JP2922267B2 - 成分の分析法 - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、還元性物質を含有する試料中の特定の成分
から化学量論的に過酸化水素を生成させ、パーオキシダ
ーゼの存在下該過酸化水素と色源体とを反応させて生成
する色素を定量する方法に関し、試料中の還元性物質を
予かじめ分解することにより、より正確に目的成分を定
量するところに特徴を有する。
から化学量論的に過酸化水素を生成させ、パーオキシダ
ーゼの存在下該過酸化水素と色源体とを反応させて生成
する色素を定量する方法に関し、試料中の還元性物質を
予かじめ分解することにより、より正確に目的成分を定
量するところに特徴を有する。
従来技術 生体試料成分中の目的成分にその酸化酵素を作用させ
て、生成した過酸化水素をパーオキシダーゼ及び色源体
の共存下で色素に導びきこれを定量することによって目
的成分を定量する方法は公知である。この方法は感度及
び再現性に優れ、自動分析装置にも広く応用されてい
る。しかし、その反応は酸化縮合反応のため、生体試料
中に共存する還元性物質例えばビリルビン、システイ
ン、グルタチオン等、或いは投与薬剤などにより干渉を
受けやすい。その中でも特にビリルビン（包合型及び遊
離型）をはじめとする還元性物質の干渉は大きく、目的
成分の真値を求めることは困難である。
て、生成した過酸化水素をパーオキシダーゼ及び色源体
の共存下で色素に導びきこれを定量することによって目
的成分を定量する方法は公知である。この方法は感度及
び再現性に優れ、自動分析装置にも広く応用されてい
る。しかし、その反応は酸化縮合反応のため、生体試料
中に共存する還元性物質例えばビリルビン、システイ
ン、グルタチオン等、或いは投与薬剤などにより干渉を
受けやすい。その中でも特にビリルビン（包合型及び遊
離型）をはじめとする還元性物質の干渉は大きく、目的
成分の真値を求めることは困難である。
この還元性物質の影響を小さくするために、還元性物
質を分解する酵素例えばビリルビンオキシダーゼ等を用
いる方法も検討されているが、分解に多くの時間を要す
る等の問題がある。
質を分解する酵素例えばビリルビンオキシダーゼ等を用
いる方法も検討されているが、分解に多くの時間を要す
る等の問題がある。
一方、還元性物質を分解するのに過酸化水素が有効で
あることは知られている（京都府臨床衛生検査技師会会
誌 10巻 No.2,1983 31〜36頁）。しかし直接試料に過
酸化水素を加えると、その酸化力の強さのため目的成分
の分解の恐れがあり、又定量組成物をキットとして商品
化する際に都合が悪い。
あることは知られている（京都府臨床衛生検査技師会会
誌 10巻 No.2,1983 31〜36頁）。しかし直接試料に過
酸化水素を加えると、その酸化力の強さのため目的成分
の分解の恐れがあり、又定量組成物をキットとして商品
化する際に都合が悪い。
発明が解決しようとする課題 試料中の還元性物質の干渉を回避し、且つキットとし
て商品化できる手段が見出されていない。
て商品化できる手段が見出されていない。
課題を解決するための手段 本発明によれば、試料中の定量すべき成分をレドック
ス反応（２）を利用して定量する際の反応に係る成分以
外の成分（Ｙ）を用い、レドックス反応（１）を利用し
て試料中の還元性物質の分解に充分な量の過酸化水素を
生成させ、試料中の還元性物質と該生成過酸化水素とを
パーオキシダーゼの存在下に反応させ、要すればレドッ
クス反応（１）で用いた酵素を不活化させた後、パーオ
キシダーゼの存在下過酸化水素と反応してラジカルに変
換される化合物（Ｘ）と試料中に残存する過酸化水素と
をパーオキシダーゼの存在下に反応させ、ついで定量す
べき成分を用いレドックス反応（２）を行わせて過酸化
水素を生成させ、これをそれ自体公知の方法で定量する
ことによって試料中の成分を正確に求めることができ
る。
ス反応（２）を利用して定量する際の反応に係る成分以
外の成分（Ｙ）を用い、レドックス反応（１）を利用し
て試料中の還元性物質の分解に充分な量の過酸化水素を
生成させ、試料中の還元性物質と該生成過酸化水素とを
パーオキシダーゼの存在下に反応させ、要すればレドッ
クス反応（１）で用いた酵素を不活化させた後、パーオ
キシダーゼの存在下過酸化水素と反応してラジカルに変
換される化合物（Ｘ）と試料中に残存する過酸化水素と
をパーオキシダーゼの存在下に反応させ、ついで定量す
