CN1155583A - 胆红素的定量方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及含有临床检查中有用的胆红素的生物体试样中的胆红素定量方法及定量用试剂组合物。该定量方法是使含有胆红素的生物体试样与抗坏血酸氧化酶反应，将胆红素氧化，利用光学方法测定由此产生的胆红素的量的变化，该定量方法的特征在于在反应促进化合物的存在下使抗坏血酸氧化酶起作用。本发明涉及的胆红素定量用试剂组合物含有反应促进化合物及抗坏血酸氧化酶。

Description

胆红素的定量方法

本发明涉及将临床检查上有用的胆红素利用酶进行定量的方法及定量用试剂组合物。

胆红素是血红素的生理代谢产物，是在胆汁中存在最多的色素。在血清中存在直接型胆红素及间接型胆红素，将它们分别定量在临床检查上非常重要，从很久以前就开始实行了。先前，在临床检查中测定的胆红素是总胆红素与直接型胆红素，再由它们之间的差求出间接型胆红素。

作为胆红素的化学定量方法，已知有将由胆红素与重氮试剂反应生成偶氮胆红素，然后进行比色定量的方法。但是该方法的操作烦杂，重氮试剂与被检液体中存在的胆红素以外的生物成分反应，因此存在缺乏准确性的问题。

另一方面，作为使用酶定量胆红素方法，已知有将胆红素用由菌种得到的胆红素氧化酶氧化，测定此时吸光度减少的方法(特开昭56-27656号公报)，及使用由Myrothecium属的微生物得到的胆红素氧化酶测定胆红素的吸光度减少的定量方法(特开昭57-159487号公报)。另外，在特开昭59-17999号公报中报告了使用从胆红素氧化酶、抗坏血酸氧化酶、虫漆酶及酪氨酸酶组成的组中选择的酶，同时并用从表面活性剂、芳香族羧酸、磺胺剂及蛋白酶组成的组中选择的化合物作为反应促进物质，对总胆红素及间接型胆红素进行定量的方法。

在使用酶定量胆红素的方法中，因为胆红素氧化酶的稳定性差，是冷冻干燥品，所以必须在测定前调制试剂，另外还具有调制后可使用期间短的缺点。在使用抗坏血酸氧化酶等胆红素氧化酶以外的氧化酶的情况下，几乎没有胆红素的氧化反应，而且即使添加已知的反应促进物质，也不会促进氧化反应。

本发明提供一种胆红素的测定方法及稳定的定量用试剂组合物，该方法通过将稳定性高的抗坏血酸氧化酶与具有优良的反应促进效果的化合物配合使用，可以迅速而且准确地测定胆红素。

本发明涉及的胆红素的定量方法，是在水性介质中使含有胆红素的试样与抗坏血酸氧化酶反应，将胆红素氧化，利用光学方法测定由此生成的胆红素的量的变化，从而对试样中的胆红素进行定量，该方法的特征在于在反应促进化合物的存在下使抗坏血酸氧化酶起作用，上述反应促进化合物是从下列化合物组成的组中选择的，这些化合物包括：被至少2个相同或不同、取代或非取代氨基或羟基取代的取代芳香族烃；被至少2个相同或不同、取代或非取代氨基或羟基取代的取代芳香族杂环化合物；以及有机铁化合物。

另外，本发明涉及一种胆红素定量用试剂组合物，该组合物中含有反应促进化合物及抗坏血酸氧化酶，其中反应促进化合物是从下列化合物组成的组中选择的，这些化合物包括：被至少2个相同或不同、取代或非取代氨基或羟基取代的取代芳香族烃；被至少2个相同或不同、取代或非取代氨基或羟基取代的取代芳香族杂环化合物；及有机铁化合物。

本发明中，只说胆红素时是指间接型胆红素、直接型胆红素或总胆红素中的任意一种。间接型胆红素是指游离型胆红素，直接型胆红素是指间接型胆红素的羧基的单或二葡糖苷。总胆红素是指间接型胆红素与直接型胆红素之和。

水性介质是指含有缓冲液、生理盐水等的液体，但优选缓冲液。

缓冲液可以使用公知的任何一种缓冲液，但可以根据测定对象是直接型胆红素还是总胆红素来选用PH范围不同的物质。即，通过改变反应液的PH，可以分别定量直接型胆红素与总胆红素，由总胆红素与直接型胆红素之差求出间接型胆红素。缓冲液的浓度优选1mM～1μM，更优选10～200mM。

在测定直接型胆红素时，优选使用PH2.0～4.5、更优选PH2.5～4.0缓冲液，例如有乳酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、醋酸缓冲液、琥珀酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、3，3-二甲基戊二酸缓冲液等。该反应液的PH范围成为间接型胆红素实质上不被氧化的条件，可以测定直接型胆红素。

