直接影响反应生成的重氮化试剂的含量，进而影响胆红素测试的准确性。因此，配置过程中应严格控制对氨基苯磺酸以及亚硝酸钠的浓度。当上述两个反应底物的浓度过低时，会使得重氮反应不完全，无法实现高浓度胆红素的检测；而浓度过高则会出现反应底物不能完全溶解的问题。

优选的，所述第一酸性缓冲体系的pH值为1.0-4.0，所述对氨基苯磺酸的浓度为20-60mmol/L，所述亚硝酸钠的浓度为100-200mmol/L，所述加速剂的浓度为2-10mmol/L。另外，由于重氮盐容易分解，只有在过量的酸液中才比较稳定，所以在重氮化反应过程中,酸需要适当过量。

按重氮化反应方程式，1摩尔氨基重氮化需要1摩尔的亚硝酸钠。重氮化反应进行时，自始至终必须保持亚硝酸钠稍微过量，否则会引起自偶合反应。但是，过量的亚硝酸对下一步偶合也不利，会使偶合组分亚硝化或发生其他反应。所以，为了保证反应的正常进行以及反应产物的稳定性，需严格控制试剂R1与试剂R2的混合比例。

优选的，所述第一酸性缓冲体系为甘氨酸-盐酸缓冲液、三羟基氨基甲烷缓冲液(Tris-HCl)、柠檬酸钠-乳酸缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液中的一种。

优选的，所述第一酸性缓冲体系的pH值为1.0-2.0；更为优选pH值为1.5。

优选的，所述第一酸性缓冲体系的浓度为50-200mmol/L。

优选的，所述加速剂为二甲亚砜、Tween、咖啡因、苯甲酸钠、脂肪醇聚氧乙烯醚、聚氧乙烯月桂醚中的一种或几种。

为了进一步提高复合检测试剂盒的抗干扰能力，延长其使用寿命，降低试剂在运输及储存过程中因环境因素引起的不稳定性。可以在试剂中加入稳定剂、螯合剂、或者第一防腐剂。

其中，螯合剂能有效的螯合金属离子，防止一些杂质离子对检测反应引起不必要的干扰，增强溶液储存时的稳定性；稳定剂可以提高试剂的热稳定性及长期稳定性；第一防腐剂能够防止试剂在储存过程中腐败变质。

作为优选，所述试剂R1还包括稳定剂、螯合剂中的一种或两种；

优选的，所述试剂R2还包括与所述稳定剂；

优选的，所述试剂R3还包括第一防腐剂。

优选的，所述螯合剂的浓度为0.02-0.2％。

优选的，所述稳定剂包括醇类、表面活性剂、第二防腐剂、pH稳定剂中的一种或几种。

其中，第二防腐剂的加入可以避免微生物对液态试剂造成污染，防止试剂在储存过程中腐败变质；pH稳定剂的加入能够稳定整个反应环境的酸性条件，减小空气中CO₂对pH值的影响，稳定水质；表面活性剂的加入不仅能够促进样本中各物质的溶解，提高样本的溶解性，减少样本中脂溶性物质对测定结果产生的不良影响，同时，还能进一步破坏间接胆红素的氢键，促进间接胆红素与重氮试剂之间的反应；醇类的加入可以与其他成分一起组成复合稳定剂，进一步保证试剂的温度敏感性，拓宽试剂的测试环境温度，增强试剂存储时稳定性。