べき成分を用いレドックス反応（２）を行わせて過酸化
水素を生成させ、これをそれ自体公知の方法で定量する
ことによって試料中の成分を正確に求めることができ
る。
本発明の原理は、試料中の基質もしくは酵素活性をこ
れらの成分に由来して化学量論的に生成する過酸化水素
を定量することにより定量する方法に準拠し、より正確
に目的を達成するために試料中の成分を利用して徐々に
過酸化水素を生成させ、その作用によって試料中の還元
性物質を分解させることにより還元性物質の干渉を回避
することに特徴を有する。
れらの成分に由来して化学量論的に生成する過酸化水素
を定量することにより定量する方法に準拠し、より正確
に目的を達成するために試料中の成分を利用して徐々に
過酸化水素を生成させ、その作用によって試料中の還元
性物質を分解させることにより還元性物質の干渉を回避
することに特徴を有する。
本発明方法によれば、直接過酸化水素を試料に供給す
ることによる目的成分の分解の恐れもなく、簡単で正確
に目的を達成できる。
ることによる目的成分の分解の恐れもなく、簡単で正確
に目的を達成できる。
以下に、本発明を詳細に説明する。
本発明を用いて定量できる成分としては、レドックス
反応（２）を利用して過酸化水素を化学量論的に生成さ
せることができる成分であればいずれも対象にできる。
反応（２）を利用して過酸化水素を化学量論的に生成さ
せることができる成分であればいずれも対象にできる。
具体的には目的成分のオキシダーゼを利用してレドッ
クス反応（２）を行い、過酸化水素を生成させることが
できる成分、例えばコレステロール、尿酸、グルコー
ス、乳酸、コリン、グリセロール、ピルビン酸、ザルコ
シンなどがあげられる。
クス反応（２）を行い、過酸化水素を生成させることが
できる成分、例えばコレステロール、尿酸、グルコー
ス、乳酸、コリン、グリセロール、ピルビン酸、ザルコ
シンなどがあげられる。
目的成分（基質）のオキシダーゼがない場合には、目
的成分を適当な酵素で分解してオキシダーゼが存在する
ような基質例えば前記基質に変換し、次いでその基質に
オキシダーゼを作用させて過酸化水素を生成させればよ
い。かかる成分としてコレステロールエステル、トリグ
リセライド、リン脂質、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギ
ン酸、スターチ、マルトース、シアル酸、クレアチン、
クレアチニン等が例示される。
的成分を適当な酵素で分解してオキシダーゼが存在する
ような基質例えば前記基質に変換し、次いでその基質に
オキシダーゼを作用させて過酸化水素を生成させればよ
い。かかる成分としてコレステロールエステル、トリグ
リセライド、リン脂質、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギ
ン酸、スターチ、マルトース、シアル酸、クレアチン、
クレアチニン等が例示される。
目的成分が酵素の場合は、その酵素の基質に目的成分
である酵素を作用させ、さらに要すれば生成成分をオキ
シダーゼの存在する基質に変換した後、レドックス反応
（２）を行えばよい。該酵素の例としてコリンエステラ
ーゼがあげられる。
である酵素を作用させ、さらに要すれば生成成分をオキ
シダーゼの存在する基質に変換した後、レドックス反応
（２）を行えばよい。該酵素の例としてコリンエステラ
ーゼがあげられる。
本発明で用いられる成分（Ｙ）は、目的成分の分析に
係る成分以外の成分であって、オキシダーゼによって過
酸化水素を生成できる成分や、適当な酵素によってある
いは基質を試料に加えてオキシダーゼの存在する基質に
変換できるような基質や酵素などがあげられる。
係る成分以外の成分であって、オキシダーゼによって過
酸化水素を生成できる成分や、適当な酵素によってある
いは基質を試料に加えてオキシダーゼの存在する基質に
変換できるような基質や酵素などがあげられる。
具体的成分（Ｙ）としては、前記目的成分の例がいず
れも利用できる。
れも利用できる。
成分（Ｙ）は１つに制限されることなく、２つ以上利
用することができ、試料中に適当な成分がないときは、
試料に成分（Ｙ）として基質及びそのオキシダーゼを加
えることができる。
用することができ、試料中に適当な成分がないときは、
試料に成分（Ｙ）として基質及びそのオキシダーゼを加
えることができる。
化合物（Ｘ）としては、パーオキシダーゼの存在下に