另一方面，总胆红素的测定优选使用PH5.0～12.0、更优选PH6.5～9.5的缓冲液，例如有乳酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、醋酸缓冲液、琥珀酸缓冲液、苯二酸缓冲液、磷酸缓冲液、三乙醇胺缓冲液、二乙醇胺缓冲液、硼酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、巴比土酸缓冲液及三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液。该反应液的PH范围成为直接型胆红素及间接型胆红素实质上被氧化的条件，可以测定总胆红素。

含有胆红素的试样是指混合在水性介质中的生物试样，例如血浆、血清、尿等。

本发明中的抗坏血酸氧化酶是指属于酶序号[EC 1.10.3.3]中的酶，含有从动物、植物或微生物中采取的抗坏血酸氧化酶或将该酶利用基因工程方法改造得到的酶。该酶氧化胆红素的活性非常低，作为胆红素氧化酶并不实用，但在反应促进化合物的存在下其活性变得非常高，可以作为将胆红素实质上氧化的酶使用。

抗坏血酸氧化酶的浓度优选为5～1000U/ml，更优选10～500U/ml。

作为本发明中使用的反应促进化合物例如有以下各化合物：被至少2个相同或不同、取代或非取代氨基或羟基取代的取代芳香族烃；被至少2个相同或不同、取代或非取代氨基或羟基取代的取代芳香族杂环化合物；以及有机铁化合物。

作为芳香族烃例如有苯、萘、蒽、菲、芘等，优选使用苯、萘或蒽，更优选苯或萘。

作为芳香族杂环化合物，例如有吡啶、吡嗪、嘧啶、哒嗪、喹啉、异喹啉、喹喔啉、喹唑啉、噌啉、酞嗪、萘啶、吲哚、吖啶等含氮芳香族杂环化合物，优选使用吡啶、吡嗪、嘧啶、哒嗪、喹啉、异喹啉、喹喔啉、喹唑啉、噌啉、酞嗪或萘啶，更优选使用喹啉。

取代氨基的取代基，可以相同或不同，取代数为1～2，例如为取代或非取代的烷基、烷氧基、酰基、链烯基、取代或非取代的芳基或取代或非取代的芳香族杂环基等，优选取代或非取代烷基。

取代或非取代烷基及烷氧基中的烷基部分是直链或支链的碳原子数1～10的烷基，更优选碳原子数1～6的烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、新戊基、己基、庚基、辛基、壬基癸基等。

酰基为直链或支链的碳原子数1～6的酰基，例如甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、戊酰基、异戊酰基、三甲基乙酰基等，或芳酰基例如苯甲酰基、萘甲酰基等。

链烯基例如有直链或支链的碳原子数2～6的乙烯基、烯丙基、2-丁烯基、2-戊烯基、2-己烯基等。

芳基例如有苯基、萘基等，作为芳香族杂环基例如有吡啶基、嘧啶基、喹啉基、咪唑基、三唑基、呋喃基、噻嗯基、吡唑基、噻唑基、噁唑基、噁二唑基等。

取代烷基的取代基可以相同也可以不同，取代数为1～3，例如有烷氧基、酰基、芳基、羟基、羧基、磺基、磷基、卤素等。其中烷氧基、酰基、芳基与上述含义相同，卤素包括氧、氯、溴、碘的各原子。

取代芳基及取代芳香族杂环基的取代基可以相同也可以不同，取代数为1～3，例如有烷基、烷氧基、酰基、卤素、羧基、烷氧羰基、氰基、氨基等，其中烷基、烷氧基、酰基、卤素与上述含义相同，烷氧羰基的烷基部分与上述的烷基含义相同。

另外，作为取代芳香族烃及取代芳香族杂环的取代基，也可以被上述的至少2个相同或不同、取代或非取代的氨基或羟基以外的取代基取代，作为该取代基例如是相同或不同的取代数为1～4的卤素及取代或非取代的烷基，其中卤素、取代或非取代的烷基与上述含义相同。

有机铁化合物例如有六氰合铁酸盐、二茂铁类、铁螯合物等。

六氰合铁酸包括六氰含铁(II)酸及六氰含铁(III)酸，作为形成盐的碱有铵离子、金属离子等，金属离子例如有锂、钠、钾等碱金属离子，镁、钙等碱土金属离子，铝或锌离子等。