优选的，所述螯合剂为EGTA、EDTA、羟基乙叉二膦酸中的一种或几种；

优选的，所述第一防腐剂为PC300、叠氮钠、山梨酸钾、Krovin300M中的一种或几种。

优选的，所述醇类的浓度为0.2-1.0％，和/或，所述表面活性剂的浓度为 0.05-0.2％，和/或，所述pH稳定剂的浓度为0.25-1.0g/L。

优选的，所述醇类为多羟基小分子醇。

优选的，所述多羟基小分子醇为三碳多元醇至九碳多元醇；例如甘露醇、丙三醇等。

优选的，所述表面活性剂为Tx-100、Tx-405、吐温-20、吐温-80中的一种或几种。

优选的，所述第二防腐剂为PC300、叠氮钠、山梨酸钾、Krovin300M中的一种或几种。

优选的，所述pH稳定剂为碳酸钠、碳酸氢钠中的一种或两种。

除此之外，本发明还提供上文所述的任一种胆红素复合检测试剂盒的使用方法，该方法在于，使用过程中，试剂R3可以依据待测目标的种类选择性的加入。

进行直接胆红素的测定时，将所述试剂R1与所述试剂R2混合使用；

进行总胆红素的测定时，将所述试剂R1、所述试剂R2、以及试剂R3混合使用。

优选的，进行直接胆红素的测定时，将所述试剂R1与所述试剂R2以 2:1-5:1的比例混合；

进行总胆红素的测定时，将所述试剂R1、所述试剂R2、以及试剂R3以 2:1:1-5:1:1的比例混合。

优选的，进行直接胆红素的测定时，，将所述试剂R1与所述试剂R2以 3:1的比例混合；

进行总胆红素的测定时，将所述试剂R1、所述试剂R2、以及试剂R3以3:1:1的比例混合。

本发明提供的胆红素复合检测试剂盒包括试剂R1、试剂R2、以及试剂 R3。其中，试剂R1包括第一酸性缓冲体系以及对氨基苯磺酸；试剂R2包括亚硝酸钠；试剂R3包括加速剂。本发明提供的试剂盒的反应原理为：酸性条件下，对氨基苯磺酸与亚硝酸钠混合后迅速生成氯化重氮盐苯磺酸，可用于直接胆红素检测，加入试剂R3后，间接胆红素在加速剂的作用下，也可与氯化重氮苯磺酸反应生成偶氮胆红素，从而用于总胆红素的检测。

本发明提供的胆红素复合检测试剂盒，由于同时包括试剂R1、试剂R2、以及试剂R3，因此，在进行胆红素测定的过程中，可以根据不同的测定需求配制成直接胆红素检测工作液和总胆红素检测工作液，既可以用于直接胆红素、间接胆红素的测定，也可以用于总胆红素的测定。既方便了临床使用，也可为重氮法检测胆红素提供新的资料，其准确度高，重复性好，抗干扰能力强，临床使用价值较大。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合具体实施例对本申请进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本申请保护的范围。

实施例1

本实施例1提供的一种胆红素复合检测试剂盒包括：

试剂R1：甘氨酸-盐酸缓冲液：50mmol/L、对氨基苯磺酸：40mmol/L、羟基乙叉二膦酸：0.02％、PC300：1mL/L；

试剂R2：亚硝酸钠：150mmol/L、PC300：1mL/L；

试剂R3：二甲亚砜：6mmol/L、PC300：1mL/L。

使用时，将试剂R1与试剂R2以3:1的比例混合，用于直接胆红素的检测；

将试剂R1、试剂R2、试剂R3以3:1:1的比例混合，用于总胆红素的检测。

实施例2

本实施例2提供的一种胆红素复合检测试剂盒包括：

试剂R1：甘氨酸-盐酸缓冲液：50mmol/L、对氨基苯磺酸：40mmol/L、异丙醇：0.5％、Tx-100：0.1％、PC300：1mL/L、羟基乙叉二磷酸：0.2％；

试剂R2：亚硝酸钠：150mmol/L、PC300：1mL/L；

试剂R3：二甲亚砜：6mmol/L、PC300：1mL/L。

实施例3：胆红素复合检测试剂盒的性能检测

分别将实施例1和实施例2中的R1：R2＝3:1混合用于直接胆红素的检测，将实施例1和实施例2中的R1:R2:R3＝3:1:1混合用于总胆红素的检测。将上述混合好的试剂用迈瑞BS390全自动生化分析仪对从迈瑞购买的质控血清 (正常水平质控血清直接胆红素靶值：12.4-16.8μmol/L，病理水平质控血清直接胆红素靶值：37.9-51.5μmol/L，正常水平质控血清总胆红素靶值：14.2-19.0 umol/L，病理水平质控血清总胆红素靶值：59.7-80.9umol/L)进行测试。具体地，将实施例1和实施例2制备的胆红素试剂在37℃条件下保存，每隔1 天取样一次，检测7天内试剂的稳定性，结果见表1：

表1.稳定性测试结果

由上表可知，通过调整试剂R1、试剂R2、以及试剂R3的比例，本发明实施例提供的胆红素复合检测试剂盒不仅可以用于直接胆红素的检测，还可以用于总胆红素的检测。而且，在试剂中加入一定量的稳定剂后，试剂的稳定性得到了明显的提升，实施例1的试剂在37℃放置3天后即出现测试值偏低的现象，而实施例2中的试剂测试7天后结果仍然稳定。

实施例4

本实施例4提供的一种胆红素复合检测试剂盒包括：

试剂R1：乙酸-乙酸钠缓冲液：100mmol/L、对氨基苯磺酸：60mmol/L、丙三醇：1％、吐温-20：0.2％、山梨酸钾：0.2％、EDTA：0.1％；

试剂R2：亚硝酸钠：200mmol/L、PC300：2mL/L；

试剂R3：脂肪醇聚氧乙烯醚：10mmol/L、叠氮钠：0.2％。

使用时，将试剂R1与试剂R2以2:1的比例混合，用于直接胆红素的检测；

将试剂R1、试剂R2、试剂R3以2:1:1的比例混合，用于总胆红素的检测。

实施例5

本实施例5提供的一种胆红素复合检测试剂盒包括：

试剂R1：柠檬酸钠-乳酸缓冲液：150mmol/L、对氨基苯磺酸：20mmol/L、丙三醇+甘露醇：0.2％、吐温-80：0.05％、山梨酸钾+叠氮钠：0.5％、EGTA： 0.05％；