過酸化水素と反応して非発色性のラジカルに変換される
化合物であればいずれも用いうる。
過酸化水素と反応して非発色性のラジカルに変換される
化合物であればいずれも用いうる。
かかる化合物として、下記一般式（Ｉ） 〔式中、ＺはOH又はNR4R5（R4，R5は同一又は異なっ
てよく、水素、アルキル、置換アルキル、アシルを示
す）を示し、R1，R2，R3は同一又は異なってよく、水
素、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、アミノ、ニト
ロ、カルボキシル、スルホニルを示す〕で表わされる化
合物があげられる。
てよく、水素、アルキル、置換アルキル、アシルを示
す）を示し、R1，R2，R3は同一又は異なってよく、水
素、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、アミノ、ニト
ロ、カルボキシル、スルホニルを示す〕で表わされる化
合物があげられる。
これらは特公昭62−21517号公報、特公昭61−23998号
公報等に記載されているが、具体的には以下に例示され
る。
公報等に記載されているが、具体的には以下に例示され
る。
フェノール、2,4−ジクロルフェノール、ｐ−クロル
フェノール、2,4−ジブロムフェノール、Ｐ−ブロムフ
ェノール、2,3−ジクロルフェノール、２−ニトロフェ
ノール、３−ニトロフェノール、２−アミノフェノー
ル、３−アミノフェノールアニリン、２−ブロムアニリ
ン、３−ブロムアニリン、２−クロムアニリン、３−ク
ロルアニリン、オルトトルイジン、メタトルイジン、ジ
メチルアニリン、ジエチルアニリン、ｏ−フェニレンジ
アミン、N,N−ｐ−フェニレンジアミン、ｏ−アニシジ
ン、メタアニシジン、ｏ−クレゾール、ｍ−クレゾー
ル、２−メチル−2,6−ジニトロフェノール、２−メト
キシ−５′−ニトロアニリン、２−メチル−５−ニトロ
アニリン、3,5−ジヒドロキシトルエン、３−メトキシ
フェノール、２−アミノ−５−メチルフェノール、２−
ヒドロキシ−３−メチルベンゾイックアシッド、２−ヒ
ドロキシフェニル酢酸、2,3−ジメチルフェノール、2,5
−ジメチルフェノール、２−エチルフェノール、３−エ
チルフェノール、２−メトキシメチルフェノール、2,3
−ジメチルアニリン、2,5−ジメチルアニリン、3,5−ジ
エチルアニリン、３−（ジメチルアミノ）フェノール、
３−メトキシ−N,N−ジメチルアニリン、N,N−ジエチル
−1,3−フェニレンジアミン、3,5−ジメチル−1,2−フ
ェニレンジアミン、４−アミノアンチピリン。
フェノール、2,4−ジブロムフェノール、Ｐ−ブロムフ
ェノール、2,3−ジクロルフェノール、２−ニトロフェ
ノール、３−ニトロフェノール、２−アミノフェノー
ル、３−アミノフェノールアニリン、２−ブロムアニリ
ン、３−ブロムアニリン、２−クロムアニリン、３−ク
ロルアニリン、オルトトルイジン、メタトルイジン、ジ
メチルアニリン、ジエチルアニリン、ｏ−フェニレンジ
アミン、N,N−ｐ−フェニレンジアミン、ｏ−アニシジ
ン、メタアニシジン、ｏ−クレゾール、ｍ−クレゾー
ル、２−メチル−2,6−ジニトロフェノール、２−メト
キシ−５′−ニトロアニリン、２−メチル−５−ニトロ
アニリン、3,5−ジヒドロキシトルエン、３−メトキシ
フェノール、２−アミノ−５−メチルフェノール、２−
ヒドロキシ−３−メチルベンゾイックアシッド、２−ヒ
ドロキシフェニル酢酸、2,3−ジメチルフェノール、2,5
−ジメチルフェノール、２−エチルフェノール、３−エ
チルフェノール、２−メトキシメチルフェノール、2,3
−ジメチルアニリン、2,5−ジメチルアニリン、3,5−ジ
エチルアニリン、３−（ジメチルアミノ）フェノール、
３−メトキシ−N,N−ジメチルアニリン、N,N−ジエチル
−1,3−フェニレンジアミン、3,5−ジメチル−1,2−フ
ェニレンジアミン、４−アミノアンチピリン。
本発明方法を実施するに際しては、一般に適当な緩衝
液に試料を加え、ついで反応を順次行わせるに必要な材
料を順次加えて反応させ、レドックス反応（２）の終了
後、生成した色素の極大吸収波長において、着色した反
応液の吸収の変化を測定することにより目的の成分を定
量できる。
液に試料を加え、ついで反応を順次行わせるに必要な材
料を順次加えて反応させ、レドックス反応（２）の終了
後、生成した色素の極大吸収波長において、着色した反
応液の吸収の変化を測定することにより目的の成分を定