二茂铁类是指二茂铁及带有取代基的二茂铁。取代基有酰基、取代或非取代烷基、酰基，取代或非取代烷基与上述含义相同。

铁螯合物是指螯合化合物与铁结合形成的。螯合化合物如果是配位铁的物质则可以使用公知的物质，例如可以使用卟啉环、多氨基羧酸、醇酸等。

本发明中特别优选的反应促进化合物例如有，以通式(I)表示的化合物，

(式中，R¹为羟基或取代或非取代氨基，R²、R³相同或不同，表示卤素或取代或非取代的烷基，R⁴及R⁵相同或不同，表示氢原子或取代或非取代的烷基)

及以通式(II)表示的化合物，

(式中，R⁶、R⁷、R⁸及R⁹相同或不同，至少2个取代基表示取代或非取代氨基或羟基，其他的取代基表示氢原子、卤素、羟基、取代或非取代氨基或取代或非取代烷基，J表示CH或N)。

卤素、取代或非取代氨基、取代或非取代烷基与上述含义相同。

作为反应促进化合物的具体例，例如有芳香族烃为苯环的化合物，如4-氨基-2，6-二溴苯酚、2，6-二溴-4-甲胺基苯酚、2，6-二溴-4-二甲胺基苯酚、2，6-二溴-4-磺基丙胺基苯酚、4-氨基-2，6-二氯苯酚、2，6-二氯-4-甲胺基苯酚、2，6-二氯-4-二甲胺基苯酚、2，6-二氯-4-磺基丙胺基苯酚、4-氨基-2，6-二碘苯酚、2，6-二碘-4-甲胺基苯酚、2，6-二碘-4-二甲胺基苯酚、2，6-二碘-4-磺基丙胺基苯酚、4，5-二甲基-1，2-苯二胺、2，5-二甲基-1，4-苯二胺、4，5-二甲基-1，2-苯二胺、2，5-二甲基-1，4-苯二胺、N，N-二甲基-1，4-苯二胺，N，N-二乙基-1，4-苯二胺等。

作为芳香族烃为萘环的化合物，例如有1，4-萘酚、1，6-萘酚、4-氨基-1-萘酚、5-氨基-1-萘酚、1-氨基-2-萘酚等。

作为芳香族杂环为喹啉环的化合物，例如有5-氨基-8-羟基喹啉、5，8-二氨基喹啉、5，8-二羟基喹啉等。

有机铁化合物，作为六氰合铁酸盐，例如有亚铁氰化钾、亚铁氰化钠、亚铁氰化镁、氰亚铁酸铵、铁氰化钾、铁氰化钠、铁氰化镁、铁氰化铵等，作为二茂铁类例如有二茂铁、二茂铁二羧酸、二茂铁基甲醇等，作为铁螯合物中的多氨基羧酸铁螯合物，例如有乙二胺四乙酸铁、乙二醇二(2-氨基乙基醚)四乙酸二铁等，作为醇酸铁螯合物，例如有乙醇酸铁、甘油酸铁、乳酸铁、苹果酸铁、柠檬酸铁、酒石酸铁等。

另外，本发明中作为取代芳香族烃或取代芳香族杂环的至少2个相同或不同、取代或非取代氨基或羟基取代基中的至少一个，是被可以用酶切断的基团保护的、利用能切断该保护基的分解酶能够生成该取代或非取代氨基或羟基的取代基。

作为上述取代基的保护基，对于氨基是氨基酸残基，对于羟基是糖残基、磺基、磷基等。

作为形成氨基酸残基的氨基酸，可以是任意一种氨基酸，但优选α-氨基酸，例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、羟赖氨酸、精氨酸、半脱氨酸、蛋氨酸等。

作为形成糖残基的糖类，优选单糖类，只要可以用酶水解，可以是任意碳原子数的糖类，优选戊糖、己糖，更优选己糖，例如半乳糖、葡萄糖、塔罗糖、甘露糖、山梨糖、塔格糖、果糖、阿洛酮糖等。

作为切断稳定型反应促进化合物的保护基的分解酶，可以根据保护基的种类使用公知的水解酶或转移酶。例如在稳定型反应促进化合物4-氨基-2，6-二氯苯酚的羟基被β-D-半乳糖基保护的情况下，可以使用β-半乳糖苷酶，在4-氨基-2，6-二溴苯酚的氨基被亮氨酸保护的情况下，可以使用亮氨酸氨基肽酶，另外，在4-氨基-2，6-二氯苯酚的氨基被γ-谷氨酸保护的情况下，可以使用γ-谷氨酰转肽酶，在使用该酶时优选添加作为受体的甘氨酰替甘氨酸。

分解酶的浓度优选为0.1～500U/ml，更优选1～100U/ml。

使这些分解酶产生作用的时期是在使抗坏血酸氧化酶即将使用之前或同时。

稳定型反应促进化合物，利用分解酶切断保护基的结果，是生成了上述定义的取代芳香族烃或取代芳香族杂环的反应促进化合物。可以在生成的反应促进化合物的存在下进行上述胆红素定量。