试剂R2：亚硝酸钠：100mmol/L、Krovin300M：0.5mL/L；

试剂R3：咖啡因：2mmol/L、Krovin300M：1mL/L。

使用时，将试剂R1与试剂R2以5:1的比例混合，用于直接胆红素的检测；

将试剂R1、试剂R2、试剂R3以5:1:1的比例混合，用于总胆红素的检测。

实施例6

本实施例6提供的一种胆红素复合检测试剂盒包括：

试剂R1：柠檬酸钠-乳酸缓冲液：60mmol/L、对氨基苯磺酸：50mmol/L、丙三醇+甘露醇：0.2％、吐温-80+吐温-20：0.1％、山梨酸钾+叠氮钠：2％、 EGTA+EDTA：0.15％；

试剂R2：亚硝酸钠：150mmol/L、PC300：2mL/L；

试剂R3：咖啡因+苯甲酸钠：5mmol/L、Krovin300M：1mL/L。

使用时，将试剂R1与试剂R2以4:1的比例混合，用于直接胆红素的检测；

将试剂R1、试剂R2、试剂R3以4:1:1的比例混合，用于总胆红素的检测。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims

1.一种胆红素复合检测试剂盒，其特征在于，包括试剂R1、试剂R2、以及试剂R3；

所述试剂R1包括：第一酸性缓冲体系，对氨基苯磺酸；

所述试剂R2包括：亚硝酸钠；

2.根据权利要求1所述的胆红素复合检测试剂盒，其特征在于，

所述第一酸性缓冲体系的pH值为1.0-4.0，所述对氨基苯磺酸的浓度为20-60mmol/L，所述亚硝酸钠的浓度为100-200mmol/L，所述加速剂的浓度为2-10mmol/L。

3.根据权利要求1所述的胆红素复合检测试剂盒，其特征在于，所述第一酸性缓冲体系为甘氨酸-盐酸缓冲液、三羟基氨基甲烷缓冲液(Tris-HCl)、柠檬酸钠-乳酸缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液中的一种。

4.根据权利要求1所述的胆红素复合检测试剂盒，其特征在于，所述加速剂为二甲亚砜、Tween、咖啡因、苯甲酸钠、脂肪醇聚氧乙烯醚、聚氧乙烯月桂醚中的一种或几种。

5.根据权利要求1所述的胆红素复合检测试剂盒，其特征在于：

所述试剂R1还包括稳定剂、螯合剂中的一种或两种；

和/或，所述试剂R2还包括所述稳定剂；

和/或，所述试剂R3还包括第一防腐剂。

6.根据权利要求5所述的胆红素复合检测试剂盒，其特征在于：

所述稳定剂包括醇类、表面活性剂、第二防腐剂、pH稳定剂中的一种或几种；

和/或，所述螯合剂为EGTA、EDTA、羟基乙叉二膦酸中的一种或几种；

和/或，所述第一防腐剂为PC300、叠氮钠、山梨酸钾、Krovin300M中的一种或几种。

7.根据权利要求6所述的胆红素复合检测试剂盒，其特征在于，所述醇类的浓度为0.2-1.0％，和/或，所述表面活性剂的浓度为0.05-0.2％，和/或，所述pH稳定剂的浓度为0.25-1.0g/L。

8.根据权利要求6所述的胆红素复合检测试剂盒，其特征在于：

所述醇类为多羟基小分子醇；

和/或，所述表面活性剂为Tx-100、Tx-405、吐温-20、吐温-80中的一种或几种；

和/或，所述第二防腐剂为PC300、叠氮钠、山梨酸钾、Krovin300M中的一种或几种；

和/或，所述pH稳定剂为碳酸钠、碳酸氢钠中的一种或两种。

9.一种权利要求1至8中任一项所述的胆红素复合检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：

进行总胆红素的测定时，将所述试剂R1、所述试剂R2、以及所述试剂R3混合使用。

10.根据权利要求9所述的胆红素复合检测试剂盒，其特征在于，

进行直接胆红素的测定时，将所述试剂R1与所述试剂R2以2:1-5:1的比例混合；

进行总胆红素的测定时，将所述试剂R1、所述试剂R2、以及所述试剂R3以2:1:1-5:1:1的比例混合。