量できる。
より好ましい方法として、次のステップＡとステップ
Ｂの組合せを利用することにより簡便に実施できる。
Ｂの組合せを利用することにより簡便に実施できる。
ステップＡ（還元性物質の分解） Ｉ 成分（Ｙ）のオキシダーゼが利用できる場合 成分（Ｙ）のオキシダーゼ、パーオキシダーゼ、化合
物（Ｘ）及び試料を緩衝液中に存在させて反応を行わせ
る。
物（Ｘ）及び試料を緩衝液中に存在させて反応を行わせ
る。
このステップでレドックス反応（１）によって過酸化
水素が生成し、ついで還元性物質が酸化される。この酸
化反応の反応速度は、化合物（Ｘ）の存在によって増幅
される。
水素が生成し、ついで還元性物質が酸化される。この酸
化反応の反応速度は、化合物（Ｘ）の存在によって増幅
される。
残存する過酸化水素は、化合物（Ｘ）と反応してラジ
カルとなる。還元性物質の酸化反応は、ラジカル生成反
応より早いので、還元性物質は完全に酸化される。
カルとなる。還元性物質の酸化反応は、ラジカル生成反
応より早いので、還元性物質は完全に酸化される。
II 成分（Ｙ）が直接酸化できない基質である場合 成分（Ｙ）が直接酸化できる基質（Ｂ）に変換するの
に必要な酵素及び基質、基質（Ｂ）のオキシダーゼ、パ
ーオキシダーゼ、化合物（Ｘ）及び試料を適当な緩衝液
に存在させて反応を行わせる。
に必要な酵素及び基質、基質（Ｂ）のオキシダーゼ、パ
ーオキシダーゼ、化合物（Ｘ）及び試料を適当な緩衝液
に存在させて反応を行わせる。
このステップで先ず、成分（Ｙ）の基質（Ｂ）への変
換反応が進み、次いで前記ステップＡ−Ｉの反応が進
む。
換反応が進み、次いで前記ステップＡ−Ｉの反応が進
む。
III 成分（Ｙ）が酵素の場合 成分（Ｙ）の基質（Ａ）、基質（Ａ）の変換によって
得られる基質（Ｂ）のオキシダーゼ、パーオキシダー
ゼ、化合物（Ｘ）及び試料を適当な緩衝液中に存在させ
て反応を行わせる。還元性物質の分解反応終了後、成分
（Ｙ）の失活剤を加えて酵素反応を停止させる。この失
活剤は次のステップＢで加えることもできる。
得られる基質（Ｂ）のオキシダーゼ、パーオキシダー
ゼ、化合物（Ｘ）及び試料を適当な緩衝液中に存在させ
て反応を行わせる。還元性物質の分解反応終了後、成分
（Ｙ）の失活剤を加えて酵素反応を停止させる。この失
活剤は次のステップＢで加えることもできる。
ステップＢ（目的成分の定量） 過酸化水素の定量が、過酸化水素と色源体とをパーオ
キシダーゼの存在下に反応〔レドックス反応（２）〕さ
せて、生成する色素によって着色した反応液を比色定量
する方法の場合について述べる。
キシダーゼの存在下に反応〔レドックス反応（２）〕さ
せて、生成する色素によって着色した反応液を比色定量
する方法の場合について述べる。
Ｉ 目的成分のオキシダーゼを利用する場合 目的成分のオキシダーゼ、色源体をステップＡの反応
液に加え、反応後色素の極大吸収波長における反応液の
吸収の変化を測定する。
液に加え、反応後色素の極大吸収波長における反応液の
吸収の変化を測定する。
II 目的成分のオキシダーゼが利用できない（存在しな
い）場合 目的成分をオキシダーゼを有する基質（Ｂ）に変換す
るのに必要な酵素及び基質、基質（Ｂ）のオキシダー
ゼ、色源体がステップＡの反応液に加えられる。
い）場合 目的成分をオキシダーゼを有する基質（Ｂ）に変換す
るのに必要な酵素及び基質、基質（Ｂ）のオキシダー
ゼ、色源体がステップＡの反応液に加えられる。
試料中に基質（Ｂ）が存在する場合には、基質（Ｂ）
のオキシダーゼはステップＡで緩衝液に加えられる。
のオキシダーゼはステップＡで緩衝液に加えられる。
このステップで先ず目的成分の基質（Ｂ）への変換反
応が進み、次いで上記Ｉの反応が進む。
応が進み、次いで上記Ｉの反応が進む。
III 目的成分が酵素の場合 その酵素の基質、さらに要すれば他の基質及び酵素、
色源体がステップＡの反応液に加えられる。反応は上記
IIの反応が進む。
色源体がステップＡの反応液に加えられる。反応は上記
IIの反応が進む。
本発明で用いられる色源体としては、パーオキシダー
ゼの存在下に過酸化水素と反応して定量的に色素を生成
するような色源体であればいずれも使用できる。
ゼの存在下に過酸化水素と反応して定量的に色素を生成
するような色源体であればいずれも使用できる。
化合物（Ｘ）は、色源体の一部として利用できる。か
かる場合用いられるカップラーとしては４−アミノアン
チピリン（４−AA）、３−メチル−２−チアゾリノンヒ