反应促进化合物由于被能够用酶切断的保护基保护，所以变得在溶液中难以发生自然氧化分解等反应，提高了作为试剂的稳定性。稳定型反应促进化合物自身并不促进抗坏血酸氧化酶对胆红素的氧化，但被分解酶切断后形成反应促进化合物。

作为特别优选的稳定型反应促进化合物，有以通式(III)表示的化合物，

(式中，R¹⁰表示糖残基或磷基，R²、R³、R⁴及R⁵与上述含义相同)

及以通式(IV)表示的化合物，

(式中，R¹¹表示氨基酸残基，R²、R³及R⁴与上述含义相同)。

糖残基与氨基酸残基的定义与上述相同。

稳定型反应促进化合物的具体例，作为被糖残基保护的化合物，例如有4-氨基-2，6-二氯苯酚-β-D-吡喃半乳糖苷、4-氨基-2，6-二氯苯酚-β-D-吡喃葡萄糖苷、4-氨基-2，6-二氯苯酚-β-D-吡喃甘露糖苷、2，6-二氯-4-甲胺基苯酚-β-D-吡喃半乳糖苷、2，6-二氯-4-二甲胺基苯酚-β-D-吡喃半乳糖苷、2，6-二氯-4-磺基丙胺基苯酚-β-D-吡喃半乳糖苷等，作为被氨基酸残基保护的化合物，例如有2，6-二溴-4-(N-亮氨酰)氨基苯酚、2，6-二溴-4-(N-γ-谷氨酰)氨基苯酚等。

反应液中反应促进化合物与稳定型反应促进化合物的浓度优选为1～1000μM，更优选10～200μM。

作为使含有胆红素的生物试样与抗坏血酸氧化酶反应，将胆红素氧化，利用光学方法测定由此产生的胆红素的量的变化的胆红素定量方法，有如下所述的方法(特开昭59-17999号公报)。即，利用比色法测定由于氧化反应而减少的胆红素或由氧化反应生成的胆绿素的吸光度的变化，可以定量直接型胆红素或总胆红素。

胆红素的氧化反应是由如下反应完成的，在含有胆红素的试样中加入反应促进化合物、缓冲液及根据需要为防止反应液混浊而加入的表面活性剂，进行20～50℃、3～15分钟，通常为37℃、5分钟的预备加热后，加入抗坏血酸氧化酶，使进行20～50℃、3～15分钟，通常为37℃、5分钟的反应后完成。另外，更优选的状态是在含有胆红素的试样中加入稳定型反应促进化合物、缓冲液及根据需要为防止反应液混浊而加入的表面活性剂，进行20～50℃、3～15分钟，通常为37℃、5分钟的预备加热后，加入分解酶及抗坏血酸氧化酶，便进行20～50℃、3～15分钟、通常为37℃、5分钟的反应而完成。

表面活性剂例如有特里顿(Triton)X-100、月桂基硫酸钠(SDS)等。

光学测定胆红素的量的变化时，胆红素的减少优选在440～470nm测定吸光度的减少，胆绿素的增加优选在330nm或380nm测定吸光度的增大。

另外，测定总胆红素时，也可以添加表面活性剂、芳香族羧酸、磺胺剂、醇等重氮反应中的间接型胆红素的反应活性化剂。作为表面活性剂优选阴离子表面活性剂，例如胆酸、十二烷基硫酸等。作为磺胺剂，例如有磺胺、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基异噁唑、磺胺噻唑、磺胺胍等。作为醇例如有碳原子数1～6的甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、戊醇、己醇等。

上述的表面活性剂、芳香族羧酸、磺胺剂也可以用为盐使用，此时的碱可以是金属离子，例如锂、钠、钾等碱金属离子、镁、钙等碱土金属离子、铝、锌离子等。

间接型胆红素的反应活性化剂的浓度优选为0.05～5％，更优选0.1～1％。

本发明的胆红素测定试剂通常由(1)含有反应促进化合物的缓冲液(第1试剂)、(2)含有抗坏血酸氧化酶的缓冲液(第2试剂)组成。从试剂的稳定性方面考虑，优选由(1)含有稳定型反应促进化合物的缓冲液(第1试剂)(2)含有分解酶及抗坏血酸氧化酶的缓冲液(第2试剂)组成的试剂盒。

第2试剂的PH优选在考虑到酶溶液的稳定性之后再决定，第1试剂的PH优选在添加第2试剂之后再调整到与所要求的反应PH一致。

另外，上述所示的化合物或酶可以从市售品容易地得到，例如在东京化成(株)、(株)同仁化学研究所、大东化学(株)、和光纯药工业(株)、盛进(株)、ナカライ(株)或Aldrich社等的试剂目录中有详细记载。