ドラゾン（MBTH）,4,4′,4″−メチジントリス等の他、
下記式で表わされる化合物が用いうる。これらの化合物
は、化合物（Ｘ）としても利用できる。
かる場合用いられるカップラーとしては４−アミノアン
チピリン（４−AA）、３−メチル−２−チアゾリノンヒ
ドラゾン（MBTH）,4,4′,4″−メチジントリス等の他、
下記式で表わされる化合物が用いうる。これらの化合物
は、化合物（Ｘ）としても利用できる。
カップラーを用いる場合には、化合物（Ｘ）およびカ
ップラーの一方をステップＡで他方をステップＢで加え
ねばならない。
ップラーの一方をステップＡで他方をステップＢで加え
ねばならない。
式中、M1、M2は同一もしくは異なってよく、水素原
子、アルキル、アルケニル、アリール、ヒドロキシアル
キル、シクロアルキル、アシル、アリールアルキル、ア
シルアルキル、カルボキシル、アルコキシ、スルホ、ス
ルホアルキルを示し、モルホリン環 を形成しても良い。M3、M4、M5、M6、M7、M8は同一もし
くは異なってよく、水素原子、アルキル、アルケニル、
アシルアリール、ハロゲン原子、ニトロ、スルホ、カル
ボキシル、ヒドロキシル、アルコキシを示す。
子、アルキル、アルケニル、アリール、ヒドロキシアル
キル、シクロアルキル、アシル、アリールアルキル、ア
シルアルキル、カルボキシル、アルコキシ、スルホ、ス
ルホアルキルを示し、モルホリン環 を形成しても良い。M3、M4、M5、M6、M7、M8は同一もし
くは異なってよく、水素原子、アルキル、アルケニル、
アシルアリール、ハロゲン原子、ニトロ、スルホ、カル
ボキシル、ヒドロキシル、アルコキシを示す。
１つの化合物で色源体として用いられる化合物とし
て、特開昭56−145352号、特開昭60−218069号等に記載
の色源体が例示される。
て、特開昭56−145352号、特開昭60−218069号等に記載
の色源体が例示される。
目的成分のオキシダーゼが存在しない場合、先ず目的
成分は直接酸化できる（オキシダーゼを有する）基質
（Ｂ）に変換されるが、試料が基質（Ｂ）を含んでいる
場合には目的成分を基質（Ｂ）に変換する前に試料中に
元々存在していた基質（Ｂ）を分解しておかねばならな
い。この場合、ステップＡで基質（Ｂ）のオキシダーゼ
を存在させれば基質（Ｂ）は酸化されて過酸化水素を生
成し、これはステップＡの段階で分解されるので操作は
簡単である。
成分は直接酸化できる（オキシダーゼを有する）基質
（Ｂ）に変換されるが、試料が基質（Ｂ）を含んでいる
場合には目的成分を基質（Ｂ）に変換する前に試料中に
元々存在していた基質（Ｂ）を分解しておかねばならな
い。この場合、ステップＡで基質（Ｂ）のオキシダーゼ
を存在させれば基質（Ｂ）は酸化されて過酸化水素を生
成し、これはステップＡの段階で分解されるので操作は
簡単である。
例えば遊離のコレステロールを含有する試料中のエス
テル型のコレステロールを定量する場合がこれに該当す
る。
テル型のコレステロールを定量する場合がこれに該当す
る。
反応はいずれも適当な緩衝液中、pH2〜12、好ましく
は用いられる酵素の至適pH付近で、10〜40℃で行われ
る。
は用いられる酵素の至適pH付近で、10〜40℃で行われ
る。
緩衝剤としてはトリスHCl、硫酸塩、コハク酸塩、リ
ン酸塩、シュウ酸塩、フタル酸塩等が0.001〜2Mで用い
られる。
ン酸塩、シュウ酸塩、フタル酸塩等が0.001〜2Mで用い
られる。
反応液中、酸化酵素0.1〜5U/ml、化合物（Ｘ）及び色
源体0.5〜10mM、パーオキシダーゼ0.1/100U/ml、目的成
分分解酵素（基質）0.1〜100U/ml（0.1〜100mM）の濃度
で用いられる。
源体0.5〜10mM、パーオキシダーゼ0.1/100U/ml、目的成
分分解酵素（基質）0.1〜100U/ml（0.1〜100mM）の濃度
で用いられる。
本発明方法を実施するに便利な定量キットとして、組
成物ＡおよびＢからなるキットが提供される。
成物ＡおよびＢからなるキットが提供される。
組成物Ａ （１） 成分（Ｙ）のオキシダーゼ又は成分（Ｙ）を用
いて過酸化水素を生成させるに要する基質及び／又は酵
素 （２） パーオキシダーゼ （３） 化合物（Ｘ） （４） 下記基質（Ｂ）のオキシダーゼ 組成物Ｂ （１） 目的成分のオキシダーゼ又は目的成分を用いて
直接酸化できる基質（Ｂ）への変換に必要な基質及び／