试验例1

作为胆红素检体，将国际试药(株)的干涉check·A胆红素·C(以下简称为直接型胆红素试剂)调制成15mg/dl的溶液0.1ml及0.1M乳酸缓冲液(PH3.5)2.2ml、及表1所示的反应促进化合物调制成3.1mM的溶液0.05ml混合，进行37℃、5分钟的预备加热。使用日立U-3210形自记分光光度计测定此时的波长450nm处的吸光度(反应前的吸光度：A₀)。

然后，加入含有400U/ml抗坏血酸氧化酶[旭化成工业(株制、Acremonium SP.]的10mM磷酸钾缓冲液(PH6.0)0.75ml，在37℃反应5分钟后测定吸光度(反应后的吸光度：A₂)。另外，在下面的说明中所说的反应前后的吸光度的变化量或只说吸光度的变化量时，是指将上述A₀从反应前的液量补正到反应后的液量的值作为A₁，表示A₁与A₂之差。结果如表1所示。可以看出即使使用已知的反应促进化合物，与不使用反应促进化合物时同样几乎示会产生由抗坏血酸氧化酶引起的胆红素的氧化。

                    表1反应促进化合物                         吸光度的变化量未添加                                     0.0304-氨基-2，6-二溴苯酚                       0.1912，6-二溴-4-甲胺基苯酚                     0.1912，6-二溴-4-二甲胺基苯酚                   0.2012，6-二溴-4-磺基丙胺基苯酚                 0.1962，6-二氯-4-二甲胺基苯酚                   0.2064，5-二甲基-1，2-苯二胺                    0.0952，5-二甲基-1，4-苯二胺                    0.167N，N-二甲基-1，4-苯二胺                    0.048N，N-二乙基-1，4-苯二胺                    0.1541，6-萘酚                                  0.0644-氨基-1-萘酚                              0.0805-氨基-1-萘酚                              0.0495-氨基-8-羟基喹啉                          0.105亚铁氰化钾                                 0.195亚铁氰化钠                                 0.047乙二胺四乙酸二铁                           0.0451，1’-二羧酸二茂合铁                      0.138已知的反应促进化合物水杨酸钠                                   0.030磺基水杨酸                                 0.031月桂基硫酸钠                               0.029磺胺                                       0.028试验例2

除了将反应促进化合物换成表2所示的稳定型反应促进化合物之外，与试验例1同样进行预备加热后测定反应前的吸光度。然后加入含有400U/ml抗坏血酸氧化酶及10U/ml的β-半乳糖苷酶[东洋纺绩(株)制、Aspergillus SP·]的10mM磷酸钾缓冲液(PH6.0)0.75ml，与试验例1同样进行反应，测定吸光度，求出反应前后吸光度的变化量。结果如表2所示。可以看出未添加10U/mlβ-半乳糖苷酶的情况下(没有酶)，因为几乎未看到有吸光度的变化，所以可知稳定型反应促进化合物本身并未促进氧化反应，但被β-半乳糖苷酶水解后成为反应促进化合物。

                         表2稳定型反应促进化合物                     吸光度变化量

                                没有酯      β-半乳糖苷酶4-氨基-2，6-二氯苯酚-β-D            0.030           0.214-吡喃半乳糖苷2，6-二氯-4-甲胺基苯酚-β-D          0.031           0.232-吡喃半乳糖苷2，6-二氯-4-二甲胺基苯酚-β-D        0.029           0.223-吡喃半乳糖苷2，6-二氯-4-磺基丙胺基苯-β-D        0.029           0.223-吡喃半乳糖苷试验例3

除使用表3所示的化合物作为稳定型反应促进化合物，使用哌嗪-1，4-二(2-羟基-3-丙烷)磺酸(以下简称为POPSO)(PH8.0)缓冲液替代0.1M磷酸钾缓冲液、使用10U/mlγ-谷氨酰转移酶[协和发酵工业(株)制、Bacillus Subtilis]及20mM甘氨酰替甘氨酸替代β-半乳糖苷酶之外，与试验例2同样进行试验。结果如表3所示。可以看出未添加10U/mlγ-谷氨酰转移酶的情况下(没有酶)，因为几乎未观察到有吸光度的变化，所以可知2，6-二溴-4-(N-γ-谷氨酰基)氨基苯酚其本身不促进氧化反应，但被γ-谷氨酰转移酶分解后成为反应促进化合物。