又は酵素 （２） 色源体 以下本発明の態様を実施例によって説明する。
いて過酸化水素を生成させるに要する基質及び／又は酵
素 （２） パーオキシダーゼ （３） 化合物（Ｘ） （４） 下記基質（Ｂ）のオキシダーゼ 組成物Ｂ （１） 目的成分のオキシダーゼ又は目的成分を用いて
直接酸化できる基質（Ｂ）への変換に必要な基質及び／
又は酵素 （２） 色源体 以下本発明の態様を実施例によって説明する。
以下の実施例で用いられる血清は実質的に還元性物質
を含有しない血清を用いた。
を含有しない血清を用いた。
実施例1. クレアチンの定量 pH7.4の10mMリン酸塩緩衝液2.25ml中にフェノール20
μmole、パーオキシダーゼ10単位、ザルコシンオキシダ
ーゼ30単位を含有する溶液にＬ−ラクテートオキシダー
ゼ（LOD）４単位を添加した溶液及び添加しない溶液を
作製して、この各溶液に5mg/dlクレアチン溶液と精製水
の等量混合液、血清と精製水の等量混合液、血清とビリ
ルビンを第１表に示す濃度の溶液の等量混合液又は精製
水を試料として0.06ml添加し、37℃恒温槽内で３分間ほ
ど予備加温（ビリルビン分解反応）する。
μmole、パーオキシダーゼ10単位、ザルコシンオキシダ
ーゼ30単位を含有する溶液にＬ−ラクテートオキシダー
ゼ（LOD）４単位を添加した溶液及び添加しない溶液を
作製して、この各溶液に5mg/dlクレアチン溶液と精製水
の等量混合液、血清と精製水の等量混合液、血清とビリ
ルビンを第１表に示す濃度の溶液の等量混合液又は精製
水を試料として0.06ml添加し、37℃恒温槽内で３分間ほ
ど予備加温（ビリルビン分解反応）する。
次にそれぞれにpH8.0の50mM N,N−ビス（２−ヒドロ
キシエチル）グリシン緩衝液0.75ml中に4,4−ビス（ジ
メチルアミノ）ジフェニル−（2,7−ジヒドロオキシ−
１−ナフチル）メタン１μmole、クレアチンアミジノハ
イドロラーゼ100単位を含有する試薬液を加え、37℃恒
温槽内で10分間反応を行った後、分光光度計（日立製作
所:228型）にて波長633nmで精製水を対照として吸光度
を測定した。得られた結果を第１表に示す。
キシエチル）グリシン緩衝液0.75ml中に4,4−ビス（ジ
メチルアミノ）ジフェニル−（2,7−ジヒドロオキシ−
１−ナフチル）メタン１μmole、クレアチンアミジノハ
イドロラーゼ100単位を含有する試薬液を加え、37℃恒
温槽内で10分間反応を行った後、分光光度計（日立製作
所:228型）にて波長633nmで精製水を対照として吸光度
を測定した。得られた結果を第１表に示す。
実施例2. 実施例１において、ビリルビンの代わりにグルタチオ
ンを用いる他は、実施例１と同様に実施した。結果を第
２表に示す。
ンを用いる他は、実施例１と同様に実施した。結果を第
２表に示す。
実施例3. 尿酸の定量 pH6.5の25mMフタル酸水素カリ緩衝液1.5ml中にＮ−エ
チル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ′−サクシニル
エチレンジアミン2.7μmole、パーオキシダーゼ10単位
を含有する溶液に、コレステロールオキシダーゼ（CHO
D）10単位及びコレステロールエステラーゼ（CHER）５
単位を添加した溶液又は添加しない溶液を作製する。
チル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ′−サクシニル
エチレンジアミン2.7μmole、パーオキシダーゼ10単位
を含有する溶液に、コレステロールオキシダーゼ（CHO
D）10単位及びコレステロールエステラーゼ（CHER）５
単位を添加した溶液又は添加しない溶液を作製する。
この溶液に5mg/dl尿酸溶液と精製水の等量混合液、血
清と精製水の等量混合液、血清とビリルビン各濃度溶液
の等量混合液又は精製水を試料として0.08mlずつ添加
し、37℃恒温槽内で５分間予備加温（ビリルビン分解反
応）する。
清と精製水の等量混合液、血清とビリルビン各濃度溶液
の等量混合液又は精製水を試料として0.08mlずつ添加
し、37℃恒温槽内で５分間予備加温（ビリルビン分解反
応）する。
次にそれぞれにpH6.5の0.1Mリン酸塩緩衝液1.5ml中に
４−アミノアンチピリン１μmole、ウリカーゼ２単位を
含有する試薬液を加え、37℃恒温槽内で５分間ほど反応
を行った後、分光光度計（日立製作所:228型）にて波長
555nmで精製水を対照として吸光度を測定した。得られ
た結果を第３表に示す。
４−アミノアンチピリン１μmole、ウリカーゼ２単位を
含有する試薬液を加え、37℃恒温槽内で５分間ほど反応
を行った後、分光光度計（日立製作所:228型）にて波長
555nmで精製水を対照として吸光度を測定した。得られ
た結果を第３表に示す。
実施例4. ビリルビンの代わりにグルタチオンを用いる他は、実
施例３と同様に実施した。結果を第４表に示す。
施例３と同様に実施した。結果を第４表に示す。
実施例5. 乳酸の定量 pH7.5の60mMトリス緩衝液2.5ml中に４−アミノアンチ
ピリン3.6μmole、パーオキシダーゼ38単位、コリンオ
キシダーゼ７単位を含有する溶液に、オルソトルオイル
コリン（OTCC:コリンエステラーゼの基質）1.5μmoleを
添加した溶液及び添加しない溶液を作製する。これに、
40mg/dlのＬ−乳酸溶液と精製水の等量混合液、血清と
精製水の等量混合液、血清とビリルビン各濃度溶液の等
量混合液又は精製水を試料として0.04ml添加し、37℃恒
温槽内で５分間予備加温（ビリルビン分解反応）する。
ピリン3.6μmole、パーオキシダーゼ38単位、コリンオ
キシダーゼ７単位を含有する溶液に、オルソトルオイル
コリン（OTCC:コリンエステラーゼの基質）1.5μmoleを
添加した溶液及び添加しない溶液を作製する。これに、
40mg/dlのＬ−乳酸溶液と精製水の等量混合液、血清と
精製水の等量混合液、血清とビリルビン各濃度溶液の等
量混合液又は精製水を試料として0.04ml添加し、37℃恒
温槽内で５分間予備加温（ビリルビン分解反応）する。
次にそれぞれの中にpH7.5の60mMトリス緩衝液0.5ml中
にフェノール1.5μmole、ネオスチグミン（コリンエス
テラーゼ阻害剤）0.1mmole、Ｌ−ラクテートオキシダー
ゼ４単位を含有する試薬液を加え、37℃恒温槽内で５分
間ほど反応を行なう。しかる後分光光度計（日立製作
所:228型）にて波長500nmで精製水を対照として吸光度
を測定した。得られた結果を第５表に示す。
にフェノール1.5μmole、ネオスチグミン（コリンエス
テラーゼ阻害剤）0.1mmole、Ｌ−ラクテートオキシダー
ゼ４単位を含有する試薬液を加え、37℃恒温槽内で５分
間ほど反応を行なう。しかる後分光光度計（日立製作
所:228型）にて波長500nmで精製水を対照として吸光度
を測定した。得られた結果を第５表に示す。
実施例6. ビリルビンの代わりにグルタチオンを用いる他は、実
施例５と同様に実施した。結果を第６表に示す。
施例５と同様に実施した。結果を第６表に示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12Q 1/28
Claims (1)
- 【請求項１】試料中の定量すべき成分をレドックス反応
（２）を利用して定量する際の反応に係る成分以外の成
分（Ｙ）を用い、レドックス反応（１）を利用して試料
中の還元性物質の分解に充分な量の過酸化水素を生成さ
せ、試料中の還元性物質と該生成過酸化水素とをパーオ
キシダーゼの存在下に反応させ、要すればレドックス反
応（１）で用いた酵素を不活化させた後、パーオキシダ
ーゼの存在下過酸化水素と反応してラジカルに変換され
る化合物（Ｘ）と試料中に残存する過酸化水素とをパー
オキシダーゼの存在下に反応させ、ついで定量すべき成
分を用いレドックス反応（２）を行わせて過酸化水素を
生成させ、これをそれ自体公知の方法で定量することを
特徴とする試料中の成分の分析法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20267789 | 1989-08-04 | ||
| JP1-202677 | 1989-08-04 |
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Family Applications (1)
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| JP (1) | JP2922267B2 (ja) |
| DE (1) | DE69016870T2 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| WO1993012424A1 (en) * | 1991-12-13 | 1993-06-24 | Abbott Laboratories | Determination of tricyclic antidepressant drugs in the presence of interfering substances |