                     表3稳定型反应促进化合物                  吸光度的变化量

                             没有酯       γ-谷氨酰转移酶2，6-二溴-4-(N-γ-谷氨酰基)      0.032              0.209氨基苯酚试验例4

将表4所示的化合物溶于0.1M乳酸缓冲液(PH3.5)及0.1MPOPSO缓冲液(PH8.0)中，使浓度为5mM，转移至褐色的试剂瓶中，将该试剂瓶在30℃的恒温槽中保存，用肉眼观察溶液的颜色。在4-氨基-2，6-二溴苯酚的情况下，在溶解后当时为无色透明，但随着保存时间的延长，可以看到带有红褐色。另一方面，4-氨基-2，6-二氯苯酚-β-D-吡喃半乳糖苷及2，6-二溴-4-(N-γ-谷氨酰)氨基苯酚经过14天后仍为无色透明。结果示于表4。

                            表4

                                       保存期间

     化合物                   pH

                                      0日     14日4-氨基-2，6-二溴苯酚              3.5      -      +

                              8.0             ++4-氨基-2，6-二氯苯酚β-D-         3.5      -      -酚吡喃半乳糖苷                  8.0      -      -2，6-二溴-4-(N-γ-谷氨酰基)       3.5      -      -氨基苯酚                        8.0      -      -

-：无色透明、+：淡红褐色、++：红褐色试验例5

除使用各种PH的缓冲液2.2ml代替0.1M乳酸缓冲液(PH3.5)、使用3.1mM的4-氨基-2，6-二溴苯酚0.05ml及调制成15mg/dl的作为胆红素检品的直接型胆红素二水杨酰胺胆红素(ジタウロビリルビン)(Porphyrin Products Inc.)水溶液之外，与试验例1同样进行试验。作为各种PH的缓冲液，PH2.5～5.0使用柠檬酸缓冲液、PH5.5～7.0使用磷酸缓冲液、PH7.5～9.0使用三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液。将含有抗坏血酸氧化酶的10mM磷酸钾缓冲液(PH6.0)添加到上述各缓冲液中时，反应液的PH几乎没有变化。结果示于表5。直接型胆红素在测定的任一个PH值处都显示出相同程度的吸光度的变化。

           表5反应液的pH            吸光度的变化量2.0                    0.1752.5                    0.1753.0                    0.1783.5                    0.1804.0                    0.1824.5                    0.1795.0                    0.1805.5                    0.1716.0                    0.1816.5                    0.1797.0                    0.1807.5                    0.1808.0                    0.1808.5                    0.1789.0                    0.1759.5                    0.180试验例6

除将国际试药(株)制的干涉check·A胆红素·F(以下简称为间接型胆红素试剂)调制成30mg/dl，取0.1ml作为胆红素检品之外，与试验例4同样进行试验[未添加SDS(用-表示)]。另外，还在0.1M的各种PH的缓冲液中加入SDS使浓度为0.1％，使用得到的溶液进行试验[添加SDS(用+表示)]。结果示于表6。在PH4.0以下、SDS(-)的条件下，几乎未见有间接型胆红素的吸光度的变化，但在PH4.5以上时有吸光度的变化，可知间接型胆红素被氧化了，在SDS(+)的条件下，显示出在PH7.0以上时，间接型胆红素被完全氧化。

             表6反应液的pH            吸光度的变化量

                 SDS(-)     SDS(+)

2.0              0.000      0.035

2.5              0.000      0.059

3.0              0.000      0.089

3.5              0.001      0.118

4.0              0.012      0.154

4.5              0.059      0.213

5.0              0.142      0.260

5.5              0.189      0.296

6.0              0.237      0.325

6.5              0.260      0.343

7.0              0.284      0.349

7.5              0.296      0.355

8.0              0.308      0.355

8.5              0.320      0.355

9.0              0.320      0.355

9.5              0.320      0.355实施例实施例1

将作为直接型胆红素的二水杨酰胺胆红素用蒸馏水稀释，调制成2、4、6、8、10、12、14、16、18、20mg/dl的胆红素检量线用标准液。

在含有4-氨基-2，6-二溴苯酚54.2μM的0.1M乳酸缓冲液(PH3.7)2.8ml中加入胆红素检量线用标准液0.1ml，37℃预备加热5分钟。然后加入含有抗坏血酸氧化酶1550U/ml的10mM磷酸钾缓冲液(PH6.0)0.1ml，37℃反应5分钟。求出相应于各浓度的胆红素的反应前后的吸光度变化量。结果得到如图1所示的检量线。胆红素浓度与吸光度的变化量在通过原点的直线上被标出(plot)，可以定量直接型胆红素。实施例2

将直接型胆红素试剂、间接型胆红素试剂及直接型胆红素试剂与间接型胆红素试剂按1∶1混合，分别作为总胆红素浓度，调制成4、8、12、16、20、24、28、32、36、40mg/dl的检量线用标准液。

在含有54.2μM 4-氨基-2，6-二溴苯酚及0.1％SDS的0.1MPOPSO缓冲液(PH8.0)2.8ml中加入上述胆红素检量线用标准液0.1ml，37℃预备加热5分钟。然后加入含有抗坏血酸氧化酶1550U/ml的10mMPOPSO缓冲液(PH8.0)0.1ml，37℃反应5分钟。求出相应于各浓度胆红素的反应前后吸光度的变化量。结果得到如图2所示的检量线。对于直接型、间接型及混合型中的任意一种胆红素的情况，总胆红素浓度与吸光度的变化量在通过原点的同一直线上分别被标出，而且显示出相同的斜率。因此，本发明的方法不论胆红素的类型如何，都可以将胆红素作为总胆红素浓度定量。实施例3

使用利用和光纯药工业(株)制的直接型胆红素测定试剂盒(直接胆红素II-HAテストワコ-)测定的直接型胆红素值为2.95mg/dl、利用和光纯药工业(株)制的总胆红素测定试剂盒(总胆红素II-HAテストワコ一)测定的总胆红素值为4.85mg/dl的血清检品作为样品。

利用实施例1的方法测定直接型胆红素的吸光度变化量，利用实施例2的方法测定总胆红素的吸光度的变化量。同样，替代血清检品，测定使用已知浓度的胆红素时吸光度的变化量，由式1求出胆红素的浓度。另外，在实施例1的方法中使用直接型胆红素试剂作为已知浓度的胆红素，在实施例2的方法中使用直接型胆红素试剂与间接型胆红素试剂的1∶1的混合物作为已知浓度的胆红素。结果示于表7。

胆红素浓度＝(A×C)/B      (式1)式中，A：检品的吸光度变化量

  B：标准胆红素的吸光度变化量

  C：标准胆红素中的胆红素浓度mg/dl)

                  表7反应促进化合物                   直接型     总胆

                             胆红素     红素

                             (mg/dl)    (mg/dl)4-氨基-2，6-二溴苯酚              3.01       4.802，6-二溴-4-二甲胺基苯酚          3.05       4.752，6-二溴-4-磺基丙胺基苯酚        3.02       4.782，6-二氯-4-二甲胺基苯酚          3.01       4.852，6-二溴-4-甲胺基苯酚            3.01       4.814，5-二甲基-1，2-苯二胺           2.99       4.782，5-二甲基-1，4-苯二胺           3.05       4.76N，N-二甲基-1，4-苯二胺           3.06       4.83N，N-二乙基-1，4-苯二胺           3.00       4.771，6-萘酚                         2.98       4.794-氨基-1-萘酚                     2.98       4.815-氨基-1-萘酚                     3.02       4.775-氨基-8-羟基喹啉                 2.98       4.82亚铁氰化钾                        3.07       4.80亚铁氰化钠                        3.05       4.76乙二胺四乙酸二铁                  3.07       4.781，1’-二羧酸二茂合铁             3.01       4.78实施例4

使用实施例3中的血清样品，利用试验例2的方法测定直接型胆红素的吸光度的变化量。使用已知浓度的胆红素替代血清检品，同样测定吸光度的变化量，由式1求出胆红素的浓度。另外，使用直接型胆红素试剂作为已知浓度的胆红素。结果如表8所示。

                  表8稳定型反应促进化合物              直接型胆红素

                                 (mg/dl)4-氨基-2，6-二氯苯酚-β-D-            3.01吡喃半乳糖苷2，6-二氯-4-甲胺基苯酚-β-D-          3.09吡喃半乳糖苷2，6-二氯-4-二甲胺基苯酚-β-D-        3.05吡喃半乳糖苷2，6-二氯-4-磺基丙胺基苯酚-β-D-      3.11吡喃半乳糖苷实验例5

使用实施例3中的血清样品，利用试验例3的方法测定总胆红素的吸光度的变化量。测定使用已知浓度的胆红素替代血清检品时的吸光度变化量，由式1求出胆红素的浓度。另外，使用直接型胆红素试剂与间接型胆红素试剂的1∶1的混合物作为已知浓度的胆红素。结果示于表9。

         表9稳定型反应促进化合物                总胆红素

                                (mg/dl)2，6-二溴-4-(N-γ-谷氨酰基)           4.84氨基苯酚实施例6

调制以下的试剂盒用于测定直接型胆红素。第1试剂：

含有0.3％特里顿(Triton)X-100及69.87μM4-氨基-2，6-二氯苯酚-β-D-吡喃半乳糖苷的0.1M乳酸-柠檬酸三钠缓冲液(PH3.7)。第2试剂：