| US6030802A (en) * | 1998-05-29 | 2000-02-29 | Roche Diagnostics Corporation | Liquid reagent set for L-lactate determination |
| IT1392880B1 (it) * | 2008-11-20 | 2012-04-02 | Garofalo | Metodo e kit per la determinazione della concentrazione di perossidi in un liquido organico |
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|---|---|---|---|---|
| JPS5783287A (en) * | 1980-11-14 | 1982-05-25 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | Elimination of hydrogen peroxide |
| JPS5963198A (ja) * | 1982-10-01 | 1984-04-10 | Toyo Jozo Co Ltd | 酵素を用いる定量法 |
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| US4820416A (en) * | 1987-09-10 | 1989-04-11 | The Royal Institution For The Advancement For Learning (Mcgill University) | Removal of bilirubin by the pseudoperoxidase activity of immobilized hemoglobin |
| US4978632A (en) * | 1988-12-15 | 1990-12-18 | Kallestad Diagnostics, Inc. | Method of pre-treating samples in peroxidase-catalyzed enzyme assays |
| US4954451A (en) * | 1989-06-26 | 1990-09-04 | Miles Inc. | Agent for diminishing ascorbate interference in reagent systems and method relating thereto |
-
1990
- 1990-08-01 EP EP90114760A patent/EP0411604B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-08-01 DE DE69016870T patent/DE69016870T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-08-03 JP JP2206209A patent/JP2922267B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1990-08-03 US US07/562,592 patent/US5246836A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
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|---|---|
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| DE69016870D1 (de) | 1995-03-23 |
| EP0411604A2 (en) | 1991-02-06 |
| EP0411604A3 (en) | 1991-06-12 |
| JPH03164198A (ja) | 1991-07-16 |
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