含有0.3％特里顿X-100、400U/ml抗坏血酸氧化酶及10U/mlβ-半乳糖苷酶的10mM的磷酸钾缓冲液(PH6.0)。实施例7

调制以下的试剂盒用于测定总胆红素。第3试剂：

含有0.5％硫酸钠、0.25％SDS、0.2％胆酸钠、20mM苷氨酰替甘氨酸及75.75μM2，6-二溴-4-(N-γ-谷氨酰基)氨基苯酚的20mMPOPSO(PH8.0)缓冲液。第4试剂：

含有20mM甘氨酰替甘氨酸、160U/ml抗坏血酸氧化酶及10/mlγ-谷氨酰转移酶的20mMPOPSO(PH8.0)缓冲液。实施例8

将实施例6及实施例7中制成的试剂在10℃的冷暗处按表10中所示的期间保存后，用于试验。

在第1试剂2.2ml中加入正常人血清样品0.1ml，预备加热5分钟后加入第2试剂0.75ml，再反应5分钟，测定直接型胆红素浓度。同样，在第3试剂2.2ml中加入该正常人血清样品0.1ml，预备加热5分钟后加入第4试剂0.75ml，再反应5分钟，测定总胆红素浓度。测定使用已知浓度的标准胆红素替代血清样品时吸光度的变化。由式1求出胆红素浓度。所得结果示于表10。另外，所用的正常人血清，利用和光纯药工业(株)制的直接型胆红素试剂盒(直接胆红素II-HAテストワコ一)测定得到的直接型胆红素值为0.24mg/dl，利用和光纯药工业(株)制的总胆红素试剂盒(总胆红素II-HAテストワコ一)测定得到的总胆红素值为0.74mg/dl。即使将试剂在水溶液状态下保存28天仍然稳定，还能够用于测定胆红素。

                 表10试剂盒调制后     直接型胆红素      总胆红素期间(日)           (mg/dl)          (mg/dl)0                 0.26              0.777                 0.25              0.7614                0.25              0.7721                0.28              0.7928                0.27              0.76根据本发明，通过使用反应促进化合物，使用比胆红素氧化酶稳定性更高的抗坏血酸氧化酶，可以迅速而且准确地测定胆红素。

另外，根据本发明，通过使用稳定型反应促进化合物及分解酶，可以使反应促进化合物在溶液中的稳定性提高，即使使用长时间保存在溶液状态下的试剂，也能准确地测定胆红素。

另外，本发明提供的液态胆红素测定试剂没有必要在将要使用之前现调制，可以用来替代先前的作为冷冻干燥品供给的在将要使用之前现调制的试剂。

附图简单说明

图1：直接型胆红素的检量线

图2：总胆红素的检量线

符号说明—●—：直接型胆红素—■—：间接型胆红素—○—：直接型及间接型胆红素混合物(1∶1)

Claims (6)

1、一种胆红素的定量方法，该方法是在水性介质中，使含有胆红素的试样与抗坏血酸氧化酶反应将胆红素氧化，利用光学方法测定由此产生的胆红素的量的变化，从而定量试样中的胆红素，该方法的特征在于，在反应促进化合物的存在下使抗坏血酸氧化酶起作用，该反应促进化合物是从下列化合物组成的组中选择的，这些化合物包括：被至少2个相同或不同、取代或非取代氨基或羟基取代的取代芳香族烃；被至少2个相同或不同、取代或非取代氨基或羟基取代的取代芳香族杂环化合物；及有机铁化合物。

2、权利要求1中记载的定量方法，其中作为取代基的取代或非取代氨基或羟基中的至少一个，是被可以用酶切断的基团保护的、利用能切断该保护基的分解酶能够生成该取代或非取代氨基或羟基的取代基。

3、权利要求1或2中记载的定量方法，其中的芳香族烃为苯、萘或蒽。

4、权利要求1或2中记载的定量方法，其中的芳香族杂环化合物为吡啶、吡嗪、哒嗪、喹啉、异喹啉、喹喔啉、喹唑啉、噌啉、酞嗪或萘啶。

5、权利要求1～4中任一项记载的定量方法，其中的取代氨基是被取代或非取代的烷基取代的氨基。

6、一种胆红素定量用试剂组合物，含有抗坏血酸氧化酶及反应促进化合物，该反应促进化合物是从下列化合物组成的组中选择的，这些化合物包括：被至少2个相同或不同、取代或非取代氨基或羟基取代的取代芳香族烃；被至少2个相同或不同、取代或非取代氨基或羟基取代的取代芳香族杂环化合物；及有机铁化合物。

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